Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 11
1.1. Дифференцировка и детерминация пола у человека 11
1.1.1. Уровни детерминации пола у человека 11
1.1.2. Формирование органов мужской репродуктивной системы 13
1.2. Сперматогенез. Особенности процесса у человека 15
1.2.1. Генетический контроль сперматогенеза 22
1.2.2. Современные подходы к анализу сперматогенеза при мужском бесплодии 27
1.3. Аномалии хромосом - фактор нарушения репродуктивной функции мужчин 35
1.3.1. Хромосомные аномалии, установленные при анализе соматических клеток 36
1.3.1.1. Структурные аномалии хромосом 37
1.3.1.2. Числовые аномалии хромосом (анеуплоидия хромосом) 43
1.3.1.3. Наследственные синдромы, вызванные анеуплоидией половых хромосом 44
1.3.1.4. Механизмы, лежащие в основе возникновения числовых аномалий хромосом 49
1.3.2. Аномалии хромосом, выявленные в половых клетках 53
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 60
П. 1. Объект исследования 60
П.2. Цитогенетический метод 60
П.2.1. Культивирование лимфоцитов периферической крови и приготовление препаратов метафазных хромосом 60
11.2.2. G-окрашивание хромосом 61
11.2.3. Принцип анализа хромосомных препаратов 61
II.3. Анализ половых клеток 61
П.3..1. Спермиологический анализ 61
II.3.2. Гистологический анализ препаратов биоптата яичка пациентов с бесплодием 62
П.З.З. Метод получения тотальных препаратов ядер половых клеток из эякулята 63
П.3.4. Количественный кариологический анализ состава незрелых половых клеток из эякулята по стадиям их развития 64
П.4. Молекулярно-цитогенетический метод 64
П.4.1. Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH)
на препаратах половых клеток эякулята с использованием проб, меченных различными флюорофорами 64
ГЛАВА III. Результаты собственных исследований и их обсуждение 68
III. 1. Формирование потока и групп пациентов мужского пола по основному клиническому диагнозу и результатам спермиологического анализа 68
Ш.2. Цитогенетический анализ лимфоцитов и количественный анализ состава незрелых половых клеток эякулята 68
III.2.1. «Контрольная» группа - фертильные доноры эякулята (лица с кариотипом 46,XY
и нормозооспермией) 68
Ш.2.2. Группа пациентов с диагнозом «нормозооспермия» по результатам спермиологического анализа и бесплодием 69
III.2.3. Группа пациентов с диагнозом «азооспермия» по результатам спермиологического анализа 71
Ш.2.4. Группа пациентов с диагнозом «олигозооспермия» по результатам спермиологического анализа 74
Ш.2.5. Группа пациентов с диагнозом «астенозооспермия» по результатам спермиологического анализа 78
Ш.2.6. Группа пациентов с диагнозом «тератозооспермия» по результатам спермиологического анализа 79
Ш.З. Сравнительный анализ данных гистологического исследования биоптатов яичка и результатов количественного кариологического анализа состава незрелых половых клеток эякулята (ККА НІЖ)
пациентов с нарушением сперматогенеза 118
III.4. Анализ частоты нерасхождения хромосом 1, X и Y с помощью FISH-анализа в половых клетках эякулята 123
Ш.4.1. Группа пациентов мужского пола с нормальным кариотипом (46,XY) 125
Ш.4.2. Группа пациентов с синдромом Клайнфельтера 127
ГЛАВА IV. Заключение 144
Выводы 149
Список литературы
- Сперматогенез. Особенности процесса у человека
- Культивирование лимфоцитов периферической крови и приготовление препаратов метафазных хромосом
- Цитогенетический анализ лимфоцитов и количественный анализ состава незрелых половых клеток эякулята
- Анализ частоты нерасхождения хромосом 1, X и Y с помощью FISH-анализа в половых клетках эякулята
Сперматогенез. Особенности процесса у человека
На стадии пахитены-диплотены происходит активизация транскрипции хромосом. Это необходимо для синтеза и запаса рибосом, РНК, белков, что обеспечивает рост и развитие формирующихся половых клеток, что особенно характерно для ооцитов, поскольку для них диплотена - самая длительная стадия развития, в которой они "блокируются" годами. В ходе сперматогенеза эта и последующая стадия диакинеза в сумме длятся 0,8 суток (Ченцов, 1995). Стадия диплотены некоторыми авторами рассматривается как критическая с точки зрения нарушения расхождения хромосом и возникновения хромосомных нарушений, таких как транслокации, делеции, инсерции и др., а также числовых хромосомных аномалий (анеуплоидии).
Стадия диакинеза - является переходной к собственно делению клетки, и характеризуется уменьшением числа хиазм, укорочением бивалентов. Затем проходят метафаза и анафаза первого деления мейоза; во время последней совершается важнейшее событие - расхождение хромосом. Но расходятся, в отличие от митоза, не сестринские хроматиды, а гомологичные хромосомы, состоящие каждая из двух сестринских хроматид. Если оценивать события этой фазы с генетической точки зрения, то в анафазе I мейоза по разным клеткам расходятся аллельные гены, располагающиеся в разных гомологах. Распределение же гомологов по клеткам совершенно случайное, так что хромосомы из разных пар "перемешиваются", происходит их перекомбинация. При этом в два раза уменьшается генетическая разнородность, поскольку в каждом хромосомном наборе нет аллельных генов, но редукция числа хромосом (хроматид) еще не произошла.
Далее происходит телофаза I деления, вслед за которой наступает второе редукционное деление мейоза, по морфологии не отличающееся от митотического деления.
В результате процесса мейоза из одной диплоидной клетки образуются четыре гаплоидных, отличающихся друг от друга по своему генетическому содержанию. Таким образом, мейоз обеспечивает редукцию в гаметах числа хромосом, компенсирующуюся удвоением их набора при оплодотворении.
Кроме того, половые клетки при прохождении стадий мейоза подвергаются своего рода селективному отбору, так как "выходят" из мейоза главным образом генетически и структурно полноценные клетки, в то время как определенное их количество элиминируется по разным причинам (в том числе и генетическим).
Одной из причин гибели клеток является дисбаланс состава хромосом, наличие хромосомных мутаций, устранить которые не в состоянии активно функционирующая на стадии пахитены репаративная система клетки. Такое "биологическое сито" является защитной природной системой, работа которой направлена на сохранение вида. Вместе с тем, мейоз обеспечивает различия по набору локусов между одинаковыми хромосомами в разных половых клетках одного индивида, что обеспечивает биологическое разнообразие.
Итак, завершив второе деление, сперматоциты дают начало генерации гаплоидных клеток - сперматид. Сперматиды - округлые клетки, меньшие по размеру в сравнении со сперматоцитами (средний диаметр клетки - 8-8,5 мкм) (Райцина, 1985).
Для сперматогенеза млекопитающих животных и человека характерна строгая временная и пространственная организация процесса. Вследствие этого можно точно установить местонахождение половой клетки той или иной стадии дифференцировки, что позволяет осуществить точную морфологическую идентификацию практически любой клетки, участвующей в сперматогенезе. На этом основано установление цикла сперматогенного эпителия, характеризующегося определенным сочетанием клеток разных стадий развития. В цикле сперматогенного эпителия человека выделено шесть стадий, а продолжительность самого цикла составляет 16 дней (Райцина, 1985).
Заключительный этап сперматогенеза - спермиогенез. Этот процесс характеризуется мощными перестройками в составе клеточных органелл: затрагиваются все клеточные органеллы, формируются новые структуры. Так из лизосомы образуется акросома, сложные изменения претерпевают митохондрии клетки, из дистальной центриоли формируется жгутик, происходит компактизация хроматина, то есть образуется совершенно непохожая на предшественников по структуре и функциям клетка - сперматозоид, все органеллы которой видоизменены таким образом, чтобы обеспечить процессы движения его к яйцеклетке и ее оплодотворение. В среднем головка сперматозоида человека имеет длину 5-7 мкм и ширину-2,5-3,5 мкм. Большую часть объема головки занимает хроматин. В зрелом сперматозоиде хроматин неактивен и сильно конденсирован. Верхнюю часть головки занимает акросома трансформированная из лизосомы клеточная структура. Акросома содержит гидролитические ферменты (гиалуронидаза, протеазы), обеспечивающие проникновение сперматозоида через оболочки яйцеклетки. Эти ферменты активизируются в процессе акросомной реакции - структурных изменений акросомы при контакте сперматозоида с оболочками яйцеклетки. В сперматологии описаны и встречаются в андрологической практике случаи нарушения формирования акросомы вплоть до ее отсутствия у подавляющего числа сперматозоидов эякулята, так называемая глобулозооспермия (синдром округлых головок). Это приводит к мужскому бесплодию (Брагина и соавт., 1997; Братина, 2001).
Хвост сперматозоида достигает длины 60 мкм. В нем различают: шейку, среднюю часть, главную и концевую. Электронномикроскопическое исследование поперечных срезов позволило определить разное строение разных отделов хвоста сперматозоида (Брагина и соавт., 1997; 2000).
Центральным стержнем хвоста является аксонема (осевая нить). Она построена из двух центральных микротрубочек (центральный дуплет) , девяти сдвоенных микротрубочек (периферические дуплеты), окружающих центральные и девяти более наружно расположенных дополнительных плотных фибрилл. Периферические дуплеты между собой соединены специальными структурами -динеиновыми ручками (наружными и внутренними). Существует наследственное заболевание - синдром Картагенера, одним из признаков которого является неподвижность ресничек дыхательного эпителия и/или хвостов сперматозоидов вследствие отсутствия динеиновых ручек. Естественно, нарушение (отсутствие) подвижности сперматозоидов приводит к мужскому бесплодию. В нижней части шейки сперматозоида локализована центриоль. В последние годы доказано, что именно центриоль от мужской гаметы обеспечивает возможность дробления оплодотворенной яйцеклетки.
В среднем отделе сперматозоида на протяжении 5-7 мкм своеобразным чехлом локализованы компактно по окружности митохондрии, снабжающие клетку энергией, обеспечивающей ее двигательную активность. Нарушение метаболизма митохондрий может привести к нарушению подвижности сперматозоидов.
Культивирование лимфоцитов периферической крови и приготовление препаратов метафазных хромосом
Структурные ХА, чаще всего представленные робертсоновскими транслокациями, выявлены в 0-10.7% ПК. Числовые ХА (как правило, дисомия хромосом 13 или 21) установлены в 2.5-15.4% гамет (Martin, 1987; Pellestor, 1991; Rousseaux et al., 1995). По результатам исследований риск рождения детей, имеющих в кариотипе трисомию хромосом для этой категории мужчин составляет 0-10%.
Носители реципрокных транслокаций хромосом других групп имеют более высокую степень вероятности продукции несбалансированных гамет по сравнению с таковой у мужчин с робертсоновскии транс локациями. Доля сперматозоидов со структурными ХА у мужчин с реципрокными транслокациями находится в пределах от 0 до 21.7%, а с числовыми ХА - от 0 до 69.6% (Martin 1983,1987; Spriggs et al., 1995; Benkhalifa et al., 1994). Таким образом, частота ХА в половых клетках мужчин - носителей реципрокных транслокаций существенно выше таковой по сравнению с группой доноров спермы. Эти данные указывают на то, что аномалии хромосом в большинстве случаев наследуются в ряду поколений и часто являются причиной нарушения процессов конъюгации и сегрегации хромосом половых клеток, что, в свою очередь приводит к нарушению репродуктивной функции мужчин. Однако, средние значения частоты ХА в половых клетках в группе носителей транслокаций и среди доноров эякулята сопоставимы. Вероятно, такая ситуация указывает на гибель большей части гамет, имеющих ХА. Этим, возможно, объясняется возможность рождения потомства с нормальнам кариотипом у индивидуумов со структурными аномалиями хромосом.
Аномалии хромосом в половых клетках мужчин - носителей числовых ХА, выявленные при цитогенетическом анализе лимфоцитов периферической крови.
Исследователи едины во мнении, что частота дисомии хромосом в половых клетках существенно выше, чем случаи трисомии хромосом в соматических клетках. Этот вывод подтверждает факт элиминации подавляющего большинства гамет с ХА, предимплантационную селекцию и гибель большей доли эмбрионов, имеющих аномальный кариотип.
Показано, что частота анеуплоидии в ооцитах человека, полученных с помощью гормональной стимуляции овуляции для проведения процедуры экстракорпорального оплодотворения, составляет 30% (Selva, 1991). Но ооциты труднодоступны для изучения. Поэтому большая часть работ, посвященных исследованию частоты числовых аномалий хромосом, проведена на сперматозоидах. К настоящему времени определен уровень анеуплоидии для всех хромосом и показано, что некоторые из них наиболее часто вовлекаются в процесс нерасхождения. К таковым относятся хромосомы группы А, акроцентрические и половые хромосомы. Так частота дисомии хромосомы 1 в ПК является по результатам некоторых исследований самой высокой по сравнению с частотой дисомии других хромосом и составляет 0.41-2.00% (Geraedts, Pearson 1973; Coonen et al., 1991; Guttenbach et al.,1994). Причины этого остаются невыясненными. По одной из версий высокая частота дисомии хромосомы 1 по сравнению с другими аутосомами объясняется большим размером хромосомы, что, возможно, влияет на прохождение конъюгации, кроссинговера, и, как следствие, приводит к нерасхождению пары хромосом 1. Согласно другому предположению повышенный уровень нерасхождения хромосомы 1 (группа А) обусловлен наличием большого гетерохроматинового блока на q-плече. (Guttenbach et al., 1994). Примечателен факт, что нерасхождение пары хромосом 1 обнаружили только при исследовании половых клеток. Возникновение анеуплоидии по этой хромосоме приводит к гибели зародыша на самых ранних стадиях эмбриогенеза (стадия морулы). Таким образом, обнаружить данную ХА в соматических клетках (в том числе и на материале спонтанных абортусов) практически невозможно. Лишь Watt с коллегами удалось зафиксировать трисомию хромосомы 1 у зародыша человека на 8-ми клеточной стадии развития (Watt etal., 1987).
С появлением возможности изучения хромосом в половых клетках внимание ученых привлек вопрос о взаимосвязи нарушений сперматогенеза и количественного дисбаланса хромосом в половых клетках. С этой точки зрения особый научный интерес представляет поведение половых хромосом в ходе мейоза. Miharu в своем исследовании сравнил уровни дисомии хромосом 1, 16, X, Y в половых клетках фертильных доноров эякулята и мужчин с бесплодием. У последних уровень дисомии вышеперечисленных хромосом оказался незначительно выше: 0.34-0.84% у мужчин с бесплодием; 0.32-0.61% у доноров спермы (Miharu et al., 1994). Guttenbach также не выявлены различия в уровне нерасхождения хромосом в половых клетках лиц с нормозооспермией и инфертильных мужчин (Guttenbach et al., 1997). Таким образом, одни исследователи не обнаруживают существенных различий в количестве сперматозоидов, имеющих ХА в вышеперечисленных группах мужчин. Другие выявляют повышенный уровень ХА в сперматозоидах мужчин с нарушением репродуктивной функции по сравнению с популяционными данными (Pang et al., 1995; In t Veld et al., 1997; Egozcue et al., 1997). Анализ ядер сперматозоидов с помощью FISH у мужчин с субфертильностью (у большей части пациентов диагностирована олигоастенотератозооспермия (ОАТ)) демонстрирует вариабельность сегрегации хромосом в ходе мейоза. В работах Pang (1995) и In t Veld (1997) выявлена повышенная частота дисомии половых хромосом и аутосом среди пациентов с ОАТ. Любопытны данные, полученные Moosani (1995), изучавшим аномалии хромосом в сперматозоидах мужчин с идиопатическим бесплодием. Согласно результатам этого исследования в данной группе мужчин установлен более высокий уровень числовых и структурных аномалий хромосом, дисомии хромосомы 1 и половых хромосом, увеличение количества гипергаплоидных сперматозоидов с кариотипом 24,XY (то есть сперматозоидов, в которых имело место нерасхождение гоносом в первом делении мейоза).
Большинство мужчин с проблемами деторождения прибегают к услугам репродуктивных технологий. Поскольку частота сперматозоидов с той или иной формой нарушения в системе хромосом повышена среди мужчин с олигозооспермией, необструктивной азооспермией, то существует возможность наследственной передачи хромосомной аномалии через преодоление естественного барьера зачатия при использовании репродуктивных технологий. Из 1210 мужчин, имеющих отклонения в спермограмме, у 3,6% выявлены ХА (Pandiyan et al., 1996). Из 261 супружеской пары, проходившей курс ICSI (интрацитоплазматическая инъекция сперматозода (или сперматиды поздних этапов спермиогенеза) в яйцеклетку), у 4,2% мужчин и 1,2% женщин обнаружены аномалии хромосом: у 3% мужчин и 0,7% женщин выявлены хромосомные транслокации, у 0,7% индивидов мужского и 0,4% женского пола - инверсии хромосом. Среди восьми плодов от супружеских пар с ХА пятеро унаследовали цитогенетические дефекты от родителей: трое - от отца, а двое - от матери. В беременностях, имеющих место в парах с нормальным кариотипом, у плодов ХА не выявлены (Bergere et al., 1995). В связи с этим проведены ряд исследований, целью которых явилось установление уровня ХА у детей, зачатых с помощью методов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) или интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в яйцеклетку (ICSI). В большей части таких работ выявлено увеличение частоты ХА у детей, зачатых с помощью методов репродуктивных технологий (Egozcue et al., 1997; In t Veld et al.,1997). Причем основная доля хромосомных аномалий после ICSI, как отмечено в обзоре Egozcue (1997), возникает в системе половых хромосом. Авторы рекомендуют проведение цитогенетического анализа для мужчин с тяжелыми формами олигозооспермии до проведения ICSI; генетическое консультирование в случае необходимости должно включать последующую пренатальную диагностику. Это актуально и при криоконсервации гамет с последующей их донацией. Совершенствование схем медико-генетического консультирования, генетического обследования пациентов с нарушениями репродуктивной функции, применение разносторонних методов исследования является важной задачей в условиях широкого применения репродуктивных технологий.
Числовые аномалии хромосом, выявленные в половых клетках мужчин-носителей числовых ХА, выявленных при цитогенетическом анализе лимфоцитов
Изучение мейотической сегрегации хромосом в половых клетках индивидуумов, у которых выявлены числовые ХА в соматических клетках, перспективно с точки зрения установления этиологии анеуплоидий. Основное число исследований по этой проблеме проведено на половых клетках лиц с синдромами Клайнфельтера, включая пациентов с мозаичными формами синдрома. В этих работах установлена повышенная частота нерасхождения гоносом в половых клетках лиц с синдромом Клайнфельтера по сравнению с таковой в общей популяции и в группе мужчин со структурными аномалиями хромосом (Курило и соавт., 1998). По данным Guttenbach доля половых клеток, имеющих дисомию гоносом, составляет 2,67%; причем в большей части клеток (1,36%) нерасхождение имело место в первом мейотическом делении (Guttenbach, Michelmann, 1997). В исследовании Cozzi также обнаружено увеличение количества клеток, в которых нерасхождение половых хромосом произошло в первом делении мейоза (Cozzi et al., 1994).
Теоретически, повышение уровня гипергаплоидных гамет у пациентов с числовыми ХА должно привести к увеличению доли гамет, имеющих нуллисомию гоносом. Вопреки ожидаемому, на фоне повышения уровня нерасхождения половых хромосом у 47,ХХУ-мужчин, гамет, нуллисомньгх по гоносомам, в данной группе пациентов обнаружено не было (Cozzi et al., 1994). Вероятно, половые клетки, лишенные половых хромосом, не способны к развитию и подвергаются атрезии. Считалось, что у пациентов с кариотипом 46,XY/47,XXY только ПК, имеющие нормальный кариотип (46,XY), вступают в мейоз (Kjessler et al., 1966). Позже в ряде работ была доказана способность 47,ХХУ-сперматоцитов инициировать мейоз (Skakkeback et al., 1973). Затем Cozzi с коллегами установил, что такие клетки могут проходить все стадии мейоза, завершая сперматогенез формированием сперматозоидов (Cozzi et al., 1994). Это подтверждается недавним сообщением о рождении трех здоровых и имеющих нормальный кариотип детей у мужчины с синдромом Клайнфельтера, при применении техники ICSI с использованием тестикулярных сперматид (Palermo et al., 1998). Нормальный кариотип детей свидетельствует о продукции гаплоидных гамет у данного пациента. По мнению исследователей, такая ситуация возможна в двух случаях: 1) при наличии гонадного мозаицизма у мужчины; 2) при способности 47,ХХУ-клеток участвовать в мейозе с формированием гаплоидных сперматид и сперматозоидов. Некоторые исследователи предполагают, что присутствие 46,ХУ-клеток является обязательным условием, обеспечивающим возможность участия в мейозе 47,ХХУ-клеток. В пользу этого предположения говорят данные, согласно которым наличие клеток с нормальным кариотипом снижает тяжесть клинических проявлений, касающихся нарушений сперматогенеза, при мозаичной форме синдрома Клайнфельтера (Bandmann et al., 1984).
Цитогенетический анализ лимфоцитов и количественный анализ состава незрелых половых клеток эякулята
В группе пациентов с астенозооспермией аномалии хромосом выявлены в двух случаях. Таким образом, доля носителей хромосомных аномалий в данной группе пациентов составляет 2.9%. Эти структурные аберрациия представлены транслокацией хромосом 4 и 19 и делецией хромосомы Y (мед. карты №№ 091, 5018; табл. 4, 5). Транслокация хромосом 4 и 19 не описана в работах, посвященных изучению сперматогенеза. Таким образом, вопрос об инициации нарушений репродуктивной функции мужчин упомянутой хромосомной аберрацией не выяснен. У остальных пациенов этой группы (97,1%) установлен нормальный мужской кариотип (46,XY). в) Результаты количественного кариологического анализа состава НПК эякулята (ККА НПК) Данные ККА НПК эякулята пациентов с астенозооспермией соответствуют таковым лиц контрольной группы (табл. 5). В общем случае накопления половых клеток на какой-либо стадии сперматогенеза не выявлено, следовательно, не обнаружено торможения или блока мейоза. Высокая доля сперматид указывает на способность большинства сперматогониев пройти все стадии сперматогенеза вплоть до спермиогенеза. Некоторое увеличение количества неидентифицируемых клеток отражает легкую степень интенсивности процессов слущивания неполноценных гамет и дегенеративных клеток, практически соответствующее норме (рис. 7).
Как известно, движение сперматозоида обусловлено перемещением микротрубочек жгутика с помощью так называемых динеиновых ручек - особой конформации белка - тубулина. Очевидно, повреждения именно этой структуры вызывают изменения подвижности сперматозоидов. Не исключено, что нарушения подвижности гамет у определенной части лиц с астенозооспермией вызваны генными мутациями, например, мутацией гена, ответственного за синтез тубулина. Детекция подобных мутаций, представляющая в принципе задачу осуществимую, на данный момент не является частью практической деятельности специалистов генетиков-андрологов.
С другой стороны, на подвижность гамет, особенно в случаях астенозооспермии, сопровождающихся изменением морфологии сперматозоидов, могло повлиять тератогенное воздействие эндо- и/или экзогенных факторов (табакокурение, алкогольная интосикация, повреждающее воздействие токсичных веществ, радиации, производственные вредности, инфекционные заболевания и т.д.). Установление причин нарушения подвижности половых клеток в большинстве случаев требует разработки, усовершенствования и внедрения в практику исследователей методов молекулярной генетики и методик тестирования повреждающего действия токсичных агентов.
Эту группу составляют 12 мужчин, обратившихся в лабораторию генетики нарушений репродукции МГНЦ РАМН по поводу бесплодия. а) Результаты спермиологического анализа Согласно руководству ВОЗ (WHO, 1992, 1999), тератозооспермия определяется в том случае, когда содержание морфологически нормальных сперматозоидов составляет менее 30% при нормальном количестве гамет в 1 мл эякулята. У всех обследованных нами пациентов результаты спермиологического анализа соответствовали этим параметрам. б) Результаты цитогенетического анализа лимфоцитов периферической крови У всех 12-ти пациентов 6-ой группы установлен кариотип 46,XY. Аномалий хромосом не обнаружено. в) Результаты количественного кариологического анализа состава НПК эякулята (ККА НПК) У пациентов с тератозооспермиеи соотношение НПК в эякуляте аналогично таковому, определенному для пациентов контрольной группы (табл.5). Это указывает на отсутствие торможения или блока сперматогенеза на какой-либо из стадий. Доля сперматоцитов II порядка и сперматид, составляющая в среднем приблизительно 90%, свидетельствует о беспрепятственном прохождении сперматогенеза подавляющим большинством сперматогониев. В отдельных случаях при ККА НПК отмечено увеличение относительного количества неидентифицируемых половых клеток (мед. карты №№ 058,089,1625, табл. 5). Возможно, такая картина отражает процессы массовой гибели морфологически неполноценных гамет. Вероятно, нарушение морфологии сперматозоидов у лиц с тератозооспермиеи вызвано повреждающим действием-эндо- и экзогенных факторов. По всей видимости, снижение оплодотворяющей способности атипичных сперматозоидов является причиной бесплодия, зачастую сопровождающего диагноз "тератозооспермия".
В этом исследовании была использована схема последовательности комплексного обследования пациентов с мужским бесплодием и нарушением сперматогенеза, разработанная в лаборатории генетики нарушений репродукции МГНЦ РАМН (Курило с соавт., 1997, 2001). Одной из исследовательских задач нашей работы являлось определение частоты и типа хромосомной аномалии у мужчин с бесплодием.
Многие авторы подчеркивают, что среди мужчин с бесплодием и нарушением сперматогенеза преобладают числовые ХА (Johnson et al., 1998; Guttenbach et al., 1997; Diemer et al., 1999). В нашем исследовании числовые аномалии хромосом (синдром Клайнфельтера) диагностированы у 30-ти из 456 пациентов, что составляет около 6.6% пациентов с нарушением репродуктивной функции. Наличие дополнительной хромосомы X в кариотипе совместимо с развитием и жизнедеятеьностью индивидуума, но является причиной некоторых соматических нарушений (например, сперматогенеза). В этом случае анеуплоидия гоносом, по-видимому, ведет к нарушению сегрегации половых хромосом, вследствие чего возникает блок мейоза на стадии зиготены-пахитены. Такое нарушение сперматогенеза, как правило, приводит к азооспермии.
Несколько реже встречаются структурные ХА. В нашем исследовании они выявлены у 18 из 456 мужчин, что составляет 3.9% от общего количества пациентов, имеющих нарушения репродуктивной функции. Ряд исследователей отмечают, что наиболее частыми из структурных аномалий хромосом являются транслокации. Это подтверждается и в данной работе. Из 18-ти человек, имеющих структурные ХА, транслокации обнаружены у 12-ти пациентов, то есть 66.7% от всех носителей структурных аномалий хромосом. Причем из этих 12-ти случаев 7 являются робертсоновскими транслокациями (58.3% от числа носителей транслокаций). В некоторых работах, посвященных изучению влияния ХА на сперматогенез, робертсоновские транслокации выделены в особую группу (Guttenbach et al., 1997). Авторы подчеркивают, что пациенты, имеющие в кариотипе транслокацию акроцентрических хромосом, составляют "группу риска" в отношении возникновения нарушений репродуктивной функции. У всех 7-ми носителей робертсоновской транслокации нами обнаружено то или иное нарушение сперматогенеза (табл. 4, 5). Таким образом, очевидно, что выявленные нами структурные хромосомопатии, среди которых делеция хромосомы Y, транслокации различных хромосом, нелетальны. Однако, при наступлении половозрелости ХА отражаются на репродуктивной функции и часто являются причиной бесплодия, то есть демонстрируют свое действие в ряду поколений, проявляясь либо незначительными нарушениями репродуктивной функции, либо приводя к азооспермии и бесплодию. Эффективным методом лечения бесплодия в данной ситуации являются методы репродуктивных технологий. Многими исследователями подчеркивается необходимость кариотипирования гамет перед применением ЭКО и ИКСИ с целью снижения риска передачи наследственной патологии потомству.
Анализ частоты нерасхождения хромосом 1, X и Y с помощью FISH-анализа в половых клетках эякулята
Проведение биопсии несет для пациента определенный риск развития посттравматического иммуноорхита и имеет ограничения по показаниям (только для пациентов с азооспермией и олигозооспермией тяжелой степени), поэтому для большинства лиц с мужским бесплодием выяснение степени и стадий нарушения сперматогенеза оказывается невозможным.
В нашем исследовании гистологическое исследование биоптата яичка было проведено для 40 лиц мужского пола (36-ти пациентов с азооспермией и 4-х - с олигозооспермией тяжелой степени). С помощью данного метода исследования состояния генеративной функции яичек для всех обследованных пациентов подтверждена причина патологии сперматогенеза, ранее установленная при ККА НПК эякулята, полученного до проведения биопсии. У 10-ти пациентов с тяжелым поражением сперматогенеза на гистопрепаратах биоптата яичка выявлены семенные канальцы, содержащие только клетки Сертоли, утолщение мембраны извитых семенных канальцев (ИСК) и их гиалинизация (синдром клеток Сертоли). При ККА НПК эякулята этих пациентов обнаружено малое количество дегенерирующих НПК, клетки эпителия, лейкоциты, в редких случаях - единичные аномальные сперматозоиды. У остальных пациентов (30 человек) при анализе гистопрепаратов биоптата яичка обнаружены семенные канальцы, содержащие НПК. Большая часть этих половых клеток в составе каждого из канальцев представлена сперматоцитами на определенной стадии их развития (чаще - на стадии зиготены-пахитены профазы I мейоза). "Накопление" НПК определенной стадии мейоза, отсутствие половых клеток последующих стадий развития, "массовое" слущивание незрелых гамет (в большинстве случаев "пахитенных" сперматоцитов) в просвет ИСК указывает на существование блока сперматогенеза.
Гистологический анализ материала биопсии яичек 40 пациентов с бесплодием показал, что нарушение сперматогенеза при азооспермии и олигозооспермии тяжелой степени сопровождается 2-мя основными типами нарушения гистоструктуры яичек. При первом из них отмечается утолщение мембраны извитых семенных канальцев (ИСК), отсутствие половых клеток и наличие клеток Сертоли в составе ИСК (синдром клеток Сертоли).
Например, пациент А. (мед. карта № 304) обратился в лабораторию генетики нарушений репродукции МГНЦ РАМН по поводу первичного бесплодия. Пациенту было проведено комплексное клинико-андрологическое обследование. По результатам спермиологического анализа у этого пациента диагностирована азооспермия. По данным цитогенетического исследования кариотип пациента 46,XY (нормальный мужской). При ККА НПК эякулята обнаружены дегенерирующие и неидентифицируемые НПК (табл. 5). На гистопрепарате биоптата яичка наличие половых клеток не отмечено, обнаружены лишь клетки Сертоли (рис. 8 а, б). Возможно, в семенных канальцах, попавших в материал биоптата, НПК отсутствуют, а половые клетки, выявленные при ККА НПК, были локализованы в других семенных канальцах. Данные о наличии клеток сперматогенного эпителия при данной форме нарушения сперматогенеза, полученные с помощью ККА НПК, являются принципиально важными, т.к. делают целесообразным применение гормональной стимуляции сперматогенеза и методов репродуктивных технологий в целях преодоления бесплодия. Кроме того, эти сведения на фоне заключения об отсутствии половых клеток, сделанном при гистологическом исследовании препаратов биоптата яичка, являются доказательством информативности ККА НПК и позвляют использовать его как метод, альтернативный биопсии яичка для целей оценки состояния сперматогенеза.
Пациент Б. (мед. карта № 186) поступил в лабораторию генетики нарушений репродукции МГНЦ РАМН с диагнозом "первичное бесплодие". При цитогенетическом исследовании лимфоцитов периферической крови установлен кариотип 46,XY (норма для мужчин). По данным спермиологического анализа у пациента диагностирована азооспермия. При проведении ККА НПК эякулята на фоне большого количества дегенерирующих незрелых половых клеток обнаружено некоторое количество сперматоцитов второго порядка и единичные сперматоциты на стадии диплотены (табл. 5). При анализе гистопрепарата биоптата яичка половых клеток (в том числе и НПК) не обнаружено. Выявлено утолщение мембраны семенных канальцев, включающих только клетки Сертоли (рис. 9).
Другой тип нарушения гистоструктуры яичек, выделенный нами при анализе биоптатов яичек лиц с азооспермией и олигозооспермией тяжелой степени, характеризуется блоком сперматогенеза на определенной стадии дифференцировки половых клеток (чаще на стадии зиготены-пахитены профазы I мейоза). При этом, как правило, отмечают атрофию клеток Лейдига.
Пациент В. (мед. карта № 839) - бесплодие I, азооспермия, кариотип нормальный мужской (46,XY). При ККА НПК из эякулята определен частичный блок сперматогенеза на стадии зиготены (табл. 5). Выявлены единичные аномальные сперматозоиды. Анализ гистопрепаратов биоптата яичка показал наличие половых клеток всех стадий развития до сперматид в некоторых ИСК и атрофические изменения в клетках Лейдига. В малой части ИСК были обнаружены единичные сперматозоиды. Однако количественное соотношение ПК (преобладание клеток стадии зиготены-пахитены и резкое снижение числа "диплотенных" сперматоцитов и ПК последующих стадий развития) указывает на существование блока гаметогенеза на стадии зиготены-пахитены (рис. 10, 11). Таким образом, заключение по ККА НПК из эякулята полностью подтверждается результатами гистологического исследования препаратов биоптата яичка пациента В.
Пациент Г. (мед. карта № 847) поступил в МГНЦ РАМН с диагнозом бесплодие I. При спермиологическом анализе у пациента выявлена азооспермия (табл. 5). При цитогенетическом обследовании установлен кариотип 46,XY (нормальный мужской). Гистологический анализ препаратов биоптата яичка данного пациента показал наличие блока сперматогенеза на стадии зиготены-пахитены профазы I мейоза, сопровождающегося увеличением количества дегенерирующих НПК (рис. 12, 13). Результаты ККА НПК эякулята также указывают на блокирование гаметогенеза на стадии зиготены. Высокое количество неидентифицируемых клеток сперматогенного эпителия, определенное при ККА НПК, свидетельствует о массовой дегенерации НПК (табл. 5). Таким образом, результаты ККА НПК подтверждаются данными гистологического исследования, что позволяет рассматривать ККА НПК эякулята как метод, альтернативный гистологическому анализу биоптата яичка для целей оценки состояния сперматогенеза.
