Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. История изучения синдрома 20
1.2. Формирование фенотипических признаков СД22q11.2 в эмбриогенезе 22
1.3. Механизм возникновения делеции 22q11.2 24
1.4. Характеристика типично делетируемого региона 22q11.2 27
1.5. Фенотипические признаки СД22q11.2 и другие делеции, приводящие к схожему фенотипу 30
1.6. Методы диагностики микроделеции 22q11.2 33
1.7.1. Особенности пренатальной диагностики микроделеции 22q11.2 35
1.7.2. Постнатальная диагностика СД22q11.2 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы 46
2.1. Формирование и методы исследования пренатальной группы пациентов 46
2.2. Формирование постнатальной группы пациентов 47
2.3. Методы исследования постнатальной группы пациентов 50
2.3.1. Цитогенетическое исследование 50
2.3.2. Молекулярно-цитогенетическое исследование 50
2.3.3. Мультиплексная лигазная полимеразная цепная реакция (MLPA) 50
2.3.4. Секвенирование гена TBX1 51
2.3.5. Статистические методы обработки полученных данных 51
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 54
3.1. Результаты исследования пренатальной группы 54
3.2. Результаты исследования постнатальной группы 62
3.2.1. Результаты диагностики делеции 22q11.2 FISH-методом 62
3.2.2. Анализ фенотипических данных пациентов 67
3.2.3. Результаты исследования делеции 22q11.2 методом MLPA 76
3.2.4. Результаты секвенирования гена TBX1 82
Заключение 86
Выводы 93
Применение результатов и научных выводов 94
Список условных сокращений 96
Список работ, опубликованных автором по теме диссертации 98
Список литературы
- Формирование фенотипических признаков СД22q11.2 в эмбриогенезе
- Особенности пренатальной диагностики микроделеции 22q11.2
- Цитогенетическое исследование
- Результаты исследования делеции 22q11.2 методом MLPA
Введение к работе
Хромосомные болезни занимают одно из ведущих мест в структуре врожденной и наследственной патологии человека. Спектр хромосомных аномалий (ХА), являющихся причиной наследственных синдромов, широк и представлен не только числовыми аберрациями, но и разнообразными структурными нарушениями хромосом, сопровождающимися дупликациями или делециями генетического материала. Классический цитогенетический анализ (G-band using Trypsin-Giemsa, GTG-метод) позволяет выявить все числовые ХА и те из структурных ХА, величина которых превышает 10 миллионов пар оснований. Значительная часть ХА представлена более мелкими аберрациями (микроделециями и микродупликациями), которые не могут быть выявлены при стандартном цитогенетическом анализе и требуют для диагностики использования современных молекулярно-цитогенетических или молекулярных методов исследования (Shaw C.J., 2004; Lupski J.R., 2009).
Частота микроделеционных синдромов среди новорожденных достаточно высока (от 1:4000 до 1:30000). Многие известные на сегодняшний день синдромы (Ди Джорджи, Прадера-Вилли, Ангельмана, Смит-Магенис, «кошачьего крика», Миллера-Дикера, Вольфа-Хиршхорна, Вильямса) описаны задолго до того, как была установлена их этиология на молекулярном уровне.
Группа синдромов, обусловленных делецией 22q11.2, обозначаемая далее как синдром делеции 22q11.2 (СД22q11.2), включает в себя несколько синдромов с различными названиями и во многом перекрещивающимися клиническими признаками. Основными синдромами этой группы являются: вело-кардио-фациальный синдром, синдром конотрункальных и лицевых аномалий и синдром Ди Джорджи. В настоящее время СД22q11.2 считается самым распространенным микроделеционным синдромом в популяции человека. Он встречается с частотой 1 на 4000 новорожденных и обозначается в зарубежной литературе как 22q11.2DS (22q11.2 Deletion Syndrome) (Goodship J. et al., 1998; Devriendt K. et al., 1998). Величина делеции 22q11.2, как правило, не превышает 3 миллионов пар оснований (м.п.о.), что не позволяет определять ее при стандартном кариотипировании, а требует использования молекулярных методов, в частности флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) или мультиплексной лигазной полимеразной цепной реакции (MLPA) (Gong W. et al., 1996).
Для пациентов с СД22q11.2 наиболее характерны лицевые дизморфии, врожденные пороки сердца (ВПС) и магистральных сосудов, аномалии развития твердого и мягкого неба, патология мочевыделительной системы, снижение иммунитета, патология центральной нервной системы, психиатрические заболевания и умственная отсталость (McDonald-McGinn D. et al., 1997a; Sullivan K. et al., 1998). Выраженный клинический полиморфизм фенотипических проявлений также характерен для синдромов этой группы. Широкий спектр основных симптомов, формирующих группу СД22q11.2, свидетельствует о сложности клинической
дифференциальной диагностики этих заболеваний и о необходимости анализа комплекса клинических признаков у пациентов с синдромом на репрезентативной выборке.
В настоящее время пренатальная диагностика (ПД) микроделеционных синдромов не имеет широкого распространения из-за сложности выявления группы риска среди беременных и специфики материала, полученного в ходе инвазивного вмешательства (Bretelle F. et al., 2010).
Разработка оптимального комплекса методических приемов с использованием современных молекулярных технологий в ранней (в том числе пренатальной) диагностике СД22q11.2 актуальна как с научной, так и с практической точек зрения (Driscoll D. et al., 1993; Mosca-Boidron A. . et al. 2012).
Не менее актуально определение критериев отбора для формирования среди пациентов с подозрением на СД22q11.2, в т.ч. среди беременных женщин, группы риска для проведения комплекса лабораторных методов диагностики СД22q11.2.
Цель исследования:
Целью работы является разработка подходов к пре- и постнатальной диагностике синдромов, обусловленных микроделецией 22q11.2, и оценка эффективности методов их лабораторной диагностики.
Задачи исследования:
-
Провести поиск эхографических маркеров СД22q11.2 у плода, сформировать группу риска среди беременных, провести ПД синдрома методом FISH и оценить диагностическую эффективность предлагаемых маркеров.
-
Определить клинические критерии для формирования группы пациентов с подозрением на СД22q11.2, на их основании создать карту-анкету и сформировать выборку для лабораторного обследования пациентов в постнатальном периоде.
-
Определить долю пациентов с микроделецией 22q11.2, выявленных молекулярно-цитогенетическим методом, среди пациентов постнатальной группы.
-
Провести сравнительный анализ фенотипических проявлений СД22q11.2 в подгруппах пациентов с подтвержденной делецией 22q11.2 и без нее.
-
Провести исследование ДНК пациентов постнатальной группы методом MLPA, определить размер делеции, провести поиск других делеций, формирующих у пациентов сходные с СД22q11.2 фенотипические признаки.
-
Провести сравнительную оценку эффективности выявления микроделеции 22q11.2 методами FISH и MLPA.
-
Оценить вклад мутаций гена TBX1 в формирование фенотипа СД22q11.2 при отсутствии делеции 22q11.2.
Научная новизна
Определены клинические критерии формирования групп пациентов с подозрением на СД22q11.2 в постнатальном периоде с описанием четырех главных
компонентов синдромального фенотипа по признакам, характеризующим: 1) сердечно-сосудистую систему; 2) состояние тимуса и иммунитета; 3) лицевые дизморфии и расщелины; 4) другие микроаномалии развития. Использованные критерии клинического отбора пациентов с фенотипическими признаками CД22q11.2 позволили оптимизировать диагностику СД22q11.2 и выявить делецию 22q11.2 FISH-методом в 31% случаев. Показано, что подгруппы пациентов с подтвержденной делецией 22q11.2 и без делеции различаются по частоте встречаемости некоторых признаков: у пациентов с делецией достоверно чаще наблюдались неконотрункальные ВПС, отдельные виды конотрункальных пороков (ОАС, ПДА, тип В), гипокальциемия, пороки развития МПС и совокупность четырех признаков, относящихся к лицевым дизморфиям и микроаномалиям развития. Впервые в выборке российских больных с СД22q11.2 методом MLPA определен размер делеции у пациентов и показано, что в исследованной выборке наиболее часто представлена делеция локуса LCR22-A-B-C (3 м.п.о.).
Мутации в гене TBX1 в обследованной группе пациентов с характерным для СД22q11.2 фенотипом и отсутствием делеции 22q11.2, не вносят вклада в структуру причин синдрома.
Впервые определен комплекс эхографических маркеров СД22q11.2 у плода для формирования группы риска среди беременных.
Практическая значимость
Впервые предложен комплексный подход к диагностике СД22q11.2, включающий отбор пациентов для лабораторного исследования по определенным клиническим критериям, цитогенетический (GTG-метод), молекулярно-цитогенетический (FISH) и молекулярные методы исследования (MLPA, секвенирование). Разработана карта-анкета расширенного описания фенотипа пациента, позволяющая оптимизировать лабораторную диагностику синдрома. Установлено, что чувствительность методов FISH и MLPA п р и диагностике делеции 22q11.2 одинакова, однако метод MLPA позволяет определить размер делеций и провести поиск делеций в локусах других хромосом.
Впервые на основании комплекса специфических эхографических признаков у плодов сформирована выборка беременных женщин с подозрением на делецию 22q11.2 у плода и проведена ПД СД22q11.2, делеция выявлена в 5% случаев.
Описание спектра клинических проявлений синдрома СД22q11.2 как в пре-, так и в постнатальных периодах развития, выработка подхода к клинико-генетической диагностике синдрома с использованием современных молекулярных методов актуальны для врачей-генетиков, педиатров и врачей других специальностей, занимающихся дифференциальной диагностикой.
Положения, выносимые на защиту
1. Комплекс эхографических маркеров СД22q11.2, включающий лимфатические образования в области шеи плода, пороки сердечно-сосудистой
системы, пороки развития МПС, гипо- и аплазию тимуса, является эффективным и позволяет выявить микроделецию 22q11.2 в 5% наблюдений пренатальной выборки.
-
Использование в качестве критериев отбора пациентов в постнатальном периоде для лабораторного обследования комплекса фенотипических признаков, включающего ВПС, нарушения иммунитета, гипокальциемию, пороки МПС, совокупность характерных лицевых дизморфий и микроаномалий развития, обоснованно, поскольку позволило сформировать выборку пациентов, частота выявления СД22q11.2 в которой составила 31%.
-
Частоты отдельных фенотипических проявлениий в подгруппах пациентов с подтвержденной лабораторными методами делецией 22q11.2 и без нее достоверно различаются. Включение в карту-анкету гипокальциемии, пороков развития МПС и совокупности четырех признаков, относящихся к лицевым дизморфиям и микроаномалиям развития, позволяет повысить эффективность лабораторной диагностики.
-
Результаты выявления микроделеции 22q11.2, полученные FISH методом, полностью соответствуют результатам, полученным методом MLPA. Однако метод MLPA может являться предпочтительным, поскольку позволяет определить наличие делеции 22q11.2, ее размер, а также выявить делеции в локусах других хромосом, способных формировать схожие с СД22q11.2 фенотипические признаки.
-
В исследованной выборке мутации гена TBX1 не обнаружены и, следовательно, не вносят вклада в структуру причин СД22q11.
Апробация работы
Материалы диссертационного исследования неоднократно представлены в виде стендовых сообщений: на VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (г.Ростов-на-Дону, 2010 г.), на конгрессе Европейского общества генетики человека (г. Париж, 2013г.), на 9-ой конференции Европейского общества цитогенетиков (г. Дублин, 2013г.).; в виде устных сообщений на IX научной конференции «Генетика человека и патология: актуальные проблемы современной цитогенетики» (г.Томск, 2011 г.), на конференциях молодых ученых ФГБУ «МГНЦ» РАМН (г. Москва, 2012 и 2013г.). По результатам конкурсной конференции Молодых ученых ФГБУ «МГНЦ» РАМН за 2013г. представленная работа удостоена первой премии. Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара ФГБУ «МГНЦ» РАМН 19 февраля 2014года.
Личный вклад автора в проведенные исследования
Определение направления работы, цели и задач исследования, разработка подходов к диагностике, оценка результатов исследования проводились автором совместно с научным руководителем д.б.н, профессором Золотухиной Т.В. Автором самостоятельно изучена отечественная и зарубежная литература по теме диссертации и лично написана рукопись настоящей работы. Основная часть экспериментальной
работы: составление карты-анкеты, анализ фенотипических признаков пациентов, формирование пре- и постнатальной выборки пациентов, молекулярно-цитогенетическое исследование, – выполнена автором самостоятельно. Часть исследования, относящаяся к секвенированию гена TBX1 и исследованию образцов методом MLPA, выполнена совместно с сотрудниками лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ «МГНЦ» РАМН. Сбор клинических данных осуществлен с помощью врачей-педиатров Городской клинической больницы № 67 им. Л. А. Ворохобова (г. Москва) и Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.И. Бакулева РАМН (г. Москва). Сбор клинических данных пренатальных наблюдений, эхографические исследования и инвазивные процедуры осуществлены врачами клинического родильного дома №27 г. Москвы.
Публикации
По теме и материалам диссертации опубликованы 23 печатные работы: 10 статей, в том числе 6 в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ и 13 тезисов,7 из них – в иностранных источниках.
Структура и объем работы
Формирование фенотипических признаков СД22q11.2 в эмбриогенезе
Хромосомные болезни занимают одно из ведущих мест в структуре врожденной и наследственной патологии человека. Они обусловлены числовыми или структурными аномалиями хромосом, которые приводят к инвалидизации и часто к летальным исходам. Так, доля хромосомных синдромов среди причин младенческой и детской смертности составляет 5-7%, среди детей с умственной отсталостью – 25-30%, у лиц с нарушениями полового развития – 25-27%. Диагностика, в том числе и пренатальная, такой частой патологии, как хромосомные синдромы, представляет большую медицинскую, научную и социальную значимость. Установление диагноза больному ребенку позволяет семье не только определить наличие или отсутствие наследственной патологии и получить аргументированную медико-генетическую консультацию по поводу прогноза потомства, но и рекомендации пренатальной диагностики конкретного заболевания. Это, в свою очередь, может стимулировать родителей к новой беременности, которая будет протекать при гарантированном благоприятном прогнозе здоровья будущего ребенка.
Спектр хромосомных аномалий (ХА), являющихся причиной наследственных синдромов, широк и представлен не только числовыми аберрациями (например, наиболее распространенными трисомиями по 21, 13, 18 хромосомам или моносомией по Х хромосоме), но и разнообразными структурными нарушениями хромосом, сопровождающимися дупликациями или делециями генетического материала. Классический цитогенетический анализ (G-band using Trypsin-Giemsa, GTG) позволяет выявить все числовые ХА и те из структурных ХА, величина которых превышает 10 миллионов пар оснований. Значительная часть ХА представлена более мелкими аберрациями (микроделециями и микродупликациями), которые не выявляются при стандартном цитогенетическом анализе и могут быть диагностированы только при использовании современных молекулярно-цитогенетических или молекулярных методов исследования.
Хромосомные болезни, обусловленные структурными аномалиями хромосом, приводящие к избытку (дупликации) или недостатку (делеции) малого количества генетического материала, встречаются среди определенных групп пациентов с высокой частотой. Так среди детей с идиопатической умственной отсталостью микроперестройки хромосом встречаются с частотой до 30%. Как правило, дети с такой хромосомной аномалией остаются без определенного диагноза, а семьи без четкого прогноза потомства, т.к. такие микроперестройки хромосом не диагностируются при GTG-анализе. У пациентов, кариотип которых ранее определен как нормальный, современные молекулярные технологии позволяют выявить новые ХА, обусловленные микроделециями или микродупликациями. Перечень таких микроделеционных и микродупликационных хромосомных синдромов постоянно увеличивается в связи с расширением методических возможностей их диагностики.
Частота микроделеционных синдромов среди новорожденных вследствие неравного кроссинговера достаточно высока (от 1:4000 до 1:30000). Многие известные на сегодняшний день синдромы (Ди Джорджи, Прадера-Вилли, Ангельмана, Смит-Магенис, «кошачьего крика», Миллера-Дикера, Вольфа-Хиршхорна, Вильямса) описаны задолго до того, как установлена их этиология на молекулярном уровне.
В большинстве своем клинические проявления микроделеционных синдромов в постнатальном периоде характеризуются умственной и психомоторной задержкой развития разной степени, множественными стигмами дисэмбриогенеза, пороками развития, а также различными функциональными нарушениями.
Группа синдромов, обусловленных делецией 22q11.2, обозначаемая далее как синдром делеции 22q11.2 (СД22q11.2), включает в себя несколько синдромов с различными названиями и во многом перекрывающимися клиническими признаками. Основными синдромами этой группы являются: вело-кардио-фациальный синдром, синдром конотрункальных и лицевых аномалий и синдром Ди Джорджи. В настоящее время СД22q11.2 считается самым распространенным в популяции человека. Он встречается с частотой 1 на 4000 новорожденных и обозначается в зарубежной литературе как 22q11.2DS (22q11.2 Deletion Syndrome) (DG, MIM# 188400; CTF, MIM# 217095; VCF,MIM# 192430) [Wilson D. et al., 1992; Devriendt K. et al., 1998; Goodship J. et al., 1998; Scrambler P., 2000; Botto L. et al., 2003]. Величина делеции 22q11.2, как правило, не превышает 3 миллионов пар оснований (м.п.о.), что не позволяет определять ее при стандартном кариотипировании [Gong W. et al., 1996].
У пациентов этой группы синдромов отмечается выраженный клинический полиморфизм с преобладанием таких признаков, как лицевые дизморфии, врожденные пороки сердца (ВПС) и магистральных сосудов, аномалии развития твердого и мягкого неба, патология мочевыделительной системы, снижение иммунитета, патология центральной нервной системы, психиатрические заболевания и умственная отсталость [McDonald-McGinn D. et al., 1997а,б; McDonald-McGinn D. et al., 1999; McDonald-McGinn D. et al., 2001а; Sullivan K. et al., 2005]. Широкий спектр симптомов, формирующих группу СД22q11.2, свидетельствует о сложности клинической дифференциальной диагностики этих заболеваний и о необходимости анализа комплекса клинических признаков у пациентов с СД22q11.2 на репрезентативной выборке.
На практике зачастую врачи разного профиля, наблюдая пациентов с отдельными признаками или с комплексом признаков, характерным для СД22q11.2, либо ставят диагноз на основании клинических проявлений, либо пациенты остаются вовсе без определенного диагноза. Однако, по сути пациенты с такими признаками формируют лишь группу риска. Как и для других генетических синдромов окончательный диагноз СД22q11.2 пациенту может быть поставлен лишь после проведения уточняющей диагностики с применением современных лабораторных технологий. Таким образом, путь от формирования группы риска к конкретному диагнозу посредством использования современных молекулярно-диагностических подходов (а затем возможно и к таргетной терапии) представляет современную тенденцию персонализированной медицины, которая занимает все более значительное место в клинической практике. Клинический полиморфизм многих генетических синдромов, как и СД22q11.2, затрудняет прямую клиническую диагностику, обуславливая необходимость использования для их диагностики современных прямых молекулярных методов.
Особенности пренатальной диагностики микроделеции 22q11.2
При некоторых микроделеционных синдромах, таких, как синдром Рубинштейна-Тейби, синдром Ангельмана, синдром Алажиля, мутации в одном гене у пациентов без делеции приводят к возникновению схожих фенотипических признаков, которые есть у пациентов с делецией [Stevens C., 2009; Dagli A. et al., 2011; Spinner N. et al., 2013]. С другой стороны, существуют микроделеционные синдромы, основные фенотипические признаки которых являются следствием гаплонедостаточности одной группы генов внутри делетированного участка. Например, надклапанный стеноз аорты, – основной признак при синдроме Вильямса, наблюдается как у пациентов с типичной делецией 7q11.23, так и у пациентов с мутациями в гене эластина. Такой признак, как множественные хрящевые экзостозы, входящий в состав синдрома Лангера-Гидеона, является следствием мутации в гене EXT1. В связи с возможностью развития обоих механизмов патологии, исследователи предпринимали попытки к изучению типично делетируемого региона 22q11.2 для установления связи спектра фенотипических признаков при СД22q11.2 с гаплонедостаточностью только одного гена внутри этого региона, либо более крупной совокупности генов [Levy A et al., 1995; Kurahashi H. et al., 1996; Scambler P., 2000]. Распространенность СД22q11.2 в популяции человека обусловила высокий интерес именно к району 22q11.2 хромосомы 22 и таким образом, расшифровка геномного состава этого района произведена одной из первых. Результаты сиквенса хромосомы 22 впервые опубликованы в 1999 году Dunham et al. [Dunham I. et al., 1999].
Существование микроделеционных синдромов, обусловленных мутацией в одном гене, предопределило поиски такой мутации у пациентов с фенотипом СД22q11.2. Изначально попытки идентифицировать ген-кандидат были основаны на сравнении ДНК пациентов с различными размерами делеций, исходя из гипотезы, что главный ген будет в гомозиготном состоянии у всех пациентов с делецией. Однако типичный размер делеции у большинства пациентов составляет 3 млн. п. о., что означало отсутствие большого количества генов в этом регионе при довольно широком разнообразии клинических признаков у этих пациентов. Значительные успехи были достигнуты при сравнении пациентов с интерстициальными делециями и пациентов с терминальными делециями. Эти исследования позволили предположить, что ген-кандидат скорее всего расположен в проксимальной части типично делетируемого региона 22q11.2 [Amati F. et al., 1999]. Тем не менее, поиск мутаций в генах, кодирующих белки, показал, что изменение последовательностей в исследованных генах (DGCR6-ARVCF, DGCR2) не ассоциировано с потерей их функции [Murphy K., 2005]. В дальнейшем наиболее вероятными генами-кандидатами считались те, которые участвовали в развитии органов, являющихся производными эмбриональных структур, повреждаемых при делеции 22q11.2. Поскольку при исследовании делеций с различными характерными признаками, проявляющимися у человека, конкретный ген-кандидат не выявлен, провели эксперименты на животных. Для проверки гипотезы формирования фенотипа вследствие гаплонедостаточности нескольких генов в типично делетируемом регионе 22q11.2 использовали мышиные модели. Эти эксперименты оказались возможными, поскольку гены, делетированные у пациентов с СД22q11.2, за небольшим исключением, находились в аналогичном кластере генов мышиной хромосомы 16 и оказались довольно высоко консервативны [Botta A. et al., 1997; Puech A. et al., 1997; Sutherland H. et al., 1998]. Это привело к гипотезе, что гаплонедостаточность гена(-ов) в районе делеции приводит к нарушению развития этих структур.
Мыши, гетерозиготные по делеции части региона мышиной хромосомы 16, гомологичной типично делетируемому району хромосомы 22q11.2, имели дефекты сердца, напоминающие таковые у пациентов с СД22q11.2 [Lindsay E. et al., 1999; Jerome L. et al., 2001; Merscher S. et al., 2001]. При делеции этого же региона под воздействием различных генетических модификаторов у мышей также обнаружены дефекты тимуса, причем признаков влияния неделетированных аллелей генов в типично делетируемом регионе не показано [Linsay E. et al.,, 2000; Taddei I. et al., 2001]. Дальнейшие трансгенные эксперименты на мышах позволили сузить интервал региона, ответственный за формирование фенотипических особенностей данной патологии [Puech A. et al., 2000; Lindsay E. et al., 2001]. На основании особенностей эмбриональной экспрессии в мезодерме фарингеальных структур, наилучшим геном-кандидатом оказался TBX1. Этот ген относится к семье генов T-box - ДНК-связывающих транскрипционных факторов. Показано, что T-box гены играют важную роль в регуляции процессов развития. Гаплонедостаточность двух T-box генов, TBX3 и TBX5, ассоциирована с генетическими болезнями – синдром Шинцеля и синдром Холт-Орама, соответственно. В 2001 году три независимые группы исследователей опубликовали работы, где в экспериментах на нуллисомных по TBX1 мышах продемонстрированы повреждения всех основных анатомических структур, затрагиваемых при СД22q11.2 [Jerome L. et al., 2001; Lindsay E. et al., Merscher S. et al., 2001].
Экспериментально осуществили точечные делеции гена TBX1, и у гетерозиготных мышей обнаружены дефекты дуги аорты [Jerome L. et al., 2001; Lindsay E. et al.; Merscher S. et al., 2001]. Мыши-гомозиготы по TBX1 умирали до или сразу после рождения, имея характерные для СД22q11.2 отличительные признаки, включая дефекты выводящего тракта, гипоплазию тимуса и паращитовидных желез, расщелины неба и лицевые аномалии [Jerome L. et al., 2001]. Эти данные четко свидетельствуют о том, что ген TBX1 является геном-кандидатом номер один для многих ключевых признаков СД22q11.2. Мутационный анализ TBX1 у пациентов с фенотипом, характерным для СД22q11.2, но с отсутствием делеции 22q11.2, может способствовать пониманию роли TBX1 в этиологии этих синдромов [Gong W. et al., 2001].
Хотя гаплонедостаточность гена TBX1 и является основным детерминирующим фактором, один или несколько других генов делетируемого региона могут играть независимую или модифицирующую роль в развитии физических аномалий, характерных для синдрома. К настоящему моменту существуют данные о потенциальной значимости генов, картированных в типично делетируемом регионе 22q11.2 [Gogos J. et al., 1999; Jacquet H et al., 2002; De Lucia F. et al., 2001].
Цитогенетическое исследование
Пренатальная диагностика редких хромосомных синдромов, обусловленных мелкими структурными ХА (микроделециями или микродупликациями), представляет некоторые затруднения в связи со сложностью выявления и интерпретации эхографических признаков и их сочетаний. Использование УЗ-аппаратуры высокого разрешения для поиска нестандартных дополнительных эхографических маркеров, а также высокая компетенция специалистов могут способствовать повышению эффективности пренатального выявления микроделеционных синдромов. При этом методами лабораторного исследования должны быть современные молекулярные технологии.
В данной работе представлен подход к пренатальному исследованию и результаты диагностики СД22q11.2. Это включает в себя определение критерие в 60 наблюдениях плодов с различными эхографическими маркерами в I и во II триместрах беременности (22 наблюдения в I и 38 – во II триместре) и нормальным кариотипом при GTG-исследовании. Для диагностики микроделеции 22q11.2 методом FISH исследованы плоды с наличием в I триместре одного из следующих признаков: увеличенного ВП, ВПС, лимфатических образований в области шеи плода. Во II триместре показаниями к исследованию служило наличие одного из следующих признаков: ВПС, пороки развития МПС, ЗВРП, аномалии развития неба, гиперэхогенные включения в желудочках сердца плода.
В этих случаях первоначально необходимо выполнять стандартное исследование кариотипа для исключения из дальнейших молекулярных исследований случаи, где выявляются частые, различимые при стандартном микроскопировании, ХА.
Сложностью цитогенетической ПД является ограниченность материала, полученного в ходе инвазивного вмешательства и срочность постановки диагноза. В связи с этим, выработана тактика исследования образцов клеток плодов с эхографическими маркерами. Для стандартной цитогенетической диагностики, как правило, использовали 1-2 препарата (из обычно доступных четырех), чтобы в случае выявления нормального кариотипа плода на резервных препаратах провести расширенное молекулярно-цитогенетического исследование [Donnenfeld A. et al., 2006].
В I триместре FISH-методом исследовано 22 образца ворсин хориона, где стандартным «полупрямым» методом определен нормальный кариотип. Основным показанием для проведения данного исследования являлось наличие расширенного (больше 95 процентиля) ВП (n=17) у плода. Средняя величина ВП у плодов в этой выборке составила 4,56 мм. Также в подгруппу вошли плоды с наличием изолированного ВПС или сочетания его с ВП (n=2) и наличием анэхогенных образований в области шеи плода (n=3). В этой группе микроделеция 22q11.2 диагностирована в одном наблюдении. Данные представлены в таблице 2.
Случай 1. Делеция 22q11.2 обнаружена у плода пациентки 39 лет. При эхографическом исследовании в 13 недель беременности выявлено круглое анэхогенное включение в области шеи плода диаметром 6,7 мм. Беременность, третья по счету, наступила в результате ЭКО (Рисунок 4).
Во II триместре исследовано 38 образцов КЛПК. Основными показаниями для направления на FISH-исследование у плодов с нормальным GTG-кариотипом являлись следующие эхографические маркеры: различные ВПС (n=21), такие как транспозиция магистральных сосудов, тетрада Фалло, прерванная дуга аорты, атрио-вентрикулярный канал; гиперэхогенный фокус в желудочках сердца плода (n=10); аномалии развития МПС (пиелоэктазия, мегалоуретер, многоводие); аномалии неба; ЗВРП; аплазия тимуса и сочетание этих признаков (n=7). Микроделеция 22q11.2 в этой группе обнаружена у двух плодов. Данные представлены в таблице 3. На рисунке 5 показано изображение FISH на метафазной пластинке и в интерфазном ядре с отсутствием делеции локуса TUPLE1 района 22q11.2.
Случай 2. У плода первобеременной пациентки 27 лет при эхографическом исследовании в 20 недель беременности обнаружен комбинированный ВПС: прерывание дуги аорты, атриовентрикулярный канал и аплазия тимуса. Делеция 22q11.2 диагностирована FISH-методом на препарате из КЛПК плода с ДНК-зондом TUPLE1/ARSA (Abbott Molecular).
Случай 3. У пациентки 36 лет при УЗИ плода в 17 нед беременности обнаружена двусторонняя пиелоэктазия, мегалоуретер и многоводие. При FISH-исследовании препаратов КЛПК выявлено наличие у плода микроделеции 22q11.2. Рисунок 4. FISH на препарате из культуры лимфоцитов пуповинной крови плода с ДНК-зондом TUPLE1/ARSA (Abbott Molecular), локус TUPLE1 мечен красным флуорохромом, контрольный локус ARSA – зеленым флуорохромом. Делеция локуса TUPLE1 на метафазной пластинке и в интерфазном ядре. Рисунок 5. FISH на препарате из культуры лимфоцитов пуповинной крови плода с ДНК-зондом TUPLE1/ARSA (Abbott Molecular), локус TUPLE1 мечен красным флуорохромом, контрольный локус ARSA – зеленым флуорохромом. Отсутствие делеции локуса TUPLE1 района 22q11.2, метафазная пластинка и интерфазное ядро. Таблица 3. Результаты молекулярно-цитогенетической диагностики микроделеции 22q11.2 у плодов во II триместре беременности.
В связи с высокой распространенностью СД22q11.2 и вариабельностью клинических проявлений этого синдрома при формировании выборки беременных женщин, с подозрением на СД22q11.2 у плода, в исследование во II триместре беременности включены случаи не только с конотрункальными пороками сердца, но и с аномалиями развития МПС, неба, ЗВРП, гиперэхогенным фокусом в области сердца, а в I триместре – кроме случаев с расширенным ВП, наличие ВПС и анэхогенных образований в области шеи плода. Некоторые авторы считают изолированное расширенное ВП, так же как и гиперэхогенный фокус в области сердца плода, ненадежными эхографическими маркерами для выявления микроделеции 22q11.2 [Donnenfeld A. et al., 2006; Lautrup C. et al., 2008]. У других авторов есть сообщения об обнаружении микроделеции 22q11.2 у плодов с этими эхографическими маркерами [Lazanakis M. et al., 1998; Machlitt A. et al., 2002]. Однако в ходе исследования представленной выборки среди 10 плодов с гиперэхогенным фокусом в области сердца микроделеции 22q11.2 не выявлено. Немаловажное значение имеет определение наличия и величины тимуса при эхографии плода. К сожалению, этот эхографический параметр врачи ультразвуковой диагностики редко оценивают в раннем II триместре беременности.
В большом мультицентровом исследовании 272 случаев СД22q11.2, пренатально диагностированных во Франции за 18 лет усилиями 39 лабораторий, наглядно показана низкая частота выявления таких признаков у плода, как гипоплазия тимуса, аномалия почек, лицевые дизморфии по сравнению с данными последующей аутопсии этих плодов [Besseau-Ayasse J. et al., 2014]. В то время как именно сочетанность этих патологических признаков с ВПС является наиболее вероятным предсказательным фактором наличия делеции, поскольку встречается в 83,8% пренатальных случаев СД22q11.2, и является прямым показанием для молекулярно-цитогенетического исследования плода и поиска делеции 22q11.2 [Chaoui R. et al., 2002; Wentzel C. et al., 2008]. Так, в наблюдении 2 проведенного исследования микроделеция 22q11.2 выявлена при направлении женщины именно по наличию у плода сочетания ВПС (прерывание дуги аорты, атриовентрикулярный канал) с аплазией тимуса.
Поскольку по данным литературы у плодов с микроделецией 22q11.2 описаны аномалии развития МПС, фенотипические отклонения строения мочевыделительной системы учитывали при отборе пациентов для молекулярно-цитогенетического исследования [Ryan A., et al, 1997]. По мнению Bretelle et al., наличие у плода во II триместре патологии почек и/или полигидрамниона могут ассоциироваться с СД22q11.2 [Bretelle F. et al., 2010].
Таким образом, лучшими эхографическими признаками при подозрении на СД22q11.2 у плода считаются ВПС и конотрункальные аномалии [Boudjemline Y. et al., 2001; Bretelle F. et al., 2010]. В ранние сроки беременности структуры сердца и сосудов еще недостаточно сформированы и поэтому трудно различимы при эхографии плода. В представленном исследовании при обнаружении СД22q11.2 у плода в I триместре отмечено увеличенное ВП, анэхогенные образования в области шеи (лимфодема шейного отдела) и, реже наблюдали ВПС. Все эти признаки, в особенности ВП и лимфатические образования в области шеи плода, по сути, являются полипотенциальными факторами риска развития того или иного порока развития, и в то же время могут иметь транзиторный характер.
Во II триместре, когда более различимы дефекты развития внутренних органов, среди 38 наблюдений делеция 22q11.2 выявлена в двух случаях: у плода с комбинированным ВПС (прерывание дуги аорты, атриовентрикулярный канал) и аплазией тимуса, а также у плода с аномалией МПС (двусторонняя пиелоэктазия, мегалоуретер и многоводие). Из двух наблюдений проведенного исследования с патологией МПС у плода в одном из них (случай 3) выявлена микроделеция 22q11.2, что подтверждает мнение Bretelle et al. о целесообразности включения таких пациенток в расширенное молекулярное исследование плода [Bretelle F. et al., 2010].
В пренатальной выборке частота выявления СД22q11.2 у плода в обеих группах в целом составила 5% (3 из 60), что сопоставимо с данными зарубежных авторов [Bretelle F. et al., 2010]. В случае 1 микроделеция 22q11.2 выявлена в связи c обнаружением при эхографическом исследовании в I триместре не расширенного ВП, а анэхогенного образования в области шеи плода и является нетипичным. Причем из трех плодов с анэхогенными образованиями в области шеи микроделеция 22q11.2 выявлена у одного. Это позволяет сделать вывод о целесообразности включения данного эхографического маркера в спектр признаков для направления на ПД СД22q11.2 в I триместре, поскольку на этом сроке эффективность эхографического исследования не очень высока и перечень показаний достаточно узок. Следует отметить, что ПД СД22q11.2 редко осуществляют в I триместре в связи с отмеченными сложностями. Большинство опубликованных случаев ПД
Результаты исследования делеции 22q11.2 методом MLPA
При постнатальном исследовании пациентов с направительным диагнозом СД22q11.2 в работе использован комплексный подход, включающий клинические, стандартные цитогенетические, молекулярно-цитогенетические и молекулярные методы исследования для дифференциальной диагностики синдрома.
За «ядро» клинических проявлений у пациентов постнатальной выборки приняты: ВПС (конотрункальные и неконотрункальные), лицевые дизморфии (аномалии носа, рта, расщелины неба, глазные щели, щеки), аномалии развития черепа, головы (нижней и верхней челюстей), шеи, ушных раковин, кистей и стоп, гипотония, гипокальциемия, снижение иммунитета вследствие гипо- и аплазии тимуса, а так же задержка речевого и психомоторного развития. Большинство пациентов имели ВПС, в т.ч. конотрункальные и/или характерные для СД22q11.2 лицевые дизморфии.
Доля пациентов с СД22q11.2, выявленная с помощью молекулярно-цитогенетической диагностики (FISH-метод) в группе из 138 пациентов составила 31% (делеция выявлена в 43 случаях из 138). На основании результатов FISH-исследования в работе обозначены две подгруппы пациентов – с делецией (n=43) и без нее (n=95).
У 28 из 43 пациентов с подтвержденной делецией 22q11.2 имелись конотрункальные ВПС, наиболее характерные для СД22q11.2 (общий артериальный ствол, атрезия легочной артерии, перерыв дуги аорты, тип В, двойное отхождение сосудов от правого желудочка, тетрада Фалло, стеноз легочной аретрии), в сочетании с лицевыми аномалиями. У 14 пациентов с делецией наблюдались менее типичные ВПС и аномалии развития сердечно-сосудистой системы, такие как дефекты межжелудочковой перегородки, дефекты межпредсердной перегородки, сосудистое кольцо, аневризма межпредсердной перегородки, открытое овальное окно, но имелись характерные лицевые аномалии, наряду с иммунодефицитом, что явилось причиной направления их на молекулярно-цитогенетическую диагностику СД22q11.2. Один пациент с делецией 22q11.2 не имел ВПС.
Конотрункальные пороки сердца, так же как лицевые дизморфии, выявлены с одинаковой частотой в обеих подгруппах – с делецией 22q11.2 и без таковой. Тогда как частота встречаемости неконотрункальных ВПС оказалась больше в группе пациентов с делецией.
В медицинской практике в настоящее время в нашей стране распространена ситуация, когда диагноз СД22q11.2 в различных формулировках (ВКФС, КЛАС и др.) ставят только на основании клинических признаков пациентов. Однако этот диагноз далеко не всегда правомочен и требует обязательного подтверждения молекулярными методами. Сравнительный анализ фенотипических признаков у пациентов двух подгрупп данной выборки (с делецией и без нее) показал отсутствие статистически значимых различий между ними по частоте встречаемости главных синдромальных признаков в подгруппах. Даже в отобранной по единой карте-анкете группе пациентов с характерными для СД22q11.2 фенотипом делеция обнаружена только в 31% случаев. У двух пациентов выявлены ХА (mos45,X[42]/47,XXX[8], 48,ХХХХ). Кроме того, в подгруппе пациентов без делеции 22q11.2, но с характерным фенотипом, диагностированы другие генетические синдромы: два случая синдрома Смит-Магенис и один случай - синдрома Алажиля. Это свидетельствует о том, что схожие фенотипические признаки могут иметь различную генетическую этиологию. Отсутствие делеции 22q11.2 у пациентов с характерным фенотипом может служить поводом для использования современных методов дифференциальной диагностики генетических заболеваний, в том числе array-CGH.
На сегодняшний день FISH-метод является самым доступным для идентификации делеции 22q11.2 и применяется наиболее часто. Как правило, для гибридизации используется локус-специфичный ДНК-зонд на локус TUPLE1(HIRA), поскольку он располагается в области типичной делеции. Несмотря на высокую чувствительность и специфичность диагностики микроделеции 22q11.2, FISH-метод не позволяет оценить размер делеции. С этой целью могут быть использованы молекулярные методы, в частности метод MLPA.
Для подтверждения наличия делеции и определения ее размера в 77 постнатальных наблюдениях проведено исследование ДНК пациентов методом MLPA. Образцы представлены как случаями с делецией (n=28), так и без нее (n= 49). Материалом для MLPA-исследования служили образцы ДНК пробандов, выделенной из лимфоцитов периферической крови, и образцы ДНК, выделенной из взвесей клеток архивированных культур лимфоцитов в фиксаторе Карнуа. В этом случае выделение ДНК проводили с помощью набора Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA). Этот метод позволил провести успешное MLPA-исследование на архивном материале культур лимфоцитов пациентов, имевшемся в лаборатории.
Для регистрации делеций в локусе 22q11.2 использован метод MLPA с набором P250-B1 DiGeorge Syndrome (MRC-Holland). В данный набор кроме 29 проб, маркирующих регион делеции 22q11.2, включены ДНК-пробы на локусы других хромосом, делеции в которых обуславливают схожие с СД22q11.2 пороки сердечно-сосудистой системы – 10p14, 4q34-qter, 8p23, 17p13.3, 9q34.3, 22q13.
Результаты MLPA-исследования полностью совпали с результатами FISH-исследования: в 28 образцах делеция подтверждена, а в 49 образцах она отсутствовала. Во всех 28 случаях определен размер делеции. Самая частая делеция (в 22 случаях) затрагивала регион LCR22-A-B-C и составляла 3 м.п.о., в 4 случаях затрагивала регион LCR22-A-B в 2 м.п.о., и по одному случаю делеция составляла 1,5 и 3,5 м.п.о.
Целесообразность использования MLPA-метода с набором P250-B1 заключалась не только в том, чтобы подтвердить делецию и оценить ее размер, но и провести поиск возможных делеций в других хромосомах, способных приводить к схожему фенотипу. В представленной работе среди 49 образцов ДНК без делеции 22q11.2, исследованных методом MLPA, делеций в локусах других хромосом не обнаружено.
Однако, не смотря на все видимые преимущества метода MLPA, в лабораториях, ориентированных на цитогенетические методы исследования, FISH метод остается наиболее часто используемым. Кроме того, метод MLPA требует специального лабораторного оборудования, а рентабельное использование наборов для MLPA предполагает наличие довольно больших групп для одномоментного исследования в связи с использованием контролей в реакции.
Принимая во внимание то, что этиологической причиной некоторых генетических заболеваний может служить не протяженная микроделеция, а мутация внутри одного гена, в 11 случаях представленной выборки, где у пациентов имелась типичная клиническая картина, но не обнаружено ни делеции 22q11.2, ни делеций в других хромосомах, пробы на которые имелись в использованном MLPA наборе, методом прямого секвенирования проведен поиск мутаций в гене TBX1, который в настоящее время считается ответственным за формирование большинства фенотипических признаков, характерных для СД22q11.2 [Jerome L. et al., 2001]. Мутаций в гене TBX1 не обнаружено, зарегистрировано несколько нейтральных полиморфизмов.
