Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Миксоплоидность соматических клеток у растений 9
1.1.1. Миксоплоидность соматических клеток у сахарной свеклы 11
1.2. Миксоплоидность генеративных клеток у растений 12
1.2.1. Миксоплоидность генеративных клеток у сахарной свеклы 14
1.3. Содержание ДНК в ядре 15
1.4. Связь между размером клетки и плоидностью , 17
1.5. Способы изучения миксоплоидности клеточных популяций 19
1.6. Миксоплоидия и репродуктивные признаки растений 21
1.6.1 Миксоплоидия и апозиготический способ репродукции растений 22
1.6.2 Миксоплоидия и экспрессия признака сростно-раздельноцветковости у сахарной свеклы , 29
1.6.2.1. Наследование признака сростно-раздельноцветковости 29
1.6.2.2. Связь миксоплоидии и признака сростно-раздельноцветковости 32
2. Материалы и методы 34
2.1. Материалы 34
2.2. Методы исследования 35
2.2.1. Цитогенетические методы 35
2.2.2. Экспериментальное изменение миксоплоидности клеточных популяций , 38
2.2.3. Апозиготический способ получения семян у сахарной свеклы 38
2.2.4. Наблюдение за динамикой цветения и формированием цветоносных побегов 39
2.2.5. Статистические методы 40
3. Результаты 42
3.1. Содержание ДНК в ядрах клеток 42
3.2. Изменчивость числа хромосом и числа ядер в клетках 47
3.3. Влияние способа репродукции, длительности жизненного цикла, обработки растений колхицином, 5-азацитидином на миксоплоидность клеточных популяций 50
3.3.1. Влияние инбридинга и гибридизации на миксоплоидность клеточных популяций 50
3.3.2. Влияние длительности жизненного цикла и обработки колхицином на миксоплоидность клеточных популяций 54
3.3.3. Влияние апозиготического способа репродукции, обработки растений колхицином и 5-азацитидином на миксоплоидность клеточных популяций 58
3.4. Влияние способа репродукции, обработки растений колхицином,
5-азацитидином на репродуктивные признаки растений 64
3.4.1. Влияние обработки 5-азацитидином на динамику цветения и формирование цветоносных побегов у растений сахарной свеклы . 64
3.4.2. Влияние способа репродукции растений, обработки колхицином и 5-азацитидином на признак раздельно-сростноцветковости у сахарной свеклы 67
3.4.3. Влияние способа репродукции растений, обработки колхицином на способность растений сахарной свеклы завязывать семена апозиготическим способом 70
4. Обсуждение 73
Выводы 79
Цитируемая литература 81
- Миксоплоидность соматических клеток у сахарной свеклы
- Миксоплоидия и экспрессия признака сростно-раздельноцветковости у сахарной свеклы
- Влияние способа репродукции, длительности жизненного цикла, обработки растений колхицином, 5-азацитидином на миксоплоидность клеточных популяций
- Влияние обработки 5-азацитидином на динамику цветения и формирование цветоносных побегов у растений сахарной свеклы
Введение к работе
Покрытосеменные растения - это многоклеточные организмы и многие признаки растений определяются изменчивостью клеток в клеточных популяциях. К числу вариабельных относятся такие признаки как число ядер в клетке (одно- или многоядерность), число геномов на ядро (полиплоидия), число копий хроматид в хромосомах (политения) и др. Изменчивость признаков клеточного уровня оказывает влияние на изменчивость признаков организменного уровня, к числу которых относится и репродуктивные признаки растений.
Закон постоянства числа хромосом в ядрах клеток был сформулирован в конце XIX века Флеммингом и Рабле (Вермель Е.М.,1970). Однако в этом законе речь идет не о строгом постоянстве числа хромосом в ядрах, а о доминирующей по числу хромосом фракции в специализированных или неспециализированных клетках. В клеточных популяциях наряду с доминирующей фракцией встречаются клетки, где число хромосом в ядрах меньше или больше их основного числа. Первые данные о миксоплоидии у растений были представлены в 1910 г. Немецом (Р.Ригер, А.Михаэлис, 1967). В последующие 15-20 лет были получены многочисленные свидетельства о миксоплоидии у различных видов. В обзоре Лусса приводится данные о 20 ботанических родах, у которых это явление к тому времени было обнаружено (ЛуссА.И., 1935). В современном понимании миксоплоидия -явление, когда в клеточной популяции наряду с доминирующей фракцией клеток с основным числом хромосом, встречаются фракция клеток, у которых число хромосом в ядрах меньше или больше их основного числа. Миксоплоидия клеточных популяций может быть как с эуплоидным, так и с анеуплоидным числами хромосом в ядрах. Таким образом, термин миксоплоидия покрывает все типы хромосомного мозаицизма, у которых гетерогенность между различными клетками включает в себя различия в хромосомном наборе. В данной работе речь будет идти только об эуплоидной миксоплоидии, т.е. о той форме миксоплоидии, с которой началась история этого термина.
Один из путей возникновения миксоплоидности клеток - эндомитоз. В частности, если редупликация хромосом у диплоидного ядра не сопровождается кариокинезом, то в клеточных популяциях могут возникать эндополиплоидные клетки, у которых число хромосом кратно увеличено по сравнению с основным набором. В этом случае в популяциях меристем наряду с диплоидными клетками будут встречаться клетки с тетраплоидным числом хромосом в ядрах и клетки
других более высоких уровней плоидности. Второй путь возникновения миксоплоидности клеток - редукция числа хромосом в соматических клетках. Если кариокинезу не предшествовала фаза удвоения числа хромосом в ядрах, то в клеточных популяциях диплоида могут встречаться гаплоидные клетки. Таким образом, на уровне клеточных популяций имеет место изменчивость числа геномов на клеточное ядро или эпигеномная изменчивость клеточных популяций (ОленовЮ.М., 1970).
Геномная изменчивость присутствует на разных уровнях развития живых организмов. «Низшие организмы существуют на гаплоидном уровне организации их наследственной субстанции. Однако уже здесь при слиянии отдельных особей друг с другом на короткий период возникает диплоидия и создается возможность использовать те преимущества, которые она дает. Переход же к диплоидному состоянию знаменовал собой прогрессивное развитие органических форм. На высших этапах эволюции гаплоидны только гаметы, а весь цикл онтогенетических преобразований протекает на диплоидном уровне» (Р.Л Берг, 1993, с. 100). Итак, миксоплоидия клеток наблюдается на разных уровнях эволюции живого мира. Она характерна как низшим, так и высшим организмам. Что касается покрытосеменных растений, то для них само явление миксоплоидии универсально и наблюдается на разных уровнях организации растения. У диплоидных растений гаметофиты гаплоидные, меристемы диплоидные, а в дифференцированных тканях наблюдается полиплоидизация клеток (полисоматия).
Следует отметить, что эволюция растений идет в значительной мере путем смены уровней плоидности геномов с помощью как полиплоидизации, так и деполиплоидизации в пределах биологически оптимального уровня плоидности. Через полиплоидизацию достигается экологически оптимальный уровень плоидности, способствующий преодолению трудностей в распространении вида и удерживанию им освоенных территорий. Однако прогрессивная эволюция внутри семейства обычно идет на минимально возможном числе хромосом - эволюционно оптимальном уровне плоидности (Хохлов С.С, 1965).
Наиболее интересной для исследователя является изучение миксоплоидности в меристематических тканях, поскольку большинство структур зрелого растения формируются после эмбриогенеза с помощью многократного деления меристематических клеток (недифференцированных). Идентичность структур, продуцируемых апикальными меристемами, изменяется во время развития. В раннем развитии апикальными меристемами побегов продуцируются
6 вегетативные (листовые) структуры, тогда как позднее - репродуктивные структуры. Относительно позднее расхождение вегетативных (соматических) и цветочных (репродуктивных) клеточных поколений позволяют наследственным изменениям, которые имеют место во время соматического развития, передаться последующим поколениям (Richards E.J.,1997). Кроме того, судьба клеток детерминируется их конечным положением в растении, а не ее историей. Впервые это предположение было высказано Вохтингом в XIX веке и подтверждено современными исследованиями (S. Poething, 1989).
Таким образом, не имеет значения, из какой части растения будут взяты меристемы для изучения миксоплоидности. Это исследование даст общую картину изменчивости клеточных популяций всего растения. Необходимость изучения именно меристематических клеток связана с особой ролью их в развитии растения. Во-первых, как было сказано выше, большинство структур зрелого растения формируются после эмбриогенеза из меристем, а, во-вторых, зародышевые клетки у растений происходят из точек роста (меристемы), которые в свою очередь возникают в участках уже дифференцированной ткани (Р.Ригер, А.Михаэлис, 1967). Очевидно, если у растения повышается уровень миксоплоидности клеточных популяций, то возрастает вероятность попадания полиплоидных клеток в зародышевый путь и формирование полиплоидных мега- и микроспор, в частности, мега- и микроспор с соматическим числом хромосом. Идея о связи миксоплоидии и формирования гамет с соматическим числом хромосом была высказана Луссом в обзоре, посвященном вегетативным мутациям (Лусс А.И., 1935): «Вполне вероятно, что у многих растений, у которых частым случаям хромосомальных аберраций в соматических клетках сопутствует не менее частые нарушения в генеративных, -последние (в частности, частое образование диплоидных гамет) в значительной степени служат выражением первых, хотя по морфологии цветка причинную связь здесь обычно не удается установить». Сегодня эта тема, формирование гамет с соматическим числом хромосом, интенсивно развивается во всем мире.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы было изучение изменчивости клеточных популяций растений, а точнее, изучение миксоплоидии у сахарной свеклы, а также исследование некоторых вероятных причин ее возникновения. Описание изменчивости клеточных популяций по уровню плоидности геномов позволяет изучать связь миксоплоидии с различными фенотипическими признаками растений, в частности, с изменчивостью репродуктивных признаков, имеющих, как
известно, большое значение в селекции. Связь цитогенетических характеристик генома с различными признаками растений - одна из основных задач цитогенетики. В соответствии с этим в исследовании были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать изменчивость клеточных популяций по числу ядер в клетке (одно- и
многоядерность).
2. Исследовать изменчивость клеточных популяций по числу геномов на ядро
(миксоплоидия).
3. Оценить роль способов репродукции (гибридизация, инбридинг, апозиготия) на
миксоплоидность клеточных популяций.
Разработать косвенные методы описания миксоплоидии клеточных популяций.
Разработать экспериментальные методы изменения уровня миксоплоидии
клеточных популяций.
6. Исследовать связь уровня миксоплоидии с репродуктивными признаками j
растений: а) завязываемостью семян апозиготическим способом (партеногенез);
б) временем вступления растений в фазу цветения; в) формированием
различных типов цветоносных побегов растениями ("цветущие", "упрямцы",
"холостяки"); г,) вариацией числа цветков в частных соцветиях у свеклы.
Научная новизна. Впервые показано, что инбридинг приводит к повышению уровня миксоплоидии, а гибридизация (свободное опыление) - к ее снижению. Линии склонные к партеногенетическому завязыванию семян (апозиготия) имеют более высокий уровень миксоплоидности клеточных популяций, чем линии, размножающиеся путем перекрестного оплодотворения. Впервые показано, что эпимутаген 5-азацитидин снижает уровень миксоплоидности клеточных популяций у растений сахарной свеклы.
Практическая ценность. В работе показана связь признаков клеточного уровня с репродуктивными признаками растений. Разработан метод повышения доли гамет с соматическим числом хромосом. Экспериментально повышая миксоплоидность клеточных популяций можно получать растения, формирующие 2п гаметы с достаточно высокой частотой. Предложены различные способы изучения миксоплоидии. В работе также показана связь эпигенетической изменчивости, миксоплоидии с репродуктивными признаками растений: длительность периода
вегетации, время вступления растения в фазу цветения и склонность растений к партеногенетическому формированию семян (апозиготия).
Апробация работы. Результаты работы докладывались на российских и международных конференциях: научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.Л. Мазлумова, Рамонь, 1996; XXXVI Международной научной студенческой конференции, Новосибирск, 1998; 2-м съезде ВОГиС, Санкт-Петербург, 2000; Mendel Centenary Congress, Brno, 2000; XVIIth International Congress on Sexual plant reproduction, Lublin, 2003.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Выводы. Работа изложена на 108 старницах машинописного текста и содержит 14| таблиц, 17 рисунков, 5 фотографий, 12 приложений. Библиографический указатель включает 125 источников.
Миксоплоидность соматических клеток у сахарной свеклы
Миксоплоидность клеточных популяций - очень распространенное явление в растительном мире и сахарная свекла в данном случае не является исключением. Более того, в семействе Chenopodiaceae было отмечено высокая частота встречаемости этого явления (Wuff H.D., 1936, цит. по Gentcheff G., Gustafson А., 1939). Первые данные о миксоплоидии для рода Beta были представлены Сиротиной М. в 1932 году, а для сахарной свеклы {Beta vulgaris) - Харечко-Савицкой Е.И. в том же году (Лусс А.И., 1935). В дальнейшем Е.И.Харечко-Савицкой были проведены более детальные исследования этого явления. Она наблюдала миксоплоидность клеточных популяций в корешках сахарной свеклы. Было показано, что образование тетраплоидных ядер в соматических тканях происходит путем слияния двух диплоидных ядер в интерфазе между двумя делениями. А двухъядерные клетки возникают вследствие того, что деление ядра не сопровождается делением клетки. Хромосомные аберрации возникали в самых разных тканях корня и наблюдались самые различные сочетания диплоидной и тетраплоидной ткани. Наиболее часто встречалось комбинирование тканей различных кариотипов, представляющее собой беспорядочное чередование отдельных клеток или небольших участков ткани с различным кариотипом. Иногда это явление затрагивало непосредственно точку роста молодого побега. При отсаживании такого побега развивалось полиплоидное растение (Харечко-Савицкая Е.И., 1940).
Кроме того, было показано, что способность к удвоению хромосом передается по наследству, а возникновение полиплоидных форм связано с генетическими особенностями растений. При скрещивании между собой миксоплоидных (химерных) форм растений в F2 доля миксоплоидов существенно возрастает (до 50-60%), однако многие миксоплоидные растения оказываются полностью стерильными (Харечко-Савицкая Е.И., 1940). В данном случае хотелось бы отметить, что при исследовании способности растений сахарной свеклы формировать яйцеклетки с соматическим числом хромосом, было показано, что у стерильных форм диплоидной свеклы это явление наблюдается существенно чаще, чем у фертильных. Также было показано, что триплоиды дают выход 2п гамет выше, чем диплоиды, и на этот процесс оказывает влияние не только условия года, но и генотип растений (Бормотов В.Е., Загрекова В.Н. 1978). По-видимому, стерильность растений и миксоплоидия клеточных популяций коррелируют между собой, поскольку являются следствием одного или одних и тех же нарушений при делении клеток. Это связано с тем, что миксоплоидия и полиплоидия имеют в своей основе одну природу, и поэтому приводят к одним и тем же нарушениям.
Как было отмечено выше, эволюция растений идет в значительной мере путем смены уровней плоидности через процессы как полиплоидизации, так и деполиплоидизации (Хохлов С.С, 1965). Возможно, что миксоплоидия есть отражение этих процессов или же является «механизмом», с помощью которого эти процессы реализуются.
Принято считать, что у диплоидных растений (2п) гаметофиты всегда гаплоидны (п). Однако нередуцированные гаметы с соматическим числом хромосом в популяциях покрытосеменных растений довольно часты. Харлан и де Вит приводят список 85 родов, у которых встречаются диплоидные гаметы (Harlan J.R., de Wet J.M.J., 1975). Френкель перечисляет 31 семейство, у отдельных видов которых обнаружены гаметы с соматическими числами хромосом (Frenkei R., 1975). Кроме того, многие авторы, исследовавшие эту проблему, отмечают, что образование нередуцированных гамет у покрытосеменных растений - явление не случайное, а имеет общебиологическое и эволюционное значение (Малюта Э.Н., 1984; Frenkei R., 1975). Таким образом, когда популяция гамет растения представлена не только доминирующей фракцией гаплоидных гамет, но и гаметами с соматическим числом, то мы наблюдаем миксоплоидию в генеративной ткани.
Нередуцированные гаметы могут возникать в результате отклонений нормального хода как первого, так и второго деления мейоза. Известно, что мейотические нарушения коррелируют с нарушениями в митозе: «... у многих растений частым хромосомным нарушениям в соматических клетках (миксоплоидия) сопутствуют не менее частые нарушения в генеративных, в частности, образование диплоидных гамет. По-видимому, полиплоидные клетки или сектора, образовавшиеся в диплоидном растении, попадают в генеративную сферу, приводя к образованию 2п гамет путем мейотического деления тетраплоидных клеток, т.е. 2п гаметы могут быть проявлением миксоплоидности соматических клеток (ЛуссА.И., 1935, с.267). Возможность попадания полиплоидной соматической клетки в зародышевый путь связана, с тем, что: 1)у растений, в отличие от животных, наблюдается относительно позднее расхождение процессов развития зародышевых и соматических клеток; 2) зародышевые клетки у растений происходят из точек роста (меристем), которые в свою очередь могут возникать в участках уже дифференцированной ткани (Р.Ригер, А.Михаэлис, 1967; Richards E.J.,1997). Таким образом, во-первых, наследственные изменения, которые имеют место во время соматического развития, могут передаться последующим поколениям; во-вторых, полиплоидная (тетраплоидная) клетка, являющаяся результатом миксоплоидности соматической ткани растения, может попасть в зародышевый путь, пройти мейоз и дать диплоидную гамету. С увеличением уровня миксоплоидности клеточных популяций вероятность образование мега- и микроспор с соматическим числом хромосом повышается.
Итак, формирование гамет с соматическим числом хромосом - широко распространенное явление. Однако факторы, провоцирующие возникновение этого явления могут быть различными. У белого люпина обнаружено образование 2п яйцеклеток в результате: а) удвоения числа хромосом в мегаспоре (удвоенные мегаспоры), б) в результате удвоения числа хромосом в части соматических клеток. Во втором случае в местах с удвоенным числом хромосом возникают редуцированные 2п гаметы, т.е. гаметы сформировавшиеся из тетраплоидных клеток, прошедших мейоз. (Kazimierski Т., Kazimierska Е.М., 1994).
Миксоплоидия и экспрессия признака сростно-раздельноцветковости у сахарной свеклы
Одноростковость посевных единиц - один из важных хозяйственно полезных признаков сахарной свеклы, поскольку многоростковость свеклы сильно повышает трудоемкость и затратность выращивания сырья для сахарной промышленности. Впервые работа по одноростковой свекле была начата в США в самом начале прошлого века и диктовалась сугубо прагматическими соображениями: найти доноры признака раздельноцветковости (РЦ признак) с тем чтобы получать сорта, не требующие затрат ручного труда при формировании густоты насаждения в посевах. Американский генетик и селекционер Таунсенд (пионер генетического и селекционного исследования РЦ признака), подводя итоги своих десятилетних исследований, писал: «Сахарная свёкла может образовывать одноростковые плоды вместо многоростковых - экономию труда можно оценить в несколько миллионов долларов» (Townsend CO., 1915). Им была показана эффективность отбора по РЦ признаку, но получить константный материал (донор РЦ признака) и тем более передать такой материал для использования его в селекции, ему не удалось. В 1920-1930-е годы аналогичные результаты получили и европейские исследователи (Barocka К.Н., 1959; 1960).
Одно- и многоростковсть тесно связаны с РЦ-СЦ признаками раздельно-цветковости. Одно- и многоростковость посевных единиц свеклы связаны с различными биологическими явлениями: а) односемяпочковостью (ОСП) и многосемяпочковостью (МСП); б) раздельно- и сросноцветковостью (РЦ и СЦ признаки); одно и многозародышевостью.
Классификацию растений удобнее начать с описания закладки цветков. У СЦ-растений первый цветок в соцветии-клубочке формируется из меристематической ткани цветоносного побега, а последующие - из ткани цветоложе первого цветка. «Из меристемы первого цветоложе в итоге могут возникнуть два-четыре новых цветоложа, прикрепленных к общей цветоножки. Все ткани такого соцветия развиваются одновременно, а основания завязей всех цветков крепятся к одной цветоножке, образуя соцветие-клубочек» (Savitsky H.I., 1950, р. 160). Из сросшихся цветков-клубочков образуются сросшиеся плоды -соплодия-клубочки. Поскольку в каждом из плодиков, входящих в клубочек, заключено семя, то из одной посевной единицы вырастают несколько проростков.
У раздельноцветковых растений возможны два пути формирования многоростковости: многосемяпочковость и многозародышевость. Многосемя-почковость - формирование в цветках нескольких семяпочек у растений, у которых в норме должна закладываться только одна семяпочка. Многозародышевость - возникновение нескольких эмбрионов внутри одного семени (синоним - полиэмбриония). Лишь РЦ растения с односемяпочковыми цветками формируют одноростковые плоды. Но даже при этом возможен небольшой процент двухростковости вследствие полиэмбрионии (многозародышевость). Таким образом, чтобы получить одноростковые растения нужно совместить в генотипе следующие признаки: раздельноцветковость, односемяпочковость, однозародышевость.
Постижение природы наследования РЦ-СЦ признаков у свеклы оказалось крайне запутанной на протяжении всего периода их исследований. Изменчивость РЦ-СЦ признаков в популяциях - пример эпигенетической изменчивости, о чем прежде исследователи не догадывались. Вывод об эпигенетической природе наследования РЦ-СЦ признаков у свеклы можно сделать, осматривая эту проблему с высоты сегодняшнего знания, тогда как источники литературы свидетельствует о неоднозначности интерпретаций генетических экспериментов (Малецкий СИ. и др, 1988; Maletskli S.I., 1999). С современной точки зрения, очевидно, что успеху в получении константных форм по РЦ признаку в первой трети XX века «помешало» отсутствие знаний в области эпигенетики (Малецкий СИ., 2004).
Впервые РЦ доноры для селекции были получены советскими селекционерами, проведших в начале 1930-х годов массовое обследование семенных высадков сахарной свеклы с целью выявления растений с одиночными цветками на побегах. Среди просмотренных 22 млн. растений было выявлено 109 с той или иной степени, проявляющих РЦ признак (Орловский Н.И., 1957), что позволило в дальнейшем осуществить подлинный технологический прорыв в свекловодстве, создав сорта и гибриды одноростковой свеклы. Первое генетическое изучение РЦ признака провела М.Г. Бордонос и показала рецессивность и моногенность наследования этого признака (Бордонос М.Г. 1938; 1939; 1941). Опыты М.Г. Бордонос в 1950-х годах были повторены В.Ф. Савицким в США на основе материалов, найденных им в американских популяциях. До войны В.Ф. Савицкий заведовал отделом генетики свеклы во Всесоюзном НИИ сахарной свеклы, г. Киев. Он подтвердил прежние выводы своей сотрудницы М.Г. Бордоносо моногенности и рецессивности наследования РЦ признака (Savitsky V.F., 1952), Если бы данные о наследовании РЦ признака М.Г. Бордонос и В.Ф. Савицкого были исчерпывающими, то у селекционеров, работающих с одноростковой свеклой, не должно было быть проблем в практической работе, поскольку моногенная схема наследования признаков относится к числу самых элементарных и удобных в практической работе. Однако на практике получалось иначе: как в селекционных, так и в генетических экспериментах наследование РЦ признака часто не соответствовало модели наследования, предложенной М.Г. Бордонос и В.Ф. Савицким. Работа немецкого генетика Э. Кнаппа в 1960-е годы «смутила» многих селекционеров и генетиков своими выводами (Knapp Е. 1967). Из его результатов следовало, что моногенность отчасти присуща лишь американскому донору РЦ признака, тогда как европейские доноры (ФРГ, ГДР, Польша, СССР) имеют полигенную детерминацию этого признака. Р. Мельцер в обзоре по наследованию РЦ признака указывает, что доля растений РЦ фенотипа в поколении F2 напрямую зависит от происхождения РЦ донора. Если в скрещиваниях использовать донор В.Ф. Савицкого, то в F2 выщепляется около 15% растений РЦ фенотипа, если же донор из ГДР, то доля растений РЦ фенотипа в поколении F2 составляет менее 5% (Мельцер Р., 1984). Из этого следовало, что РЦ признак не подчиняется правилам менделеевского наследования.
Многолетняя работа селекционеров и семеноводов с одноростковой свеклой свидетельствует, что экспрессиия РЦ признака характеризуется нестабильностью. Наблюдения сотрудников ИЦиГ СО АН СССР в 1980-х годах по репродукции 9 одноростковых сортов свеклы советской селекции показали, что доля растений РЦ фенотипа в популяциях варьировала от 87 % (Белоцерковская односемяннаая 42) до 21% (Рамонская односемянная 9) (Малецкий СИ., Шавруков Ю.Н., 1991). С начала работы с одноростковой свеклой во всех селекционных учреждениях в период цветения постоянно осуществляется массовая браковка растений СЦ фенотипа («ботаническая прополка»). Отказ от отбора ведет к исчезновению РЦ признака у одноростковых сортов и превращает их в многоростковые популяции.
Природа нестабильности экспрессии РЦ признака в 1960-1980 гг. была неясна. Многие исследователи в конце 1960-х годов полагали, что применение инбридинга позволит выделить из сортов популяций гомозиготные линии с константным РЦ признаком (Малецкий СИ. и др., 1988). Наблюдения за экспрессией РЦ признака в селекционных материалах показал исключительную сложность этой задачи. Несмотря на то, что для самоопыления отбирались только растения РЦ фенотипа, их потомства частично или полностью были представлены растениями СЦ фенотипа. Это представление не согласуется с результатами исследований М.Г. Бордонос и В.Ф. Савицкого о рецессивности РЦ признака и менделевских правилах его наследования. Частота возникновения растений СЦ фенотипа в отдельных потомствах была столь высока (иногда все потомство было представлено растениями СЦ фенотипа), что говорить о мутационном происхождении растений СЦ фенотипа (доминантный признак) было невозможно. На основе длительных наблюдений был сделан вывод, что нестабильность экспрессии РЦ признака присуща не только сортам популяциям, но и гомозиготным инбредным линиям (Малецкий СИ. и др., 1988).
Влияние способа репродукции, длительности жизненного цикла, обработки растений колхицином, 5-азацитидином на миксоплоидность клеточных популяций
В качестве материала для экспериментального изучения эпигенетической изменчивости признака раздельно-сростноцветковости (РЦ-СЦ-признак) был взят простой межлинейный гибрид Н2 (см. раздел 2.1. «Материалы»). В таблице приняты следующие обозначения: Ао - растения гибрида Н2\ АоСо - миксоплоидные растения (обработка колхицином) гибрида Н2\ Ai - апозиготическое поколение гибрида Н2 (потомство, полученное без участия пыльцевого родителя); AiCi - апозиготическое поколение, полученное от растений А0Со, AiAz0 - растения Аь обработанные 5-азацитидином; A2AZ1 - апозиготическое поколение, полученное от растений AiAz0; A-idAzo - растения AiCi, обработанные 5-азацитидином; A2C2Azi - апозиготическое поколение, полученное от растений AiCiAz0. Результаты семиї опытов приведены в таблице 13: верхняя строка - контроль, нижняя - опыт. Как следует из представленных данных, основная часть потомков гибрида Н2 представлена РЦ-фенотипами, другая часть « 15% - СЦ-фенотипами (поколение А0, опыт 1). Замачивание семян в колхицине и получение из них миксоплоидных растений ведет к достоверному изменению соотношения РЦ-СЦ фенотипов в потомстве (поколение АоСо, опыт 1). Доля растений СЦ фенотипа по сравнению с контролем, возросла более чем в два раза (около 36%). Различия достоверны с вероятностью более 95%.В опыте 2 сравнивали соотношение растений РЦ-СЦ фенотипов в поколениях Ао и А-. Доля растений СЦ фенотипа в поколение Ai (первое поколение апозиготической репродукции) возросла вдвое (более 45%). Различия достоверны с вероятностью превышающей 99%. Это свидетельствует о том, что любая форма репродукции без отбора (в том числе и апозиготическая) ведет к повышению доли растений СЦ фенотипа в потомстве.
В опыте 3 сравнивали соотношение растений РЦ-СЦ фенотипов в поколениях АоСо и АіС-. В миксоплоидных потомствах после апозиготической репродукции семян (поколение A-Ci) доля растений СЦ фенотипа возросла с 36% почти до 80% (Р 0.999). Из наблюдений опытов 2 и 3 следует, что совокупное влияние однородительского размножения (поколение Ai) и повышение уровня миксоплоидии (поколение AiCi) превращает РЦ гибрид в сростноцветковую форму свеклы. В опыте 4 сравнивали соотношение растений РЦ-СЦ фенотипов в поколениях Ai и A-Az0. Обработка растений 5-азацитидином (поколение AiAzo) приводит к резкому изменению соотношения растений двух фенотипов: доля растений с РЦ-фенотипом возрастает с 54% до более чем 80%. Раздельноцветковых растений становится примерно столько же, сколько и у исходного гибрида Н2 (поколение Ао). Аналогичная картина наблюдается и в опыте 5, где сравнивали соотношение растений РЦ-СЦ фенотипов в поколениях AiCi и AiCiAz0. После обработки миксоплоидных растений 5-азацитидином (поколение AiC-iAz0) резко возрастает доля растений с РЦ-фенотипом с 21% до более чем 70%. В опыте 6 сравнивали соотношение растений РЦ-СЦ фенотипов в поколениях A Azon A2C2Azi. Как следует из результатов наблюдений, вариабельность в обоих вариантах опыта по РЦ-СЦ признаку была примерно одинаковой (0.60 Р 0,70). В поколении AiCiAzo доля растений РЦ фенотипа составила более 70%, а в поколении A2C2Azi более 80%, что близко к контролю (поколение Ао). Таким образом, апозиготическое размножение после обработки 5-азацитидином не оказало никакого воздействия на соотношение фенотипов растений в двух поколениях репродукции.
В опыте 7 сравнивали соотношение растений РЦ-СЦ фенотипов в поколениях A-iAzo и A2Az-. Как и в предыдущем опыте апозиготическое размножение после обработки 5-азацитидином не оказало никакого воздействия на соотношение фенотипов растений. Соотношение РЦ-СЦ растений было близко к контролю (поколение Ао). Рассматривая экспериментальные данные можно сделать заключение, что колхицин, полиплоидизируя клеточные ядра, приводит к частичной инактивации РЦ генов и к повышению доли СЦ фенотипов в потомствах. Вероятно, инактивация РЦ-генов осуществляется путем метилирования участков хромосом, где расположены эти гены, поскольку 5-азацитидин, вызывая гипометилирование генома, активирует РЦ гены, что ведет к резкому повышению доли растений с РЦ-фенотипом. Это свойство наследуется и в следующем поколении репродукции (поколения A2C2Azi и A2Azi). Из наблюдений следует, что, по-видимому, раздел ьноцветковым растениям в норме присущ более низкий уровень метилирования генома, чем сростноцветковым растениям.
Результаты исследования по завязываемости апозиготических семян. представлены в таблице 14 и на рисунках 16 и 17. В данный опыт были взяты две линии, контрастные по числу хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и соответственно по размеру клеток: а) межлинейный гибрид Н2 с малым числом хлоропластов в замыкающих клетках устьиц; б) линия СОАН-31 с повышенным числом хлоропластов, а также ее гибрид СОАН-31 хРЕК-45 характеризующийся также сниженным по сравнению с исходными линиями числом хлоропластов (см. раздел 2.1. «Материалы»). У диплоидных растений сахарной свёклы наблюдается изменчивость по способности завязывать семена без участия пыльцевого родителя (партеногенез или апозиготия). Как следует из наблюдений, рост миксоплоидности клеточных популяций ведет к увеличению завязываемости семян апозиготическим способом у мелкоклеточных растений (табл.14 п.п. 1 и 2; рис16). Средняя завязываемость апозиготических семян у гибрида Н2 составила 4,04+0,74. При обработке растений колхицином (поколение А0Со) этот показатель вырос до 7,73±1,09. Различия контрольных растений (поколение Ао) и опытных (поколение АоСо) достоверно с вероятностью более 99% (табл. 14 графа "критерий Г).
При повторной апозиготической репродукции (потомство A-i) завязываемость семян без участия пыльцевого родителя резко возрасла до 24,4±4,03 (табл. 14! п.п 1 и 3; рис.16). В этом случае различия достоверны с вероятностью превышающей 99,9% (табл.12, графа "критерий Г).
Влияние обработки 5-азацитидином на динамику цветения и формирование цветоносных побегов у растений сахарной свеклы
В систематике растений размер генома - число хромосом в соматических (2п) и генеративных клетках (п) рассматривается как видовой признак. Несмотря на это, миксоплоидия клеточных популяций - широко распространенное явление в растительном мире, имеющее общебиологическое и эволюционное значение (ЛуссА.И., 1935; Хохлов С.С., 1965; Малюта Э.Н., 1984). Пластичность структуры генома - наличие в популяциях клеток с различной плоидностью ядра, является основой для изменения способа репродукции, т.к. полиплоидия и апозиготия (партеногенез) взаимосвязаны и взаимообусловлены (Stebbins G.L, 1950; Richards A.J., 1986; 1997). Существует миксоплоидия как в популяциях соматических клеток, так и генеративных. Ее можно изучать как прямым подсчетом числа хромосом в клетках, так и косвенными методами.
Миксоплоидность клеточных популяций меристем изначально присуща любым растениям свёклы. Наблюдать ее можно как прямым способом - подсчет числа хромосом в делящихся клетках верхушечных меристем, так и косвенными методами - измерение содержания ДНК в ядре, измерение параметров устьичного аппарата. Существует много примеров, когда содержание ДНК на ядро варьирует при постоянном числе хромосом в пределах отдельных популяций одного вида. Изменения массы ДНК в ядрах могут происходить в результате процесса эндополиплоидизации, приводящей к формированию миксоиплоидных популяций клеток и эндоредупликации, приводящей к политенизации хромосом в ядрах (Gentcheff G., Gustafsson А., 1939; D Amato F,1985; Cavallini A., Natali L, 1991). Таким образом, если число хромосом в ядрах - признак систематической значимости, то масса ДНК на ядро, по-видимому, относится к числу весьма вариабельных признаков и может быть предметом естественного отбора, т.к. напрямую связан с рядом фенотипических признаков, относящихся к репродукции растений. Из результатов наших исследований по изменчивости содержания ДНК на ядро следует: а) изменчивость содержания ДНК в ядрах клеток у сахарной свеклы является нормой; б) содержание ДНК на ядро - это нуклеотипическая характеристика как отдельной линии, так и отдельного растения, при этом диапазон изменчивости зависит от исходного материала, взятого в опыт. Растения линии СОАН-41, взятые в опыт, имеют довольно крупные нарушения митотического аппарата клетки. Наличие полиплоидных клеток или клеток с дипло-или квадруплохромосомами может служить основой для появления нового типа расщепления генов: дисомическая (полисомическая) автосегрегация, встречающаяся в агамоспермных потомствах сахарной свеклы (Малецкий СИ., 1997; Малецкий СИ. и др., 1998; Левитес, Малецкий, 1999; Левитес и др., 1999).
Изучение возможных причин повышения миксоплоидности показало, что у инбредных растений достоверно повышается доля полиплоидных клеток в клеточных популяциях и, как следствие этого, повышается среднее число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц. Аналогичные результаты были получены ранее при сравнении размеров клеток мезофилла и числа хлоропластов в них у инбредных линий сахарной свёклы и гибридов, полученных на основе этих линий (Струк Т.И., Осипова З.А., 1982.). Было показано, что размеры клеток у инбредных линий в 2-3 раза превышали размеры клеток у простых гибридов.
Природа повышения уровня миксоплоидии при инбридинге очевидна - у инбредных растений весьма обычны нарушения механизма кариокинеза. Инбридинг оказывает действие на состав клеточных популяций через гомозиготизацию генов, что, вероятно, ведет к нарушениям в кариокинезе (митозе) и цитокинезе (инбредная эндополиплоидизации ядер). Миксоплоидия клеточных меристем должна приводить и к миксоплоидии археспория, что в свою очередь ведет к повышению частоты образования мегагаметофитов с соматическим числом хромосом в ядрах (МалютаЭ.Н. 1980; 1984; Вайсман Н.Я., Викслер Л.Н., 1988; Шамина Н.В. и др. 2001).
Интересным оказался тот факт, что на изменчивость числа хлоропласов оказывает влияние длительность жизненного цикла (растения первой и второй вегетации у двулетних растений). Растения второго года жизни отличаются от растений первого года тем, что размах изменчивости изучаемого признака у них выше. Эти изменения связаны, с одной стороны, с небольшим ростом среднего числа хлоропластов на клетку, а с другой, с увеличением дисперсии распределения. Рост дисперсии указывает, что в клеточной популяции наблюдаются как процессы эндополиплоидизации (кратное увеличение числа хромосом) в ядрах, так и процесс деполиплоидизации (редукция числа хромосом в ядрах клеток). Наблюдения за этим признаком в миксоплоидном поколении (Со) показало, что в отличие от контрольных растений, на второй год вегетации в поколении Со уровень миксоплоидии клеточных популяций снижается и происходит сужение размаха изменчивости.
На миксоплоидность клеточных популяций оказывают влияние также и воздействия химических веществ: обработка колхицином и 5-азацитидином. Колхицин, блокируя митотическое веретено деления, приводит к полиплоидизации клеток и, как следствие этого, к повышению среднего числа хлоропластов в популяциях замыкающих клеток устьиц. Снижение числа хлоропластов при обработке растений эпимутагеном 5-азацитидином не связано ни с изменением уровня плоидности клеток, ни с изменениями в нуклеотидных последовательностях молекул ДНК. Однако он деметилирует остатки 5 -метилцитозина в молекулах ДНК, вызывая тем самым дерепрессию многих генов (эффект гипометилирования генома). Изменения в активности генов у эпимутантных растений оказывают влияние на изменчивость числа органелл в клетках через изменения их митотической активности. Отмечено, что эпимутантные растения (обработанные 5-азацитидином) после некоторой паузы в росте начинают быстро расти, раньше вступают в фазу цветения и имеют в конце вегетации более крупные размеры, чем контрольные растения (Maletskaya E.I. et al., 2002). Известно, что размер клеток определяется двумя факторами: скоростью делений и продолжительностью роста. Чем чаще клетки делятся, и чем непродолжительнее по времени их рост, тем они мельче. При высокой скорости деления размер клеток уменьшается, т.к. дочерние клетки, не достигнув размера материнской клетки, могут начать делиться. Именно из-за высокой скорости деления меристематические клетки обычно малы, что в свою очередь отражается на числе внутриклеточных органелл. Если клетки делятся быстрее, чем делятся хлоропласты, то снижается число органелл в клетках, и могут даже появляться клетки лишенные хлоропластов. По нашему мнению, деметилирование молекул ДНК 5-азацитидином активирует репрессированные гены, меняет функциональное состояние клеточных ядер, что приводит к увеличению скорости деления клеток и к снижению числа хлоропластов в клетках (эпипластомная изменчивость клеток). Кроме эпипластомной изменчивости 5-азацитидин вызывает эпигенетические изменения репродуктивных признаков сахарной свёклы - ускоряются сроки начала цветения, снижается доля растений с нарушениями репродуктивного цикла (доля «холостяков», «упрямцев» в популяции), увеличивается ветвление побегов второго порядка. Высокая частота встречаемости описанных изменений репродуктивной сферы позволяет говорить, что в данном случае речь идет именно об эпигенетической, а не о мутационной изменчивости признаков, т.к. наблюдается высокая частота встречаемости этих изменений у экспериментальных растений (более 50%). Все эти изменения развиваются на фоне деметилирования ядерной ДНК, т.е. на фоне дерепрессии части генов.
