Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Объект исследований 7
1.1.1. Краткая характеристика семейства Coccinellidae 7
1.1.2. Полиморфизм вида Adalia bipunctata 9
1.2. Особенности эволюции мтДНК насекомых 14
1.2.1. Свойства мтДНК 14
1.2.2. Различия в скорости эволюции синонимичных и несинонимичных сайтов 15
1.2.3. Филогения видов на основе изучения мтДНК 25
1.3. Изменчивость рДНК в эволюции эукариот 35
1.4. Методы филогенетического анализа 38
2. Материалы и методы 42
2.1.1. Выделение ДНК 42
2.1.2. Электрофорез 43
2.1.3. Амплификация 43
2.1.4. Получение очищенных ПЦР продуктов 44
2.1.5. Лигирование 44
2.2. Трансформация клеток Е. coli 45
2.2.1. Приготовление компетентных клеток 45
2.2.2.Трансформация компетентных клеток 45
2.2.3. Выделение плазмиднои ДНК и очистка для идентификации истинных рекомбинантов 46
2.2.4. Рестрикция рекомбинантных плазмид для установления длины вставки 47
2.3. Секвенирование 47
2.3.1. Подготовка секвенирования и фореза для секвенирования 47
2.3.2. Приготовление реакционной смеси (на одну реакцию) 49
2.4. Компьютерный анализ 50
3. Результаты и обсуждение
3.1. Анализ первичной структуры З'-области гена субъединицы I цитохромоксидазы десяти видов кокцинеллид 51
3.1.1. Клонирование и анализ первичной последовательности фрагмента гена цитохромоксидазы I десяти видов божьих коровок 51
3.1.2. Реконструкция филогении десяти видов божьих коровок 64
3.2. Исследование изменчивости нуклеотидных последовательностей участка митохондриального гена цитохромоксидазы I внутри вида Adalia bipunctata 69
3.3. Сравнительный анализ полиморфизма длин внутренних транскрибируемых спейсеров рДНК кокцинеллид 74
4. Выводы 79
5. Список литературы 80
6. Приложение 91
- Различия в скорости эволюции синонимичных и несинонимичных сайтов
- Получение очищенных ПЦР продуктов
- Рестрикция рекомбинантных плазмид для установления длины вставки
- Анализ первичной структуры З'-области гена субъединицы I цитохромоксидазы десяти видов кокцинеллид
Введение к работе
Интерес к проблеме происхождения, филогенетических взаимоотношений, видового состава жуков семейства Coccinellidae обусловлен их значительным фенотипическим разнообразием и высокой географической изменчивостью. Многие виды божьих коровок проявляют полиморфизм по окраске и рисунку на надкрыльях и переднеспинке, и существуют многочисленные данные о зависимости структуры популяций этих видов от экологических условий обитания. В то же время систематика, основанная на сравнении морфологических признаков, для многих видов кокцинеллид затруднена (Добржанский, 1924).
Нет единой точки зрения на таксономический статус видов и географических форм рода Adalia (Лусис, 1973), в частности, формы Adalia bipunctata fasciatopunctata Fald., которая обитает совместно с Adalia bipunctata bipunctata в западной части Забайкалья, Туве и Монголии. В Туве доля божьих коровок с фенотипом fasciatopunctata составляет 50%-57%, в Монголии-до 75%. В ряде работ эта форма рассматривается как самостоятельный вид (Савойская.1983; Bielawski R., 1975; Шарова, 1962), в других как подвид или географическая раса (морфа) (Кузнецов, 1993; Лусис, 1973). До настоящего времени не была изучена возможность использования молекулярно-генетических методов в исследовании центрально-азиатских адалий, отличающихся от европейских окраской надкрылий и переднеспинки.
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей в последнее время приобретает все большее распространение и признание в качестве метода для уточнения статуса групп, положение и родство которых трудно установить на основании морфологических данных. Наиболее часто в целях молекулярной систематики видов насекомых исследуются области рибосомного кластера (NTS, ITS1, ITS2), митохондриальные гены, эволюционирующие с высокой скоростью.
Использование в качестве эволюционного маркера мтДНК позволяет количественно оценить степень генетической разобщенности между родственными видами при изучении нуклеотидных последовательностей. Вместе с тем, на вопрос, какая степень различий между популяциями соответствует их принадлежности к одному виду, а какая - к разным видам, филогенетический анализ не всегда может дать ответ. В этом случае филогенетический анализ должен быть дополнен сравнительной генетикой вида (Алтухов, 2003). Целесообразно в первую очередь определить степень дивергенции мтДНК между видами семейства Coccinellidae, а также в пределах рода Adalia. При этом различия между видами в пределах рода должны быть соизмеримы с различиями между популяциями в пределах вида (Алтухов, 2003). Кроме того, определение генетических дистанций между видами и построение филогенетических деревьев, к сожалению, не позволяет определить конкретные механизмы, лежащие в основе эволюционного процесса. В рамках диссертационной работы нами была сделана попытка проведения такого исследования на основе анализа эволюционной изменчивости кластера рибосомных генов.
Цель настоящей работы состояла в изучении филогенетических связей внутри семейства Coccinellidae на основе использования участка митохондриального гена (310 пар нуклеотидов), кодирующего субъединицу I цитохромоксидазы, в частности, сравнение тувинских божьих коровок Adalia bipunctata fasciatopunctata и европейских коровок Adalia bipunctata bipunctata на молекулярно-генетическом уровне. Перед нами стояли следующие задачи:
1) амплификация, клонирование и секвенирование фрагмента гена, кодирующего субъединицу I цитохромоксидазы десяти видов (7 родов) кокцинеллид, с целью получения информации о степени вариабельности исследуемого участка мтДНК;
2) проведение филогенетического анализа для определения генетических дистанций между видами семейства Coccinellidae: Harmonia axyridis Pall., Adalia bipunctata L, Adalia decempunctata L, Coccinella quinquepunctata L, Coccinella transversoguttata Fald., Coccinella septempunctata L, Semiadalia notata Laich., Hippodamia tredecimpunctata L, Exochomus quadripustulatus L, Thea vigintiduopunctata L. амплификация, клонирование и секвенирование фрагмента гена, кодирующего субъединицу I цитохромоксидазы Adalia bipunctata, с целью получения информации о степени внутрипопуляционной вариабельности исследуемого участка мтДНК анализ эволюционной изменчивости рДНК, включающей ITS1, 5.8S и ITS2, у нескольких видов кокцинеллид.
Различия в скорости эволюции синонимичных и несинонимичных сайтов
Частота накопления мутаций в молчащих сайтах отличается от частоты накопления мутаций, приводящих к замене аминокислоты. Например, у разных рас Drosophila obscura по гену СОН вариабельность молчащих позиций (синонимичных) колеблется от 1% до 11%, а аминокислотных позиций - от 0 до 4% (Beckenbach et al., 1993). Различия в нуклеотидных последовательностях митохондриальных генов, кодирующих синтез белков у разных организмов, выражены во многих случаях в большей мере, чем в аминокислотных последовательностях кодируемых ими белков. Дивергенция нуклеотидных последовательностей в большинстве случаев выше, чем аминокислотных (Simon et al., 1994). При сравнении гена субъединицы III цитохромоксидазы двух видов дрозофил было обнаружено, что из 22 нуклеотидных замен в 3 - концевой последовательности гена протяженностью 254 п.н. лишь три замены приводят к замене аминокислотных остатков (Clary, Wolstenholme, 1987). Однако в межвидовых сравнениях гена COI гусениц листовертки - почкоеда елового (Choristoneura fumiferana) обнаружено, что число замен в значащих позициях кодонов (аминокислотных) превышает в несколько раз число замен в незначащих позициях (Sperling and Hickey, 1994). При сравнении сильно удаленных таксонов средние значения дивергенции ДНК и белков могут сравняться. Например, внутри семейства Thripidae нуклеотидная дивергенция гена COI варьирует от 17% до 21%, а аминокислотная в среднем-10%. Между двумя порядками Thysanoptera и Hemiptera средние значения дивергенции: 28% (нуклеотидная) и 27% (аминокислотная) (Simon et al., 1994). Сравнения не имеют смысла, если дивергенция превышает 30% (Liu and Beckenbach, 1992).
Особенность изменчивости синонимичных сайтов кодонов связана с тем, что митохондриальные тРНК отличаются от ядерных ослабленным взаимодействием "кодон-антикодон". Большинство из них "узнают" любой из четырех нуклеотидов в третьем положении кодона, что снижает функциональное значение синонимичного сайта и делает его еще менее подверженным отбору, чем в ядерном геноме. На примере гавайских дрозофил показано, что кривая накопления мутаций во фрагменте кодирующей последовательности с увеличением степени дивергенции сначала демонстрирует высокую скорость мутационного процесса, связанную практически полностью с накоплением синонимичных замещений, а затем резкое замедление скорости, в результате которого остаточный рост кривой соответствует только накоплению несинонимичных замещений (Митрофанов и др., 2002). В тот момент, когда количество синонимичных замещений достигает 7-10% от длины последовательности, наступает насыщение синонимичных сайтов заменами, тогда дальнейшее возникновении мутаций должно приводить к снижению уровня аденина и тимина в ДНК. Поэтому дальнейшая дивергенция происходит, вероятно, с частичным восстановлением уже имеющихся замещений за счет повторных мутаций в этих сайтах (Митрофанов и др., 2002).
Замены часто происходят в одних и тех же сайтах (в основном синонимичных) по несколько раз (множественные замены) (Fitch, 1986). Процент гипервариабельных сайтов в митохондриальных генах является характеристикой гена и изучаемого вида. В сравнительном анализе генных последовательностей ND1, ND2, ND5 из нескольких видов гавайской дрозофилы обнаружено, что количество вариабельных сайтов составляет 8% в отличие от 20% - у приматов (DeSalle et al., 1987). Это значит, что в любой момент времени большинство молчащих сайтов в последовательности ND1 у мух неспособны мутировать с высокой скоростью. Следует упомянуть, что наиболее замечательная особенность мтДНК насекомых - высокое содержание аденина и тимина. У дрозофилы доля А + Т приблизительно равна 77% (Clary and Wolstenholme, 1985). Это отклонение по нуклеотидному составу проявляется особенно в синонимичных позициях, где содержание тимина и аденина 94% для D. yakuba, но 49% для мтДНК человека. Это означает, что у насекомых, которые испытывают большой мутагенный стресс, и для которых характерна наибольшая частота генераций, имеются сдерживающие механизмы, предотвращающие высокую мутабильность мтДНК даже в молчащих сайтах. Было сделано предположение, что в любой момент времени число молчащих сайтов, способных фиксировать замены оснований в митДНК дрозофилы, небольшое, потому что большинство замен (транзиции) будут понижать содержание аденина и тимина (DeSalle et al., 1987). Вторая замена в одной и той же позиции восстанавливает первичное состояние сайта, после чего другие способны фиксировать замены. Несмотря на то, что с течением времени большинство молчащих сайтов подвергается мутациям, вариабельность мтДНК остается невысокой. Вследствие возникновения повторных замещений в филогенетических построениях возможна только приблизительная оценка генетических дистанций. Как правило, генетические дистанции оказываются заниженными (Shoemaker and Fitch, 1989). При сравнении отдаленных таксонов только медленно эволюционирующие нуклеотидные сайты могу избегать маскирующего эффекта множественных замен. В случае насыщения сравниваемых последовательностей гена повторными заменами мутации, приводящие к аминокислотным различиям, могут иметь больший вес в филогенетических исследованиях (Simon et al., 1994). Вообще, идеальный маркер должен быть свободен от обратных мутаций, которые приводят к параллельной эволюции или конвергентной эволюции. Тем не менее, неоднократные замещения вызывают иногда возврат к предыдущим состояниям сайта на несколько эволюционных шагов назад. В результате в филогенетических сравнениях наблюдается гомоплазия, которая может объясняться малым числом гипервариабельных сайтов в гене.
Получение очищенных ПЦР продуктов
Для лигирования использовали набор pGEM -Т Easy Vector System фирмы Promega. Смесь включала следующие компоненты: 2 Rapid Ligation Buffer (60 mM Tris-HCI, рН 7,8, 20 mM MgCI2, 20 Mm DTT, 2Mm ATP, 10%-ный PEG) - 5 мкл; плазмида pGEM Easy Vector (50 ng) - 1 мкл; ДНК в концентрации 0,3 мкг в мкл -З мкл; Т4 DNA Ligase (3 единицы/мкл) - 1 мкл. Для приготовления компетентных клеток был использован метод, описанный Маниатисом с соавторами (Маниатис и др., 1984). 1) Штаммом E.coli XL 2 - Blue (генотип: recA1 endA1 gyr96 fh/-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F proAB ІасРЧАШ5 Tn10(TetR) Amy CamR]) засевали 10 мл стерильной жидкой среды 2Х YT (на 1л НгО: бакто - пептон -16 г, дрожжевой экстракт - 10 г, NaCI - 5 г). Инкубировали на качалке при 37 С в течение ночи. 2) Из ночной культуры отбирали 100 мкл и переносили в 10 мкл стерильной среды YT, продолжая инкубацию в течение часа. 3) Колбу с культурой Е. coli охлаждали десять минут и центрифугировали в охлажденных центрифужных пробирках 5 минут при 4 тыс. об./мин при 0С. 5) Супернатант сливали, к осадку добавляли 5 мл стерильного водного раствора МдСІг (0.05М), встряхивали на роторе и оставляли во льду на 5 минут. 6) Центрифугировали пять минут при 0С. 7) Удаляли надосадочную жидкость. 8) Осадок ресуспендировали в 1 мл раствора охлажденного до 0С, содержащего 0,1 М СаСІ2 и 0,05 МпСЬ, и помещали в ледяную баню на 40 минут. 9) Готовые компетентные клетки разливали по 200 мкл в охлажденные пробирки.
1) В 200 мкл клеточной суспензии добавляли 5 мкл лигированной смеси. 2) Инкубировали в течение 30 минут при 0 С 3) Переносили в термостат на 42С на 2 минуты, а затем охлаждали при комнатной температуре пять минут. 4) Клетки смешивали с 1 мл YT и инкубировали при 37С в течение часа. 5) Высевали на чашки с питательной средой Agar triptose (Ferak) с селективным антибиотиком ампициллином (50 мкг/мл) и тетрациклином (15 мкг/мл). Для анализа активности маркерного гена LacZ в среду добавляли IPTG (50 мг/мл) и X-Gal (50 мг/мл). Чашки помещали в термостат на 37С на ночь. 1) Отбирали рекомбинантные белые колонии и пересевали штрихом на новые чашки (по 8 колоний на чашку). 2) С каждого сектора прокаленной петлей отбирали клеточную массу и суспендировали в 200 мкл раствора БАК 1. 3) В эппендорфы с клеточной суспензией струей вливали 400 мкл лизирующего раствора БАК 2, затем их кипятили 40 секунд и охлаждали. 4) Плазмидную ДНК осаждали центрифугированием при 10 тыс. об./мин при комнатной температуре. 5) Стерильной деревянной палочкой удаляли осадок из раствора. 6) В супернатант добавляли 10%-ный SDS (додецил-сульфат натрия) до 1% и инкубировали при 65 С 45 минут. 7) Добавляли 1/7 объема ЮМ ацетата калия и инкубировали в ледяной бане 30 минут. 8) Центрифугировалитечение 10 минут при 10 тыс. об/мин. 9) Отбирали супернатант. 10) Добавляли равный обьем хлороформа.
11) ДНК осаждали 96%-ным изопропиловым спиртом, промывали 70% -ным этанолом, высушивали при 37% и растворяли в 50 мкл воды. В работе были использованы рестрикционная эндонуклеаза (рестриктаза) и буфер фирмы "Fermentas". Рестрикцию проводили в объеме 20 микролитров. Состав реакционной смеси включал: буфер (10х) 2мкл; плазмидная ДНК -10 мкл; деионизованная вода - 6 мкл; фермент EcoRI (5 ед. в мкл) - 2мкл. Секвенирование проводили "автоматическим" способом в циклическом режиме на приборе ABI PRISM 310 и "ручным" способом. Было использовано несколько клонов на каждый вид. 1) Готовили стекла (ширина 26 см и длина 60) для заливки геля. Мыли пластины в растворе детергента, ополаскивали сначала водопроводной, а затем деионизированной водой. После сушки покровное стекло с ушками обрабатывали bind-silane. Перед обработкой смешивали 4 мл этанола, 1 мл 90%-ной уксусной кислоты, 15 мкл bind-silane и наносили равномерно этот раствор на стекло, протирая всю поверхность пластины. После полировки стекло подсушили. Основное стекло обрабатывали раствором repel-silane (2 мл 96%-ный этанол и 1 мл repel-silane) таким же образом. 2) Клали более крупную пластину на стол и размещали по ее краям спейсеры. Сверху располагали меньшую пластину с ушками. 3) Готовили 6%-ный акриламидный гель. Смешивали 5,7 г акриламида, 0,3 г N,N -метиленбисакриламида, 42 г мочевины, 10 мл 10ХТВЕ и воду до 100 мл. 4) К 100 мл 6%-ного акриламидного геля добавляли 200 мкл 25%-ного аммония персульфата и 100 мкл TEMED, размешивали и быстро выливали смесь в пространство между пластинами. 5) Немедленно вставляли гребенку. Основания зубцов располагались немного выше верха стеклянной пластины. Стекла закрепляли зажимами. 6) После того, как проходила полимеризация акриламида (примерно 1 час) при комнатной температуре, удаляли гребенку и споласкивали лунки водой и буфером. 7) Прикрепляли стекла вертикально к электрофоретической камере прибора Macrophor Elecrophoresis Unit. В нижний и верхний резервуары наливали буфер ТВЕ (1х). Лунки осторожно промывали буфером из верхней камеры. Подсоединяли электроды к источнику питания. Температура фореза составляла 50С. 8) Вносили микропипеткой краску (бромфеноловый синий и ксиленцианол). Префорез гнали час при 700 В. 9) Перед нанесением реакционные смеси прогревали 2 минуты при 70С. Наносили пробы ДНК по 3 мкл в каждую лунку. Основной прогон осуществлялся два часа при 1500 В.
Рестрикция рекомбинантных плазмид для установления длины вставки
Интересно, что между видами Semiadalia notata и Hippodamia tredecimpunctata, практически неразличимыми в природе и обитающими в сходных экологических условиях, значение нуклеотидной дивергенции составляет 10%. Отношение транзиций к трансверсиям составляет 1,2 . Эти виды относятся к разным родам, которые входят в подтрибу Hippodamiini. Можно сказать, что показатели нуклеотидной изменчивости между семиадалией (Semiadalia notata) и тринадцатиточечной коровкой (Hippodamia tredecimpunctata) сходны с показателями между семиточечной (Coccinella septempunctata) и пятиточечной (Coccinella quinquepunctata) коровками. Однако, при изучении аминокислотной изменчивости С-концевого участка COI оказывается, что Semiadalia notata и Hippodamia tredecimpunctata гораздо ближе между собой, чем виды одного рода Coccinella (семиточечная и пятиточечная коровки).
Интересно, что обнаруженное нами количество мутаций в значащих сайтах кодонов, приводящих к замене аминокислот в белке, значительно превышает (примерно в 2 раза) данный показатель, выявленный ранее в других частях гена субъединицы I цитохромоксидазы. Данный факт подтверждает предположение о том, что концевые области гена являются наиболее вариабельными, что обусловлено разной степенью функциональной нагрузки различных участков COI.
Дополнительно к изучению вариабельности фрагмента гена субъединицы I цитохромоксидазы нами была поставлена задача выясненить филогенетические отношения в семействе Coccinellidae. Для этой цели были построены филогенетические деревья дистанционным методом и парсимонией. Прежде чем приступить к анализу, следует оговориться, что ни один из существующих способов реконструкции филогении по результатам анализа первичной структуры генов или белков не гарантирует нам построения деревьев, отражающих без
искажений реальные события эволюции. Деревья, построенные разными методами, могут не совпадать. Хотя число видов невелико, а длина исследуемой области мтДНК составляет всего 310 нуклеотидов, и, возможно достоверность выводов не является высокой, ряд наблюдений этой работы имеет подтверждение в публикациях других авторов (Howland and Hewitt, 1995; Schulenberg et al., 2001). Например, при изучении ITS 1 области рДНК (Schulenberg et al., 2001) вопрос молекулярной филогении божьих коровок решается на достаточно большом объеме фактического материала. Древо, построенное на основе сравнения нуклеотидных последовательностей рДНК, имеет сходство с деревьями, построенными нами на основе сравнения мтДНК.
В первую очередь нами было проведено изучение филогенетических связей кокцинеллид на межродовом уровне (рис. 9, 10). За внешнюю группу был взят вид Donacia provosti семейства Chrysomelidae (GenBank AY232543). Филогенетические деревья, построенные дистанционным методом, имеют максимальное сходство по топологии, хотя поддержка бутстрэп - анализом некоторых узлов различается. С высокой поддержкой 98% индекса бутстрэпа расходится группа жуков из подсемейства Coccinellinae: двадцатидвухточечная божья коровка Thea vigintiduopunctata L. (мицетофаг, относится к трибе Psylloborini) и представители трибы Coccinellini (афидофаги). Их расхождение представляется, однако, гораздо более недавним событием, чем радиация ветви кокцидофагов (подсем. Chilocorinae) от общего предка (внешней группы). Таким образом, результатами анализа нуклеотидных последовательностей гена COI подтверждается филогенетическое родство мицетофагов и афидофагов и их удаленность от представителей подсемейства Chilocorinae.
На следующем этапе работы филогенетические деревья были построены для десяти видов божьих коровок. Местоположение основных таксонов на филогенетическом древе не меняется при использовании методов Neighbor-Joining (рис. 11) и парсимонии (рис. 12). Филогенетические схемы родства божьих коровок в целом соответствуют древу, построенному на основании морфо-экологических критериев [Majerus, 1994], а также совпадают с дендрограммой, полученной в результате сравнения первичной структуры ITS1 кокцинеллид [Schulenburg et al., 2001]. Изученная нами последовательность оказалась хорошим маркером на уровне подсемейств, представленных как родами, близкими морфологически и генетически, так и дальними родами. Так, практически не существует четких морфологических признаков, отделяющих роды Semiadalia и Hippodamia. Результаты анализа молекулярно- генетических данных четко дифференцируют эти таксоны. Тем не менее, они оказываются наиболее родственными по сравнению с другими членами семейства. Эти результаты не удивляют, поскольку роды Semiadalia и Hippodamia входят в подтрибу Hippodamiini.
Полученные нами данные позволили выявить филогенетические связи внутри рода Coccinella. Вид Coccinella quinquepunctata значительно удален от других представителей рода Coccinella. Морфологически он имеет также наименьшее сходство с Coccinella transversoguttata и Coccinella septempunctata. Виды трибы Coccinellini, являющиеся афидофагами, образуют монофилетичную группу, значительно удаленную от представителя трибы Chilocorini, вида-кокцидофага Exochomus quadripustulatus. Вид Thea vigintiduopunctata L, являющийся мицетофагом (триба Psylloborini), филогенетически близок к трибе Coccinellini.
Анализ первичной структуры З'-области гена субъединицы I цитохромоксидазы десяти видов кокцинеллид
Известно, что мтДНК характеризуется сравнительно высокой степенью эволюции нуклеотидных последовательностей в отличие от ядерной ДНК. Это дает нам возможность сравнивать близкородственные таксоны насекомых (виды, подвиды). Митохондриальная ДНК является чувствительным индикатором к воздействию демографических процессов на популяции. На структуру популяций могут оказывать влияние в различной степени определенные эволюционные процессы, такие как обмен генами между популяциями, вымирание субпопуляций, миграции и соответственно эффект основателя, прохождение популяций через "горлышко бутылки". Последний фактор обладает наиболее жестким воздействием на изменчивость митохондриальной ДНК как маркера генетической структуры групп организмов. Он сказывается на степени полиморфизма нуклеотидных последовательностей, и скорость снижения полиморфизма этого маркера в случае недавнего события прохождения через «бутылочное горло» будет высокой. При этом последующий рост численности популяции может предотвратить полную элиминацию вариабельности мтДНК. Обмен генами играет также существенную роль в эволюции вида. В случае, если имел место интенсивный обмен генами между популяциями, то вероятность низких значений генетических дистанций в анализе структуры популяций будет высокой.
До последнего времени оставался спорным таксономический статус центрально - азиатских популяций Adalia bipunctata, которые имеют особый тип полиморфизма (f. fasciatopunctata), отличающего "азиатских" адалий по окраске и рисунку переднеспинки и надкрылий от других форм этого вида. Нами был проведен анализ на молекулярно - генетическом уровне двух наиболее удаленных популяций адалий - из Италии и Тувы (рис. 13, 14). Выборка из тувинской популяции была представлена жуками форм f. bipunctata и fasciatopunctata. Кроме того, для сравнения мы использовали нуклеотидные последовательности образцов из Болгарии и Санкт-Петербурга и одного из Москвы. Последний получен из базы данных GenBank (AJ313070).
Полученные данные свидетельствуют о том, что среди жуков A. bipunctata из разных популяций преобладает один вариант мтДНК, названный нами "типичным", который был выявлен у 16 особей из 27 и найден в популяциях Италии, Москвы, Санкт-Петербурга, Тувы. Всего было обнаружено 12, вариантов (мт-гаплотипов), представленных в основном единичными особями, причем девять из этих вариантов отличаются от типичного по одной - двум заменам. Два гаплотипа - 25 и 26 - оказались наиболее отличающимися. Первый был найден в Туве, второй - в Болгарии. Отличие этих вариантов от типичного составляет - 11 нуклеотидов (3,6%) и , 9 нуклеотидов (3%) соответственно, что, однако, значительно меньше,
чем различия между A. bipunctata и A. decempunctata (24 нуклеотида - 7%). Сопоставление внутри и межвидовой изменчивости внутри семейства Coccinellidae, описанное в главе 3.1.1, позволяет сделать вывод, что генетическая изменчивость участка гена субъединицы I цитохромоксидазы вида A. bipunctata соответствует показателям внутривидовой изменчивости.
Ранее была проведена работа по изучению генетического состава популяций
Л. bipunctata из Европы и Азии с использованием участка (600 п.н.) гена субъединицы I цитохромоксидазы (Schulenburg et al., 2002). В Туве была изучена одна особь Л. bipunctata. Результаты, полученные по европейским популяциям Шуленбургом и его коллегами, имеют сходство с результатами, полученными нами по Туве. Во - первых, практически во всех точках сбора кокцинеллид обнаруживается один и тот же вариант мтДНК - "типичный", а также варианты, отличающиеся от него на незначительное количество замен (0,09 - 0, 3% различий). Во - вторых, в тех же популяциях встречается митотип, отличающийся от типичного на значительное количество замен (5% различий). Авторы предполагают, что этот сильно дивергентный митотип является предковым (плезиоморфным) вариантом мтДНК (Schulenburg et al., 2002).
Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей части белка субъединицы I цитохромомкидазы выявил единичные замены аминокислот (рис. 14) как между популяциями, так и внутри популяций.
Таким образом, несмотря на резкие морфологические различия особей из европейских и центрально - азиатских популяций A. bipunctata, а также географическую удаленность исследованных популяций и принадлежность к разным климатическим зонам, характер изменчивости мтДНК не позволяет четко их дифференцировать.
Сложно назвать причины низкого генетического разнообразия внутри вида A. bipunctata. Можно сказать, что расхождение двух географически удаленных популяций является недавним событием (до 1 млн. лет) по сравнению с расхождением A. bipunctata и A. decempunctata. Возможно, что время независимого существования A. bipunctata fasciatopunctata и A. bipunctata bipunctata мало для того, чтобы популяции накопили изменения, дифференцировавшие их по генетическим признакам.
Нами показано, что характер выявленного в природных популяциях полиморфизма мтДНК отражает общее состояние видообразования комплекса близких форм A. bipunctata, которые образуют цепь географически замещающих популяций подвидового ранга, не изолированных строго друг от друга генетическими механизмами. Полученные данные еще раз подтверждают выводы, полученные ранее на основе генетического анализа, что нет оснований придавать форме fasciatopunctata видовой ранг [Лусис, 1973].
