Введение к работе
Актуальность темы. Полиморфные локусы генома человека нашли широкое применение в молекулярной генетике и медицине. Интенсивные работы по расшифровке ігуклеотидной последовательности человеческой ДНК привели к созданию нескольких поколений подробных генетических карт с более или менее равномерным распределением по всей хромосоме высокополиморфных маркеров, причем плотность последних на карте возрастала от поколения к поколению. Это позволило привязать к данным маркерам локализованные по соседству гены и упорядочить взаимное расположение последних на хромосоме.
Многие вариабельные локусы, относящиеся к так называемым тандемно повторяющимся последовательностям (минисателлиты, или VNTR - variable number of tandem repeats, и микросателлиты, или STR -short tandem repeats), обладают высокой степенью индивидуального полиморфизма и информативности, что делает их крайне полезными для использования в судебной медицине при идентификации личности на уровне ДНК и разрешении спорного отцовства. Создание идентификационных панелей на основе таких локусов позволило резко повысить разрешающую силу и мощность анализа при проведении в судебно-медицинской экспертизы по сравнению с ранними тест-системами, основанными на белковом полиморфизме.
Полиморфные маркеры, особенно те, что расположены внутри генов, также нашли свое применение и в генетическом анализе мультифакторных заболеваний. К последним относятся разнообразные аутоиммунные, раковые и сердечно-сосудистые патологии, имеющие сложную картину возникновения и развития в результате взаимодействия целого ряда неблагоприятных факторов, включая и генетические. Наличие достоверных различий в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного локуса, расположенного внутри или рядом с геном-кандидатом, между группами здоровых лиц и больных свидетельствует об ассоциации полиморфного маркера (и гена-кандидата) с заболеванием. Семейный анализ позволяет выяснить, сцеплен ли изучаемый полиморфный маркер с патологией или нет.
Установление ассоциации и сцепленности гена с заболеванием имеет важное значение для разработки мер по профилактике и лечению данной патолопіи, дифференцированного подхода при подборе лекарственных препаратов (ингибиторы, блокаторы, стимуляторы), действующих на белковый продукт данного гена (фермент, гормон, рецептор), для пациентов в зависимости от их генотипа, формированию групп риска и прочее. Особое значение это имеет в случае таких комплексных заболеваний, как сахарный диабет и диабетические осложнения, сердечно-сосудистые и аутоиммунные нарушения и прежде всего по причине повсеместного распространения данных патологий и
существенного характера наносимого ими социально-экономического вреда, особенно заметного на территории Российской Федерации.
В настоящее время в России исследования в области генетики мультифакторньгх заболеваний ведутся весьма активно во многих научных центрах, но при этом детальное понимание генетических механизмов развития данных патологий остается неясным, а сами исследования носят разрозненный характер ввиду отсутствия единой централизованной генотипической базы данных по пациентам и контрольным выборкам. Тем не менее, предпринимаются попытки координации общих усилий по лечению и профилактике наиболее распространенных заболеваний. Таким примером" может служить федеральная программа "Сахарный диабет", одной из целей которой является подведение генетического фундамента и обоснования лечебно-профилактических мер по снижению и предотвращению заболеваемости диабетом и его осложнениями. Аналогичная ситуация сложилась и в области отечественной геномной дактилоскопии, где наряду с отсутствием единых генетических баз данных также не разработана унифицированная идентификационная панель, наличие которой позволило бы сделать первые шаги по направлению к созданию централизованного криминалистического банка данных ДНК. Данные задачи уже во многом решены в развитых странах.
В этом свете весьма актуальной является предпринятая в настоящем исследовании попытка разработать тест-систему для идентификации личности на уровне ДНК и определения спорного отцовства, предлагаемую для использования на территории РФ. и ассоциативный анализ ряда мультигенных заболеваний (сахарный диабет и его сосудистые осложнения, Базедова болезнь, сердечно-сосудистые нарушения) в московской популяции.
Цель и задачи исследования. Основная цель настоящей работы заключалась в создании идентификационной тест-системы на основе полиморфных микро- и минисателлитных локусов, предназначенной для проведения судебно-медицинских исследований на территории России-, и ассоциативном анализе вышеперечисленных мультифакторных патологий с использованием полиморфных генетических маркеров в популяции Москвы.
В задачи исследования входило: 1) определение частот аллелей и генотипов вошедших в состав панели 8 микро- и 6 минисателлитных локусов в московской и томской популяционных выборках; 2) сравнительный анализ полученных данных с результатами аналогичных исследований по другим популяциям; 3) определение критериев информативности исследованных локусов и их пригодности для идентификационного анализа по эффективности амплификации в зависимости от количества, качества и происхождения используемой гсипмнпй ЛШС: 4) комплексный анализ Базедовой болезни с
з
использованием полиморфных маркеров, расположенных внутри
генов-кандидатов области HLA, CTLA4, LMP2, TSHR и IL1RN; 5) исследование связи генов главного комплекса гистосовместимости класса II (HLA-DQA1 и HLA-DQB1) и антиоксидантной зашиты (CAT и SOD2) с сахарным диабетом; 6) ассоциативный анализ диабетических микроангиопатии (нефропатия, ретинопатия) с помощью генов-кандидатов, ответственных за регуляцию кровяного давления (гены ренин-ангиотензиновой системы, NOS3), сорбитолового пути обмена глюкозы (AR2) и антиоксидантной защиты (CAT и SOD2); 7) изучение ассоциации генов CAT и SOD2 с макрососудистыми осложнениями диабета (инфаркт миокарда, гипертония, ишемическая болезнь сердца); 8) анализ связи между генами, отвечающими за регуляцию тонуса сосудов (гены ренин-ангиотензиновой системы, NOS3) и сердечно-сосудистыми нарушениями (ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, гипертония).
Научная новизна. До настоящего времени данные по сравнительно-популяционному анализу частот аллелей и информативности исследованных полиморфных локусов в русскоязычных популяциях представлены недостаточно или отсутствуют вообще, что затрудняет проведение исследований по идентификации личности в России. Нами определены частоты аллелей и генотипов шести минисателлитов (D1S80, D1S111, D17S5, АРОВ, IGJH, RB1) в московской и восьми микросателлитов (D6S366, D19S253, HUMACTBP2, HUMF13A01, HUMCYAR04, HUMTH01, HUMvWFII, HUMCD4) в московской и томской популяциях. Впервые в России на основе этих полиморфных локусов создана панель, предлагаемая для идентификации личности и определения спорного отцовства на уровне ДНК, причем для каждого из локусов определены количественные критерии информативности и разрешающей силы и оценена их пригодность для идентификационного анализа с точки зрения эффективности амлификации в зависимости от количества, качества и происхождения тестируемой ДНК.
Впервые в России проведен комплексный анализ Базедовой болезни и показана ассоциация с ней генов CTLA4, LMP2, HLA и ILR1N. Показана связь между генами HLA (DQA1 и DQB1) и сахарным диабетом не только первого, но и второго типа. Обнаружена ассоциация между генами антиоксидантной защиты (CAT и SOD2) и сахарным диабетом -аналогичных исследований в мире не проводилось. Впервые в России проведен комплексный анализ диабетической нефропатии и найдена связь между данной патологией и генами АСЕ и NOS3, что свидетельствует о важной роли генов, контролирующих сосудистый тонус в становлении этой микроангиопатии. Найдена связь между геном AR2 и диабетической ретинопатией, указывающая на важность патологической активации сорбитолового пути метаболизма глюкозы в формировании и прогрессировании поражения микрососудов сетчатки глаз при диабете. Показана роль гена АСЕ как маркера развития гипертонической болезни и инфаркта миокарда при диабете 2-го типа в московской популяции.
Продемонстрирована важная роль генов ренин-ангиотензиновой
системы и NOS3, регулирующих кровяное давление, в развитии сердечнососудистых заболеваний (ишемическая болезнь сердца, гипертрофическая кардиомиопатия, инфаркт миокарда, гипертония).
Практическая значимость. Разработанная нами идентификационная панель обладает разрешающей силой, гарантирующей точную идентификацию личности в популяции, размеры которой существенно превышают население РФ. Все вошедшие в ее состав полиморфные локусы могут быть успешно применены в судебной медицине для разрешения случаев спорного отцовства, ряд из этих локусов может быть гарантированно использован в криминалистической практике для анализа человеческой ДНК с целью идентификации в условиях дефицита тестируемого биоматериала и его существенной деградации.
Знание генетических факторов риска изученных в работе заболеваний должно помочь в выявлении среди населения на основании результатов анализа ДНК групп риска для последующего проведения профилактических мероприятий, в использовании дифференцированного подхода при подборе лекарственных препаратов (ингибиторы, блокаторы, стимуляторы) в зависимости от генотипа конкретного больного. Результаты данной работы должны углубить имеющуюся сумму знаний о генетических механизмах возникновения и развития мультифакторных заболеваний.
Положения, выносимые на защиту. Полиморфные мини- и микросателлитные маркеры, детектируемые с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), могут быть успешно использованы для быстрой и надежной идентификации личности на уровне ДНК. Разное число аллелей входит в состав полиморфных локусов. Как правило, в популяциях одной расовой принадлежности распределение частот аллелей по какому-либо вариабельному участку ДНК незначительно отличается друг от друга, но в разных расах характер различий часто носит существенный характер. Мини- и микросателлиты, используемые в идентикационном анализе с помощью ПЦР, должны обладать достаточно высокой информативностью и разрешающей силой, а также способностью к одинаково надежной и воспроизводимой амплификации в условиях дефицита и значительной деградации типируемой ДНК независимо от ее происхождения (кровь, слюна, сперма, корень волоса и проч.). Идентификационная панель должна включать несколько таких микро- или минисателлитов и обладать совокупной разрешающей силой, исключающей вероятность случайного совпадения генотипов по данным локусам у двух наугад взятых лиц в исследуемой популяции.
Мультифакторные заболевания возникают по ряду причин, включая и те, что имеют генетическую природу. В развитие комплексных заболеваний, к которым относятся сердечно-сосудистые нарушения, сахарный диабет и его сосудистые осложнения, Базедова болезнь и
множество других патологий, вовлечены многие гены. Для изучения ассоциации определенного гена с конкретной патологией с успехом используют подход с выбором генов-кандидатов, т.е. генов, чей продукт может быть вовлечен в развитие исследуемой патологии. В этом случае для анализа используют подходящий полиморфный маркер, лежащий внутри или рядом с анализируемым геном-кандидатом. Все использованные нами в ассоциативных исследованиях полиморфные маркеры изучены с помощью ПЦР, что обеспечивает быстроту и удобство в проведении генетического анализа. Подобные исследования позволяют определить генетические факторы риска, которые в разных популяциях могут играть заметную или, наоборот, второстепенную роль в развитии одного и того же заболевания и которые важно учитывать при разработке мер по профилактике и лечению данной патологии.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на ежегодных конгрессах Европейского общества генетики человека (начиная с 1992 г.), Балканских съездах генетиков человека (1994, 1996, 1998 г.г.), ежегодных конференциях Европейской ассоциации диабетологов и Международной федерации изучения диабета (начиная с 1997 г.), на 13-й конференции Международной ассоциации судебной медицины и криминалистики (1993), 37-м съезде биохимиков и молекулярных биологов штатов Среднего Запада (США, 1994), конгрессе HUGO "Геном человека-98", ежегодных конференциях Европейского общества кардиологов (1997, 1999).
Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 34 статьях и 6 обзорах (включая 2 зарубежные). По теме исследований также представлено 44 стендовых доклада на международных конференциях.
Структура и объем диссертации- Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы (в 5 главах), описание материалов и методов, результаты и их обсуждение (в двух главах), выводы и список литературы, насчитывающий 863 ссылки на отечественные и зарубежные публикации. Работа изложена на 351 странице и содержит 110 таблиц и 19 рисунков.
