Введение к работе
Актуальность темы. Одной из актуальных задач современной молекулярной биологии является сравнение двух близких по составу образцов нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) из одного организма или разных организмов внутри одного вида с целью обнаружения различий между ними. Различия могут заключаться как в наличии (отсутствии) молекул нуклеиновых кислот с определенной последовательностью в одном из образцов, так и в количественных (концентрационных) вариациях последовательностей, присутствующих в обоих сравниваемых образцах.
Выявление индивидуальных или видоспецифичных генетических особенностей является комплексной технологической задачей, осложненной тем, что особенности эти могут составлять лишь малую часть генетического материала сравниваемых организмов (вплоть до одного нуклеотида). Поэтому подходы к выполнению такого рода исследований, чаще всего, базируются на методе полимеразной цепной реакции, позволяющем нарабатывать молекулы ДНК определенной последовательности начиная с минимальных количеств стартового материала.
Так, различия геномов близкородственных штаммов бактерий представляют большой интерес для исследователей, поскольку могут определять наличие у данного штамма уникальных черт (патогенности, повышенной вирулентности, устойчивости к антибиотикам и т.д.). Благодаря появлению полных последовательностей геномов близкородственных бактериальных штаммов стало возможным определение эффективности прямого сравнения бактериальных геномов методами вычитающей гибридизации.
Исследование полиморфных участков генома человека, ассоциированных с развитием заболеваний или определенными фенотштическими особенностями, требует создания высокопроизводительных и недорогих методов определения аллельного состояния этих регионов. Появление оборудования, позволяющего регистрировать накопление ДНК в ходе полимеразной цепной реакции, создало предпосылки для развития простых и высокопроизводительных методов генотипирования при помощи ПЦР.
Вместе с тем, появившаяся возможность снятия кинетики накопления продукта ПЦР в ходе реакции позволяет с высокой точностью оценивать количество определенных молекул ДНК в исследуемом образце, что дало толчок к разработке подходов к измерению концентрации отдельных нуклеиновых кислот при помощи полимеразной цепной реакции с регистрацией результатов «в реальном времени».
В связи с вышеизложенным, особенно актуальным является создание новых методов определения генетических различий трех типов: 1) методов поиска последовательностей
нуклеиновых кислот, присутствующих лишь в одном из сравниваемых образцов (дифференциально представленные последовательности), 2) высокопроизводительных методов детекции определенных генетических полиморфизмов и 3) методов количественного определения отдельных последовательностей ДНК или РНК при помощи полимеразной цепной реакции с регистрацией результатов «в реальном времени».
Цель работы. Целью данной работы являлось создание новых методов выявления уникальных и полиморфных последовательностей в сложных смесях молекул нуклеиновых кислот, а именно: 1) методов сравнения сложных образцов нуклеиновых кислот для поиска дифференциально представленных последовательностей, 2) методов детекции определенных генетических полиморфизмов и 3) методов количественного определения отдельных нуклеиновых кислот при помощи полимеразной цепной реакции «в реальном времени».
Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Исследовать возможности применения метода вычитающей гибридизации нуклеиновых кислот при а) поиске последовательностей, отличающих близкородственные бактериальные геномы и б) поиске транскриптов с различной представленностью в сравниваемых образцах.
-
Создать метод определения однонуклеотидных полиморфизмов с использованием нового фермента с уникальными свойствами - термостабильной дуплекс-специфичной нуклеазы.
-
Усовершенствовать технологию детекции однонуклеотидных полиморфизмов на основе аллель-специфичной полимеразной цепной реакции с использованием ПЦР «в реальном времени» с флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными пробами или праймерами.
-
Разработать алгоритм проведения исследования и анализа результатов ПЦР «в реальном времени», повышающий точность и воспроизводимость количественного ПЦР-анализа в сравнении с существующими методами и оценить точность метода при проведении количественного исследования.
Научная новизна работы. Впервые определена полнота и эффективность метода гибридизационного сравнения геномов путем прямого сопоставления результатов shotgun секвенирования близкородственных прокариотических геномов (на 99%) и результатов их вычитающей гибридизации. На примере сравнения эукариотических транскриптомов продемонстрирована эффективность метода вычитающей гибридизации с использованием этапа зеркально-ориентированной селекции. Впервые обнаружен фермент с уникальными
свойствами: термостабильная нуклеаза, неспецифичная к последовательности нуклеотидов, расщепляющая двуцепочечные ДНК и ДНК цепь в ДНК/РНК гетеродуплексах, но не действующая на одноцепочечные молекулы ДНК и любые РНК. Клонирован ген фермента, определена его последовательность, охарактеризована субстратная специфичность и физико-химические свойства нуклеазы. На основе уникальных свойств фермента разработана новая схема определения однонуклеотидных полиморфизмов при помощи коротких флуоресцентно-меченых гибридизационных проб. Усовершенствована технология детекции однонуклеотидных полиморфизмов на основе аллель-специфичной полимеразной цепной реакции с использованием ПЦР «в реальном времени» с флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными пробами или праймерами. Впервые продемонстрирована возможность эффективного различения аллелей при помощи нескольких флуоресцентно-меченых аллель-специфичных праймеров в одной реакционной смеси. Создан принципиально новый алгоритм проведения исследования и анализа результатов ПЦР «в реальном времени», основанный на считывании уровня флуоресценции дважды в течение одного цикла реакции. Создана математическая модель обработки полученных результатов. Впервые установлена точность метода ПЦР «в реальном времени», как инструмента количественного исследования на примере определения процентного содержания генетически модифицированных ингредиентов в пищевых продуктах и кормах. Показано, что точность относительного количественного исследования для метода ПЦР «в реальном времени» составляет около 30% вне зависимости от марки используемого оборудования и наборов реагентов.
Практическая ценность работы. Проведено обследование различных групп населения, включая выборки по региону проживания и национальности (16 популяций), выборки с определенными видами заболеваний, группы по профессиональной принадлежности. Впервые проведено обследование 7 популяций россиян на полиморфизм генов, ассоциированных с устойчивостью к ВИЧ и развитием СПИД. Для 4 российских популяций впервые определена частота генотипа по полиморфному маркеру С139ЮТ, ассоциированному с первичной пшолактазией. С целью количественной оценки корреляций генотипа и фенотипа (венозный тромбоз) проведено обследование выборки пациентов ФГУ Российский Кардиологический Научно-Производственный Комплекс Росздрава по ряду полиморфизмов, ассоциированных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы. Впервые исследовано распределение частот аллелей генов, ассоциированных с физической активностью на выборках профессиональных спортсменов в различных видах спорта, в результате чего обнаружены корреляции определенных генотипов и реакции организма на физические нагрузки разного профиля. Установлен уровень точности метода ПЦР как
инструмента для количественного определения примеси генетически модифицированного материала в пищевых продуктах.
Реализация и внедрение результатов работы. На основе усовершенствованной методики вычитающей гибридизации нуклеиновых кислот разработаны и выпускаются наборы реагентов для сравнения сложных смесей ДНК и кДНК (ЗАО «Евроген»). Разработаны и внедрены в серийное производство (ЗАО «НПФ ДНК-Технология») тест-системы для определения диагностически значимых полиморфизмов в геноме человека методом аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (АС-ГЩР) с использованием ПЦР «в реальном времени» (всего более 60 тест-систем, список разработанных тест-систем приведен в Приложении 1). Алгоритм анализа результатов ПЦР «в реальном времени» реализован в составе программного обеспечения для трех моделей серийных отечественных детектирующих ДНК-амплификаторов. Разработанные методики апробированы и применяются в Федеральном государственном учреждении «Лечебно-реабилитационный центр» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Росздрава, (г. Москва), Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчннникова РАН (г. Москва), Институте общей генетики РАН (г. Москва), Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН (г. Москва), Московском государственном университете им. М.В-Ломоносова (г. Москва), Государственном учреждении научно-исследовательский институт питания РАМН (г. Москва), ряде областных и городских СЭС МЗСР РФ, широком спектре коммерческих диагностических лабораторий.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Установлена полнота и эффективность метода гибридизационного сравнения геномов путем прямого сопоставления результатов секвенирования близкородственных прокариотических геномов (на 99%) и результатов их вычитающей гибридизации. Установлена эффективность метода гибридизационного сравнения эукариотических транскриптомов.
-
Предложен и реализован принципиально новый метод определения аллельного состояния полиморфных локусов, основанный на использовании термостабильной дуплекс-специфичной нуклеазы с уникальными свойствами.
-
Предложен и реализован новый алгоритм проведения исследования и анализа результатов ПЦР «в реальном времени», основанный на двойном считывании уровня флуоресценции при разных температурах в ходе одного цикла реакции, повышающий точность исследования в 3 раза в сравнении с традиционно применяемым подходом.
4. Предложена и реализована технология детекции однонуклеотидных полиморфизмов с использованием нескольких флуоресцентно-меченых аллель-специфичных праймеров в одной реакции за счет использования дополнительных кросс-мутаций, что повышает эффективность дифференцировки аллелей более чем в 2 раза.
5 Установлена точность метода ПЦР «в реальном времени» при проведении количественного исследования на примере определения процентного содержания генетически модифицированных ингредиентов (ГМИ) в пищевых продуктах и кормах.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на более чем 20 отечественных и 8 международных конференциях, в том числе: съездах общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова (Москва, Россия, 2003-2005), симпозиуме «Молекулярная диагностика» 11-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, Россия, 2005), международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, Россия, 2006), конференции Human Genome Meeting (Хельсинки, Финляндия, 2006), VI Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва, Россия, 2006), 21-й международной конференции Европейской Федерации Иммуногенетиков (Барселона, Испания, 2007), XI Всероссийском Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, Россия, 2007), 6-ой ежегодной конференции «Цитокины и воспаление» (Орландо, США, 2008) и многочисленных приглашенных научных семинарах в научно-исследовательских учреждениях в России и за рубежом.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 печатных работ, включая методическое пособие издательства Колд Спринт Харбор и методическое пособие по анализу бактериальных патогенов серии «Научные книги НАТО». В том числе 18 работ в журналах, рекомендованных ВАК.
Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в разработке дизайна экспериментов, отработке методик и обобщении полученных результатов. Автор руководил работами по приложению созданных методик на практике. Личный вклад автора в данном исследовании составляет около 80%.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 155 страницах, содержит 11 таблиц, 34 рисунка и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы (включающего 125 источников) и трех приложений.
