Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 8
2.1 Мигрирующие генетичеокие элементы прокариот 8
2.1.1 Определение и классификация мигрирующих генетических элементов. 8
2.1.2 Структурная и функциональная организация is- последовательностей. Ю
2.1.3 Сложные транспозоны. 13
2.1.4 Транспозон ТпЗ и родственные ему транспозоны 14
2.1.5 Мигрирующие бактериофаги I?
2.1.6 Эффекты, вызываемые мигрирующими элементами в реципиентной ДНК: регуляция действия генов 18
2.1.7 Перестройки,индуцируемые мигрирующими элементами в реципиентной ДНК 20
2.1.8 Эксцизия мигрирующих элементов 24
2.1.9 Образование коинтегратов мигрирующими элементами 28
2.1.10 Обратная транспозиция 29
2.1.11 Специфичность транспозиции мигрирующих элементов 30
2.1.12 Мутации хозяйского генома, влияющие на события "незаконной" рекомбинации, ассоциированные с мигрирующими элементами 32
2.1.13 Модели транспозиции .35
2.2 Генетический анализ у фотосинтезирующих пурпурных бактерий 39
III. Материалы и методы 46
3.1 Бактериальные штаммы 46
3.2 Плазмиды и бактериофаги 46
3.3 Среды и реактивы 46
3.4 Конъюгационные скрещивания 49
3.5 Определение частоты транспозиции 50
3.6 Иммунность к колицину EI 50
3.7 Несовместимость автономных плазмид 50
3.8 Получение спонтанных &й3-вариантов плазмиды PAS8-I2I 51
3.9 Мутагенез 51
3.10 Ампициллиновое обогащение .51
ЗДІ Поиск ауксотрофов, индуцированных внедрением транспозона ад и плазмид pAS8-l2i/pAS8-i2I3/. 51
3.12 Выделение плазмидной ДНК 52
3.13 Выделение ДНК фага 53
3.14 Обработка препаратов ДНК эндонуклеазами рестрикции .53
3.15 Электрофоретический анализ препаратов ДНК 53
3.16 Определение молекулярного веса фрагментов линейной ДНК . 54
ІV. Экспериментальные результаты 58
4.1 Миграция транспозона ад с плазмиды pAS8-i2i в геном Eh. sphaeroides 2R 58
4.2 Локализация включений транспозона ад в геноме Eh. sphaeroides 2Е 64
4.3 Включение транспозона ад в геномы штаммов 28-5, 2.4.1.,ES6$0 Eh.sphaeroides 67
4.4 Получение плазмиды pAS8-i2i::Tn5 и её Стр. введение в пурпурную бактерию .71
4.5 Конъюгативная передача плазмид штаммами 2R::pAS8-I2I И 2Е: :pAS8-I2I^ . 77
4.6 Вторичные перестройки хромосомы, обусловленные транспозоном Тп? и плазмидой pAS8-i2i 81
4.7 Экспрессия несовместимости штаммами 2E::pAS8-i2i 83
4.8 Формирование в» плазмид в межродовом скрещивании Eh.sphaeroides 2R:spAS8-I2I с
E.coli HBIOI 90
4.9 Участие транспозона Тп7в наследовании плазмиды PAS8-I2I в Eh. sphaeroides 2Е 99
4.10 Экспрессия свойств транспозоном ЯпАв Rh. sphaeroides 2R 102
4.11 Наследование плазмиды pAS8-i2l и её производных в штаммах 2Е::Тп7 105
V. Обсуждение результатов .108
5.1 Свойства транспозона ЗДв штаммахHh.sphaeroides .108
5.2 Природа штаммов 2R::pAS8-i2i 114
5.3 Происхождение Е1 плазмид, обнаруженных в межродовых скрещиваниях 121
5.4 Экспрессия Р несовместимости штаммами 2Rs:pAS8-I2I 124
5.5 Свойства транспозона Тп5 в Rh.sphaeroides 2R 125
Заключение 128
Выводы 130
Литература
- Мигрирующие генетичеокие элементы прокариот
- Эффекты, вызываемые мигрирующими элементами в реципиентной ДНК: регуляция действия генов
- Конъюгационные скрещивания
- Миграция транспозона ад с плазмиды pAS8-i2i в геном Eh. sphaeroides 2R
Введение к работе
В последнее время фотосинтезирующие микроорганизмы стали объектами пристального внимания и тщательного изучения исследователей разных специальностей / микробиологов, биохимиков, генетиков и так далее /. Неослабевающий интерес к данным микроорганизмам вызван в первую очередь их уникальной способностью к фотоассимиляции неорганических углерода / G02 / и азота . Такая автономность и непосредственное эффективное преобразование солнечной энергии делает привлекательной перспективу использования фотосинтезирующих микроорганизмов в качестве промышленных продуцентов медицинских препаратов» кормовых добавок, удобрений, топлива/Н2/ ,органической биомассы и так далее. Необходимость скорейшего решения этих задач диктуется быстрым сокращением мировых запасов ископаемого топлива, большая часть которого расходуется как раз на получение указанных продуктов. Эффективное прикладное использование фотосинтезирующих микроорганизмов невозможно без знаний об организации их генетического аппарата и в частности генов фотосинтеза и азотфиксации. Работы в данном направлении начаты сравнительно недавно (Saunders,1978;Marrs,I982) и ведутся широким фронтом на многих фотосинтетиках. Объектом нашего исследования является пурпурная бактерия Кд. sphaeroid.es штамм 2В. Бактерия является типичным представителем фотосинтезирующих /азот-фиксирующих/ микроорганизмов и обладает рядом преимуществ перед другими бактериями как модельный объект при изучении бактериального
фотосинтеза и азотфиксации. У Eh.sphaeroides , к сожалению, не найдено собственных природных систем обмена генетической информацией, что делает актуальной задачу создания искусственных систем переноса генов у бактерии. В настоящее время с этой целью у микроорганизмов с успехом используются плазмиды с широким кругом хозяев (Datta et al, 1971) и мигрирующие генетические элементы ( Смирнова и др.,1980а,б? Merrick et al,I979).
Целью настоящей работы был анализ существующих и поиск новых систем для введения транспозонов в пурпурную бактерию Rh..spliaeroi-des и исследование особенностей транспозиции у фотосинтезирующих бактерий. Конкретные задачи работы сводились к следующему: первое, с помощью плазмид с широким кругом хозяев выяснить экспрессию детерминант устойчивости ряда транспозонов в пурпурной бактерии; второе, найти оптимальную систему для введения транспозонов в Rh. spbaeroi-des ; третье, выявить характеристики процесса миграции ш- элементов в различные штаммы пурпурной бактерии / частоту и специфичность миграции транспозонов, способность формировать коинтеграты, способность вызывать хромосомные перстройки, стабильность внедрений и так далее /; четвёртое, сконструировать штаммы пурпурной бактерии с щ-элементами, пригодные для изучения мобилизации хромосомных генов.
В результате проведённых экспериментов удалось: впервые обнаружить эффективную селективную систему для введения мигрирующих элементов в широкий круг грамотрицательных бактерий на основе гибридной плазмиды pAS8-i2i ; модифицировать плазмиду pAS8-i2i с целью введения в её состав транспозонов, определяющих устойчивость к ка-намицину, тетрациклину , стрептомицину и триметоприму; осуществить транспозицию элементов Тп7 и Тп5 в геном Rh.sphaeroides штаммов 2Е,2.4.1.,28-5,RS650 ;впервые продемонстрировать отсутствие экспрессии генов репликации плазмиды СОІЕІ в пурпурной бактерии и как следствие этого способность плазмиды pAS8-i2l наследоваться стабильно целиком только в интегрированном состоянии в хромосоме; впервые показать, что плазмида PAS8-I2I способна формировать в варианты с фрагментами хромосомы пурпурной бактерии; выявить участие собственных мигрирующих элементов гибридной плазмиды в её наследовании клетками Kh.sphaeroid.es.
Практическая ценность работы состоит в получении коллекции стабильных инсерционных мутантов пурпурной бактерии, включая варианты с повреждениями фотосинтетического аппарата; получении набора штаммов с интегрированной в различные участки хромосомы плазмидой PAS8-I2I . Эти штаммы используются в настоящее время в нашей лаборатории при проведении генетического анализа у Eh. sphaeroid.es 2В.
Предложенные в работе методы с некоторыми модификациями могут быть использованы в генетических исследованиях других грамотрица-тельных бактерий, включая микроорганизмы, имеющие важное промышленное, сельскохозяйственное и медицинское значение( см. например, Sato et al, 1981; Weiss, Falkow, 1983).
Мигрирующие генетичеокие элементы прокариот
Мигрирующие генетические элементы прокариот В последнее время внимание исследователей приковано к событиям "незаконной рекомбинации", то есть событиям, имеющим место в отсутствии протяжённых областей гомологии и идущих при участии ферментов, отличных от таковых системы гомологичной рекомбинации. Под этим термином объединён целый класс разнообразных явлений, таких, например, как миграция контролирующих элементов у кукурузы (McClintock, 1952), фазовая вариация у Salmonella (Andrew, 1922), инверсия фрагмента G у бактериофага Ми и аналогичное явление у бактериофага PI (Kennedy et ai., 1983), интеграция-выщепле-ние бактериофага Я (Nash, 1975), миграция Тп и is элементов и связанные с этим явления и другие события. Существуют, однако," фундаментальные различия внутри данной группы явлений, поскольку одни из них происходят без изменения суммарного количества ДНК, а другие сопровождаются частичной репликацией ДНК (Campbell, 1981). В данном обзоре будут рассматриваться процессы второго типа, ассоциированные с мигрирующими элементами: is-последовательностями, транспозонами и мигрирующими бактериофагами. 2.I.I. Определение и классификация мигрирующих генетических элементов Транспозирующиеся элементы представляют собой специфические фрагменты ДНК, способные к повторному перемещению в несколько или множество сайтов генома без изменения своего состава и независино от функционирования системы гомологичной рекомбинации. Это определение затрагивает как бактериофаг Ми, способный внедряться во множество практически случайных мест, так и транспозон Тп7 имеющий ОДИН сайт внедрения На хрОМОСОМе Е. coli (Taylor, 1963 J Lien tenstein, Brenner, 1981). Некоторые из транспозирующихся элементов могут существовать автономно /как цитоплазматические реплико-ны.или внеклеточные вирусы/, тогда как другие обнаруживаются только в интегрированном состоянии. По свойствам мигрирующие элементы МОЖНО разделить На НесКОЛЬКО КЛаССОВ (Kleckner, 1981). is-элементы /простые перемещающиеся последовательности/ кодируют только функции, необходимые для транспозиции и в размере обычно не превышают нескольких тысяч пар оснований /кб/. В составе is-элементов обнаружены гены, влияющие на транскрипцию прилегающей реципиентной ДНК /стоп-сигналы, промоторы/ и ограждающие сам мигрирующий элемент от спонтанной активации извне, is-элементы не несут каких либо иных генов, а следовательно, определённого фенотипа. Их присутствие в клетке может быть обнаружено по вторичным эффектам: влиянию на экспрессию прилегающих генов реципиентной ДНК, образованию с высокой частотой перестроек в районе внедрения. Могут существовать, поэтому, внедрения is-элементов, не придающие видимых изменений бактериальной клетке. Обратно, изменение фенотипа клеток Е. СОІІ, утративших, к примеру, ISI,
Неизвестно (Campbell et al., 1979).
Транспозоны /тп-элементы/ - сложные мигрирующие структуры, часто фланкированные двумя копиями is-элементов. Их свойства во многом подобны свойствам is-элементов. По размеру они, однако, значительно больше, так как содержат гены, не связанные с процессом миграции: детерминанты антибиотикорезистентности, вирулентности и другие.
Эписомы - сложные самореплицирующиеся элементы, часто содержащие is-последовательности и транспозоны. По свойствам миграции напоминают is-элементы и транспозоны.
Структурная и функциональная организация is-последовательностей. Самой простой организацией обладают is-элементы, состоящие из небольшой уникальной центральной последовательности нуклеоти-дов, ограниченной повторяющимися нуклеотидными последовательностями в противоположной ориентации - так называемыми инвертированными повторами (Cohen, І97б).із-последовательности обнаружены В составе ХРОМОСОМЫ Е. coli И ПЛазмИД (Nyman et ai., 1981; Saedier, Heiss, 1973); часть из них найдена в составе транспозо-нов..Например, ISI /две копии в различной ориентации/ входит в
Состав тп9, тп1б81, tn/rdet/ и других (McHattie, Jakowski, 1977; so et al., 1978, 1979). Наконец, ISIO, IS50, IS903 были обнаружены только в составе соответствующих транспозонов тшо, Тп5, Тп903 (Oka et al., 1980; Auerswald, Shaller, 1981; Hailing et al., 1982). Использование широкотрансмиссивных плазмид позволило выявить is-элементы в других бактериях и изучить их свойства в Е. сои. Таким образом был обнаружен ISRI-элемент у почвенной бактерии R. lupini (Pfeifer et al., 1981).
Размеры is-последовательностей варьируют от 700 пар оснований до 1500 п.о. Величина концевых инвертированных повторов варьирует в пределах 15-40 пар оснований, исключение составляют концевые повторы is50-Элемента размером ВСеГО 9 П.О. (Berg et ai., 1982). Наиболее изучены к настоящему времени элементы ISIO и IS50. Данные анализа нуклеотидной последовательности элемента ISIO (Hailing et ai., 1982) свидетельствуют о наличии в составе элемента одной протяжённой кодирующей области размером 1200 п.о., абсолютно необходимой для транспозиции. По-видимому, эта область кодирует диффузный продукт /белок-транспозазу/, поскольку нару
шения в ней приводят к появлению рецессивной мутации отсутствия транспозиции. Внедрение в данную область /вставка in vitro / промотора lac UV5 приводит к индуцируемому аналогами лактозы сверхсинтезу trans-действующего продукта, необходимого для транспозиции. Потенциально у isio-элемента существуют ещё 4 области, способные кодировать небольшие полипептиды. Однако, для этих участков не найдено собственных промоторов и поэтому неясно, синтезируются ли с них полипептиды in vivo (Hailing et al., 1982)
Эффекты, вызываемые мигрирующими элементами в реципиентной ДНК: регуляция действия генов
Большинство мигрирующих элементов при внедрении в оперон оказывают заметный полярный эффект на экспрессию дистальних генов. Этот феномен хорошо изучен для is-элементов: при анализе их внедрений в классические lac и gal опероны Е. coli (starlinger, 1980; Adhya, Gottesman, 1978). Полярность, определяемая некоторыми мигрирующими элементами, полностью или частично исчезает в гЬо"-штаммах (Das et al., 1977; Bessemer, Herpess, 1977). Полярный эффект от внедрений элементов в бактериофаг Л также полностью супрессируется фаговой антитерминаторной функцией (кіескпег et al., 1978). Терминаторные участки, чувствительные к rho-фактору, были обнаружены у мигрирующих элементов в транскрипционных экспериментах in vitro (de Crombrugghe et al., 1973) ИЛИ ИХ cy ществование можно предположить для некоторых элементов из анализа последовательности нуклеотидов ДНК (Ghosal et al., 1979; Klaer et al., 1981B; Grindley, Joyce, 1981). В других случаях полярный эффект от внедрения элементов определяется наличием множественных стоп-кодонов в их составе и отсутствием в реципи-ентной ДНК вблизи места внедрения точек реинициации транскрипции (Ohtsubo, Ohtsubo, 1978; Johnsrud, 1979; Kroeger, Hobom, 1981). Иногда включения is-элементов приводят к активации экспресии прилегающих хромосомных генов. Для IS2 и IS3 этот эффект зависит ОТ ориентации элемента (Saedler et al., 1974; Glansdorff et al., 1981). Однако, существует исключение: IS2-элемент вызывает слабую активацию при внедрении в arg-гены в обеих ориентациях и далеко не всякое внедрение IS2 в int-гены в ориентации II /активация прилегающих генов/ вызывает экспрессию гена. Эффект слабой активации экспрессии прилегающих генов был найден для транспозона Tn5 (Berg et al., 1980). По мнению ряда исследователей феномен активации соседних генов при внедрении мигрирующих элементов может быть объяснён наличием собственных промоторов в составе элемента вблизи концевых последовательностей или образованием новых промоторных участков в местах стыковки элемента и реципиентной ДНК (Ghosal, Saedler, 1978; Kleckner, 1981). Возможен другой механизм регуляции Tn-элементом выражения соседних генов (Berg et ai., 1981 ): когда регуляция экспрессии реципиентной ДНК осуществляется промотором уникальной области транспозона, а ориентация промотора /"включение-выключение"/ меняется при перестройках внутри транспозона /инверсии ДНК между инвертированными повторами/. Похожий феномен "включения-выключения" генов реципиентной ДНК может наблюдаться при инверсиях между двумя копиями мигрирующего элемента (xieckner, Ross, 1980), при так называемых дуплина-тивных инверсиях /см. ниже/.
Практически все транспозирующиеся элементы стимулируют геномные перестройки в участках, прилегающих к сайту их внедрения (Berg et al., 1975; Kopecko, Cohen, 1975; Reif, .Saedler, 1977; Poster, 1977; Howe, Bade, 1975; Ross et al., 1979). Кроме собственно самой транспозиции в реципиентную ДНК, мигрирующие элементы могут вызывать инверсии, делении и другие перестройки.
Делении.
Делении, индуцированные мигрирующими элементами, имеют характерную структуру: одна из концевых точек её приходится на концевую нуклеОТИДНую пару элемента (Mickel et al., 1977; Faelen, Toussaint, 1978; Hoel, Ames, 1978) /рис. І/. Делеции в большинстве случаев не захватывают сам мигрирующий элемент и распространяются по одну /любую/ сторону от встроенного элемента. Поскольку при этом элемент остаётся интактным, возможны новые акты образо-вания перестроек (Reif, Saedler, 1975). Такой тип делений характерен ДЛЯ IS-ЗЛЄМЄНТОВ И Некоторых ТраНСПОЗОНОВ (Calos, Miller, 1980). В случае сложных транспозонов, несущих на концах /инвертированные/ повторы в виде is-элементов, делеции могут индуцироваться в любой из 4 концевых нуклеотидных пар is -элементов и распространяться в любом направлении. Б этом случае может удаляться
ЧаСТЬ СаМОГО ТраНСПОЗИруЮЩеГОСЯ Элемента (Botstein, Kleckner, 1977). Был проведён анализ распределения вторых концевых точек делеций, индуцированных транспозонами Tnl и ТпЮ (Noel, Ames, 1978; weinstock et ai., 1979). Оказалось, что такие точки для транспозона Tnl могут быть сгруппированы в тесный кластер в одной области генетической карты. В то же время дистальные концевые точки делеций, индуцированных транспозоном Tnio, распределяются относительно равномерно, хотя и существуют "горячие точки", в которых рекомбинационные события, приводящие к делениям, происходят чаще. Таким образом, специфичность распределения дистальных концевых точек делеций соответствует, по-видимому, специфичности транспозиции этих элементов /см. ниже/.
Конъюгационные скрещивания
Миграция транспозона ад с плазмиды pAS8-i2i в геном Eh. sphaeroides 2R
Ампициллиновое обогащение при поиске ауксотрофов у пурпурной бактерии проводили по методике Gorini, Kaufman (I960) с незначительными изменениями. В качестве ростовой среды для процедуры использовали среду Ормерода, содержащую 20?& сахарозы. Культуру до добавления ампициллина инкубировали в минимальной среде 16 часов, с антибиотиком - 6-8 часов. Инкубацию всегда проводили в люмино-стате без аэрации при 30-32С.
Поиск ауксотрофов, индуцированных внедрением транспозо на Тп7 ИЛИ ПЛазМИД pAS8-I2I/pAS8-I2l3/.
Поиск ауксотрофов, индуцированных внедрением транспозона Тп7 или плазмид pAS8-i2i/pAS8-i2i3/ проводили среди клонов, отобранных в стандартном межродовом скрещивании J53/pAS8-i2i/ 2RRfr на твердой минимальной среде с отбором трансконъюгантов на Л-ага-ре с рифампицином и стрептомицином. Последующий анализ на возникновение ауксотрофности осуществляли параллельным перекалыванием выросших колоний трансконъюгантов на среду Ормерода со стрептомицином и Л-агар с рифампицином и стрептомицином. Потребности обнаруженных инсерционных ауксотрофов определяли так. Сначала иссле дуемые клоны рассевали на три среды: Л-агар /контроль/, среда Ормерода с добавлением оснований, среда Ормерода с добавлением казаминовых кислот "Дифко". На втором этапе мутанты, если они вырастали на сумме оснований, рассевались на каждое основание по отдельности. Если мутанты вырастали на среде с казаминовыми кислотами, то их рассевали на две чашки с добавлением по 10 аминокислот в каждую. На третьем этапе мутанты, выросшие на одной из чашек с 10 аминокислотами, рассевали вновь на две чашки, содержащие уже по 5 аминокислот и так далее... Начальную группировку аминокислот проводили по семействам согласно Клаусу, Хэйсу (1970).
Выделение плазмидной ДНК. Выделение плазмидной ДНК из штамма 2.4.1. Rh. sphaeroides и штаммов Е. coli проводили по методу Holmes, Quigley (1981). Для штамма 2R и его производных, а также штаммов RS630 и 28-5 пурпурной бактерии использовали тот же метод, модифицированный нами:
1. 5 мл стационарной культуры исследуемого штамма центрифугировали 10 минут при 8000 об/мин /радиус ротора: г = 15 см/ при комнатной температуре. Жидкую фазу удаляли.
2. Осадок /биомассу/ суспендировали в 180 мкл дистиллированной воды и переносили в микропробирку.
3. Добавляли 180 мкл буфера STET /двойной концентрации/. Осторожно перемешивали.
4. Добавляли 20 мкл водного раствора лизоцима /концентрация -10 мкг/мл/. Мягко перемешивали.
5. Пробирку переносили в кипящую баню на 60 секунд, а затем немедленно помещали в ледяную баню.
6. Приливали 180 мкл 0,2 НаОН. Перемешивали. Инкубировали при О С5 минут.
7. Нейтрализовали щёлочь добавлением 180 мкл ЗМ ацетата натрия /pH 6,0/. Перемешивали.
8. Центрифугировали при 4 С15 минут при скорости 16000 об/мин /г = 15 см/. Супернатант с плазмидной ДНК аккуратно сливали в новые пробирки.
9. Осаждали плазмидную ДНК из водной фазы, как обычно, добавлением равного объёма этилового спирта /или изопропанола/, инкубацией в течение 2 часов при -Ю-20С и последующим центрифугированием в течение 30 минут при 4С и скорости 3000 об/мин /г = = 50 см/.
10. Осадок плазмидной ДНК подсушивали и суспендировали в SO SO мкл буфера TES. Пятую или десятую часть препарата анализирова ли электрофорезом на количество выделенной плазмидной ДНК и за грязнение препарата линейной хромосомной ДНК.
Обычно указанной процедурой удавалось получить до 3-5 мкг плазмидной ДНК из 5 мл культуры пурпурной бактерии, практически свободной от хромосомы.
Выделение ДНК фага Л проводили по Миллеру (1976). Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически.
Обработка препаратов ДНК эндонуклеазами рестрикции. Обработку препаратов ДНК эндонуклеазами рестрикции осуществ ляли в течение 1-2 часов при температуре 37С. В качестве буфер ных систем использовали: для рестриктазы ш.паз/-буфер А, для рестриктазы EcoRi/- буфер В. Процедуру прекращали прогреванием препаратов при 65С в течение 5 минут.
