Количественная оценка эффективности тестирования и определения потенциальной мутагенной опасности химических соединений Велибеков Рамис Махачевич

Содержание к диссертации

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

   1. Краткая история проблемы 11

   8. 3. Проблема ложных позитивных и ложных негативных результатов 33

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47

   1. Характеристика использующихся в работе баз данных 47

      2. База данных Gene-Tox 47

      3. База данных NTP 48

      Характеристика рассматриваемых в работе тест-систем 48

      4. Цитогенетические тесты in vivo 53

      7. Тест по учёту наследуемых транслокаций у самцов

      4. Оценка получаемой в ходе тестирования информации 68

      6. Формирование базы данных 77

      7. Принципы формирования 77

      9. Оценка эффективности тестирования 83

      10. Одиночные тесты 83

   3. Эффективность батарей тестов 91

      1. Общие

      3. Средняя информация 96

      4. 
         

      6. Неоднозначные результаты 98

      3.4.1. Определение коэффициентов взаимной сопряжённости

      143

      147 150

      1. Использование селективной информации для оценки взаимной зависимости тестов

      2. Кластерный анализ

      3. Количественное определение потенциальной генетической опасности химических соединений

         5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 4.1. Выводы Благодарности

         6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ПРИЛОЖЕНИЯ Приложение 1

         Область применения химических соединений использующихся в работе при проведении ретроспективного анализа

         Приложение 2

         Мутагенная активность в половых клетках грызунов Приложение 3

         Значения информации при использовании одиночных тест-систем

         3.1. Полученная в ходе тестирования информация при разных

         исходах испытаний 150

         1. Средняя информация 154

         2. Полная информация при разных исходах испытаний 15 5

         Приложение 4 157 Значения информации при использовании батарей тестов

         4.1. Полученная в ходе тестирования информация при разных

         исходах испытаний 157
         

         Введение к работе

         Актуальность темы. Актуальность охраны окружающей среды и, в частности, проблемы оценки и предотвращения негативных последствий, связанных с введением в биосферу в связи с деятельностью человека многочисленных химических соединений, в настоящее время очевидна.

         Немногим более 30 лет тому назад вначале научным, а вслед за этим и всем обществом был осознан тот факт, что химические соединения - загрязнители окружающей среды, также как и ионизирующая радиация, представляют реальную генетическую опасность для человека. В результате возникло новое направление в генетике - так называемая генетическая токсикология, основной задачей которой является создание методологии для классификации химических соединений по степени их потенциальной генетической опасности для человека, с целью осуществления различных регулирующих действий, направленных на предотвращение или уменьшение возможных генетических последствий химических соединений.

         Вторая проблема генетической токсикологии связана с необходимостью постоянного тестирования большого числа химических соединений. В настоящее время число зарегистрированных в международном регистре (CAS - Chemical Abstract Service, ) соединений составляет более 18 миллионов химических веществ. Это число увеличивается каждый день примерно на тысячу соединений. Понятно, что большая часть вновь синтезируемых соединений не попадает в среду в качестве реальных загрязнителей, однако, число «новых» загрязнителей среды также оказывается достаточно велико и составляет величину порядка 3500 в год, то есть примерно 10 соединений в день. Это обусловливает необходимость создания достаточно оперативной и экономичной системы тестирования химических соединений в отношении их потенциальной генетической опасности для человека.

         За время существования генетической токсикологии созданы сотни тест-систем, многие из которых используются в настоящее время для оценки потенциальной мутагенной или канцерогенной опасности химических соединений. Однако проблема оценки эффективности биотестирования и связанная с этим проблема её оптимизации не решена и в настоящее время.

         В значительной степени такое положение связано с отсутствием единого количественного критерия оценки эффективности тестирования и, соответственно, прогностической значимости полученных в ходе тестирования результатов. Отсутствие такого критерия приводит к тому, что определение степени мутагенной и канцерогенной опасности проводится на субъективном, экспертном уровне. В результате, процедуры тестирования и выявляемые в ходе их проведения уровни потенциальной генетической опасности химических соединений различаются в разных странах, что порождает большие социологические и экономические проблемы. Попытки унификации (гармонизации) процедуры тестирования, проводимые с 1994 года, до сих пор не завершились успехом. Таким образом, обоснование единого количественного критерия оценки эффективности тестирования и потенциальной генетической опасности химических соединений для человека представляет в настоящее время центральную проблему генетической токсикологии.

         Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в обосновании и апробации (на примере широко использующихся в настоящее время 6 тест-систем) селективной информации в качестве универсального количественного критерия оценки эффективности тестирования и потенциальной мутагенной опасности химических соединений для млекопитающих. При этом решаются следующие задачи: 1. Создание представительной базы данных, включающей в себя химические соединения для которых имеются экспериментальные данные по мутагенным эффектам в половых клетках грызунов, а также результаты их испытаний в исследуемых в работе тест-системах (тест Эймса, тесты по учёту генных мутаций и хромосомных аберраций in vitro, тесты по учёту цитогенетических повреждений in vivo, тест по учёту рецессивных, сцеплённых с полом летальных мутаций у дрозофилы, тест по учёту доминантных леталей у грызунов).

         Проведение анализа эффективности исследующихся в работе тест-систем и их парных сочетаний.

         Обоснование и проведение оценки потенциальной мутагенной опасности химических соединений, изученных с помощью использующихся в работе тест-систем.

         Научная новизна. Впервые в работе обоснован и применён количественный критерий, позволяющий проводить оценку эффективности не только отдельных тестов, но и их батарей, - как в среднем, так и для каждого получаемого в ходе тестирования результата в отдельности. В качестве этого критерия выступает селективная информация наличия (или отсутствия) мутагенных свойств у испытуемых соединений. Для построения шкалы потенциальной мутагенной опасности испытанных химических соединений использована специально введённая функция веса (уровня) доказанности, однозначно связанная со значениями полной информации, достигаемой при проведении биотестирования.

         Практическая значимость. Обоснование единого количественного критерия оценки эффективности тестирования и определения потенциальной мутагенной опасности химических соединений позволяет оптимизировать процедуру биотестирования и устранить субъективизм при её организации и классификации химических соединений по степени этой опасности.

         Предложенная система оценки может быть использована как при проведении валидных исследований отдельных тестов и их батарей, так и при обосновании регулирующих действий. Эти регулирующие действия по запрету и ограничению использования различных химических соединений осуществляются различными государственными службами, созданными для этих целей. В России к числу таких служб относится фармакологический комитет (Дурнев А.Д. и др., 2000), в США - Служба токсических веществ Агенства по охране окружающей среды (OTS US ЕРА - Office of Toxic Substances United States Environmental Protection Agency) (USEPA, 1989), в Великобритании - Экспертный комитет по тестированию мутагенов Департамента здоровья (DH - Department of Health) (Brusick, 1988).

         1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Краткая история проблемы

         Возможность воздействия на наследственность живых систем с помощью внешних, экзогенных по отношению к организмам факторов, впервые была показана Меллером в 1927 году (Muller, 1927). Он установил, что рентгеновские лучи индуцируют мутации в половых клетках дрозофилы. Вскоре Стадлер (Stadler et al., 1928) показал способность ионизирующего излучения вызывать не только генные мутации, но и другой тип наследуемых изменений, а именно, хромосомные аберрации. Сам факт установления возможности воздействовать на наследственность экспериментально, показанной на примере ионизирующей радиации, стимулировал поиск такой способности у факторов, имеющих химическую природу. Этот поиск осуществлялся в 30-х - начале 40-х годов за рубежом (Ohlerkers, 1943) и, особенно, в СССР (Сахаров, 1933; Лобашёв, Смирнов, 1934) и привёл к открытию химического мутагенеза Раппортом (Раппопорт, 1946) на примере этиленимина и Ауэрбах (Auerbach, Robson, 1944; Ауэрбах, 1978) в случае иприта и его аналогов.

         После 2-й мировой войны в результате угрозы использования атомного оружия и развития атомной энергетики была осознана опасность, связанная с последствиями действия квантов ионизирующей радиации на биологические системы, и, в первую очередь, в отношении человека. Однако, несмотря на то, что основные принципы биологического действия ионизирующей радиации были поняты и сформулированы еще в 30-е годы, проблема количественного определения генетического риска для человека в пересчете на единицу дозы, особенно если речь идет не о проникающем излучении (рентгеновые лучи, у-кванты, нейроны), а о радиоактивных изотопах, не решена и сегодня. И это, несмотря на то, что уже более 60 лет существуют специальные научные дисциплины - радиобиология и радиационная генетика, для которых основной социально значимой проблемой является количественное определение биологической, в основном, генетической, опасности радиационного воздействия для человека. Все это показывает, насколько сложно оценить генетические последствия любого фактора среды, если речь идет о количественном определении этих последствий применительно к человеку.

         В конце 60-х годов вначале научным сообществом, а затем и государственными органами была осознана необходимость учитывать не только общетоксикологические последствия загрязнения окружающей среды химическими веществами, используемыми в промышленности, сельском хозяйстве, медицине и в быту, но и генетические последствия такого загрязнения. Толчком к осознанию генетической опасности химических соединений, введенных в биосферу, послужили факты о наличии мутаций (хромосомных аберраций) в клетках крови у лиц, подвергавшихся лечению азотным аналогом иприта (Conen et al., 1961). В США в 1969 г., а затем в Европе были созданы общества мутагенов окружающей среды. Это можно считать моментом рождения генетической токсикологии как науки. К концу 60-х годов мы уже имели достаточно развитую радиобиологию и радиационную генетику со своей методологией, методами регистрации эффектов и т.д. Были получены многочисленные результаты по исследованию мутагенеза с использованием клеток различного уровня организации. В связи с этим могло показаться, что эти методы могут быть непосредственно применимы для анализа эффектов химических мутагенов - загрязнителей среды. Однако это справедливо лишь частично, и в процессе становления генетической токсикологии была сформирована своя собственная методология и свои собственные методы анализа. В развитых странах (страны Европы, США, Канада, Япония) законодательно закреплена необходимость проведения оценки не только общетоксической, но и генотоксической опасности загрязнения окружающей среды, и созданы специальные национальные и интернациональные структуры, которые, с одной стороны, разрабатывают научно-методологические основы проведения такого рода оценки, а, с другой стороны, осуществляют регламентирующие действия в отношении веществ, представляющих мутагенную и канцерогенную опасности, - запрет, ограничение в использовании и т.д. Например: Агенство по лекарствам и пищевым добавкам США (Foad and Drug Administration USA), Агенство охраны окружающей среды США (U.S. Environmental Protection Agency), Экспертный комитет по мутагенам министерства здравоохранения Великобритании (Department of Health's Expert Committee on Mutagenicity UK), Министерство здоровья и социальной защиты Японии (Ministry of Health and Weifare (Japan)), Международный комитет по защите от мутагенов и канцерогенов окружающей среды (International Commission for Protection against Environmental Mutagens and Carcinogens - ICPEMC). В России первые упоминания о необходимости учёта мутагенных и канцерогенных химических соединений в форме закона появились в 1991 г. в Законе Российской Федерации "Об охране окружающей природной среды" (№20601 от 19.12.1991 г., статьи 25, 26, 30, 32).

         Мутагенные и канцерогенные эффекты в принципиальном плане по механизмам их обуславливающих, отличаются от общетоксического действия химических соединений. Оценка генетической, в отличие от общетоксикологической, опасности химических соединений для человека представляет собой значительно более сложную и трудоемкую процедуру.

         1.2. Этапы действия мутагенов

         Ещё при исследовании действия ионизирующей радиации стало ясно, что в процессах, приводящих к патологии у млекопитающих и человека, можно выделить ряд этапов (Dubinin, Tarasov, 1968).

         Первый - это этап взаимодействия квантов излучения с ДНК хромосом и формирование спектров, так называемых, первичных повреждений ДНК.

         Второй - это процесс репарации ДНК, в результате которого часть повреждений элиминируется и восстанавливается исходная структура нативной ДНК.

         Третий этап - это этап формирования на базе нерепарированных первичных повреждений ДНК генных мутаций или хромосомных аберраций. Дальше судьба мутаций зависит от того, возникли ли они в соматических клетках либо в клетках полового пути (генеративных клетках). Для соматических клеток основным патологическим процессом, известным в настоящее время, является процесс канцерогенеза, т.е. возникновение злокачественных опухолей. Этот процесс, в свою очередь, обычно делят на этапы, и индуцированные мутации лежат в основе этапа инициации - первого этапа злокачественного перерождения клеток (Белицкий и др., 1998).

         В случае возникновения мутаций в генеративных клетках, часть их элиминируется за счет гибели клеток - их носителей в процессе мейотического отбора. Этот отбор относится к несбалансированным несимметричным транслокациям, а также к ацентрическим фрагментам. Последние, правда, так же, как дицентрики и т.д., могут исчезать и в процессе обычного митотического деления клеток. Не исчезнувшие, прошедшие эти барьеры мутации могут попадать в оплодотворенную зиготу, независимо от того, являлись ли их носителями яйцеклетка или сперматозоид, и это может приводить либо к гибели эмбрионов (спонтанному аборту), либо к рождению ребенка с той или другой наследственной патологией.

         Все эти процессы, в принципе, отражают картину событий и для проникающей радиации, и для химических мутагенов. Однако для проникающей радиации в момент облучения по всей толщине ткани формируются треки ионизации, и часть этой ионизации поражает (попадает) в гены. Для химических мутагенов значительно более сложен путь транспорта от момента контакта организма с тем или другим химическим соединением до момента взаимодействия молекул химических мутагенов с ДНК хромосом в клетках различных органов и тканей организма. И на пути этого транспорта основную роль играют две группы факторов. Первая группа связана с фармакокинетикой химического соединения, т.е. с его распределением по клеткам различных органов и тканей, временем жизни соединения, способностью избирательно накапливаться и выводиться из организма и т.д.

         Вторая группа факторов связана с процессом биотрансформации, когда изначально немутагенные (промутагены) и неканцерогенные (проканцерогены) соединения превращаются в мутагенные и канцерогенные соединения. Существует и противоположный процесс, когда мутагенные соединения в ходе трансформации превращаются в немутагенные продукты. Роль этого процесса, как показали последние исследования, в индуцированном химическими соединениями мутагенезе и канцерогенезе для млекопитающих и человека чрезвычайно велика. Показано, что подавляющее большинство химических соединений претерпевает биотрансформацию в организме млекопитающих и большая часть известных канцерогенов является не прямыми канцерогенами, а проканцерогенами (Турусов и др., 2000).

         1.3. Механизмы действия мутагенов

         Как это ни парадоксально звучит, в настоящее время значительно труднее ответить на вопрос, каким образом действуют мутагены, чем 15-20 лет тому назад. Вплоть до 70-х годов генетики исследовали лишь небольшую группу химических веществ, обладающих способностью индуцировать мутации, и механизм их действия был изучен достаточно подробно. Однако, начиная с середины 70-х годов, начали стремительно накапливаться данные о наличии мутагенной активности у веществ, относящихся к самым разным в химическом отношении классам соединений. Анализ результатов, представленных в Gene-Tox программе (Ray et al., 1987), показал, что соединения, относящиеся к различным в химическом отношении классам, имеют в своем составе мутагены.

         Грубо все мутагены можно разделить на два класса. Это, во-первых, так называемые ДНК-тропные мутагены, эффект которых определяется поражением молекул ДНК хромосом. К этой категории мутагенов относится большая часть среди изученных химических мутагенов, в том числе и обладающие высокой эффективностью (Дубинин, 1978). И, во-вторых, мутагены, не взаимодействующие с ДНК, а осуществляющие свой эффект непрямым способом - путем поражения ферментных систем, участвующих в метаболизме ДНК. К этим системам относятся процессы репликации ДНК, репарации, функционирования генов, рекомбинации, структурных преобразований хромосом в процессе их удвоения, предмейотической и предмитотической упаковки хромосом и т.д. Вещества, относящиеся к этой группе мутагенов, действуют по принципу, характерному для общетоксических эффектов. Для них существует порог в дозовой зависимости и отсутствие эффекта в допороговых концентрациях.

         Особую группу представляют собой аналоги азотистых оснований, которые, как известно, могут в процессе репликации встраиваться в ДНК вместо нормальных нуклеотидов (аденина, гуанина, цитозина, тимидина). Само по себе это встраивание ненормального нуклеотида еще не является мутацией, однако в процессе последующих репликаций ДНК напротив (оппозитно) чаще, чем обычно ошибочно встраивается нормальный нуклеотид, в результате чего и возникает мутация. Наиболее известными мутагенами, относящимися к этому классу, являются 2-аминопурин и 5- бромдезоксиуридин.

         Другая группа химических мутагенов связана с интеркаляцией молекул мутагена в двойную структуру ДНК и изменением за счет этого конформационных свойств молекулы ДНК, которое, в свою очередь, может приводить к увеличению частоты возникающих мутаций. Наиболее изученными мутагенами, относящимися к этому классу, являются акридиновые красители (Strauss, 1999; Kopsidas et al., 1996; Ferguson et al., 1991). Причем, если в случае аналогов оснований преимущественно возникают мутации типа замены пар оснований, то в случае "интеркаляторов" - мутации типа сдвига рамки считывания. Способности мутагенов, относящихся к разным классам, учтены при создании тест- систем. В тест Эймса включен анализ мутагенности с использованием различных индикаторных линий сальмонелл. Некоторые из них учитывают мутации типа замены пар оснований, тогда как другие - мутации типа сдвига рамки считывания (Ames et al., 1973; Mortelmans et al., 2000).

         1.4. ДНК-тропные мутагены

         Для ДНК-тропных мутагенов характерно, что на первом этапе в результате их действия независимо, относятся ли они к классу алкилирующих соединений либо проявляют свой эффект за счет реакции дезаминирования или окислительно-восстановительных процессов, возникает, как правило, спектр первичных повреждений ДНК. Это - однонитевые и двунитевые разрывы, так называемые мутационные аддукты, апуриновые и апиримидиновые сайты и сшивки ДНК-ДНК и ДНК с белком.

         Первые две категории вносят основной вклад в индуцированный мутагенез и канцерогенез, в связи с чем в настоящее время разработаны относительно простые и экономичные методы учета этих типов повреждений ДНК, которые включены в общую процедуру тестирования химических загрязнений среды на генотоксичность. В эту же процедуру тестирования включен тест, регистрирующий так называемый внеплановый, индуцированный мутагенами синтез ДНК. Дело в том, что большая часть первичных повреждений ДНК не реализуется в конечные биологические ответы - мутации либо хромосомные аберрации, поскольку ДНК хромосом "освобождается" от этих повреждений при протекании процесса репарации ДНК. Этот процесс, открытый вначале на феноменологическом уровне, а затем и молекулярном, имеет место на всех уровнях организации живых систем, начиная с клеток микроорганизмов и заканчивая клетками млекопитающих, в том числе человека, наряду с процессами репликации и рекомбинации, являясь фундаментальным процессом, обеспечивающим целостность и изменчивость, но на определенном уровне, наследственных структур - генов и хромосом.

         Как было установлено в конце 50-х - начале 60-х годов (Hollaender et al., 1956; Корогодин, 1958; Лучник, 1959), первичные повреждения ДНК возникают в форме предмутаций, судьба которых определяется в результате протекания процесса восстановления (репарации) ДНК - процесса, эффективность которого зависит от типа клеток, вида организмов, величины дозы и типа использованного мутагенного фактора. Общие феноменологические представления о потенциальном характере первично возникающих при действии мутагенов повреждений и существование в клетках процессов репарации ДНК и перехода (реализации) этих повреждений в фиксированную форму мутаций (Дубинин, 1966; Корогодин, 1966; Жестянников, 1968; Лучник, 1968; Dubinin et al., 1968; Тарасов, 1982) нашли свое подтверждение и получили развитие при исследовании молекулярных механизмов репарации и мутагенеза.

         В ходе репарации повреждения удаляются, в результате чего возникает вместо повреждения "брешь" в одной из нитей ДНК. "Бреши" возникают также во вновь синтезированных нитях ДНК после репликации напротив участков, несущих повреждения. Эти "бреши" устраняются при протекании дополнительного внепланового репарационного синтеза ДНК. В результате, этот синтез тесно сцеплен с наличием индуцированных мутагенами повреждений ДНК. И, более того, известно, что отдельные ветви репарационного процесса, как правило, конститутивные ветви, протекают аккуратно, и в ходе их протекания мутации не возникают. Другие типы репарации, как правило, индуцибельные, протекают с ошибками и приводят к возникновению мутаций. Именно для этого типа (error prone repair) репарационного процесса характерно возникновение обширных "брешей" и интенсивный репарационный синтез ДНК (Тарасов, 1982). При создании существующих в настоящее время тест-систем, достаточно широко используются для увеличения порога чувствительности бактериальные и клеточные линии, в которых нарушен процесс репарации на разных этапах. Например, клетки индикаторных штаммов Эймса содержат дефект в гене uvrB, который кодирует репарационную эндонуклеазу - фермент, опознающий повреждение и делающий надрез нити ДНК вблизи него (Mortelmans et al., 2000). В результате, оказывается возможным зарегистрировать мутагенный эффект при более низких мутагенных нагрузках, чем это имеет место для клеток дикого типа.

         Другим примером является созданный за рубежом и в нашей стране, так называемый, SOS-хромотест (Quillardet et al., 1982; 1985; Oda et al., 1985; Джеджелава и др., 1988; 1989; Davidov et al., 2000). При его создании использовались генно-инженерные методы. В результате, по изменению окраски среды при действии испытуемых соединений можно судить об их мутагенной активности. Этот процесс легко автоматизируется.

         1.5. Зависимость частоты мутаций от величины дозы мутагена

         Нелинейность дозовой зависимости для химических мутагенов определяется несколькими причинами. Во-первых, более сложным по сравнению с ионизирующим излучением путем транспорта химических веществ от момента контакта с клетками в условиях организма до момента взаимодействия с ДНК хромосомы. На этом пути существенно распределение химических мутагенов по отдельным тканям организма, условия их выведения, проницаемость клеточных оболочек, а также процессы метаболической трансформации, которые введенные в организм химикалии претерпевают в процессе этого транспорта и в результате которых может быть ослаблена либо, напротив, усилена их мутагенная активность.

         Второй фактор, определяющий нелинейность дозовой зависимости как для химических мутагенов, так и радиации, связан с неоднозначностью связи между первичным повреждением ДНК, возникающим в результате действия квантов ионизирующей радиации или молекул химических мутагенов, и необратимым реализованным изменением ДНК хромосомы независимо от того, идет ли речь о генных либо хромосомных структурных мутациях.

         Еще в ранних работах (Dubinin et al., 1968; Дубинин и др., 1969) на примере, в основном, радиационного воздействия, показано, что свойства репарационной системы клетки (чувствительность к действию мутагена, эффективность репарации в единицу времени) существенным образом сказываются на характере дозовой зависимости, включая область, так называемых, малых доз (хронического воздействия с малой интенсивностью), и это обстоятельство создает значительные трудности при оценке мутагенного потенциала факторов - загрязнителей среды. В более поздних работах показано, что ситуация оказалась еще более сложной, поскольку, наряду с конститутивным процессом репарации, обнаружены индуцибельные процессы и генетические системы, их детерминирующие, которые играют существенную роль в изменчивости генома, включая его структурную и точковую мутабильность (Тарасов, 1982).

         1.6. Индуцибельные процессы

         В настоящее время известно несколько групп генов (регулонов), индукция выражения которых происходит координированно при действии различных экзогенных факторов. Это относится к группам генов, детерминирующих SOS-ответ, так называемый, адаптивный ответ, оксигенный ответ, и к группе хит-шоковых генов. Все они в большей или меньшей степени участвуют в процессах изменчивости генома и, в частности, в мутагенезе в классическом понимании этого слова. SOS-ответ. Различные факторы, повреждающие ДНК или нарушающие её репликацию, у Е. Coli индуцируют ряд фенотипических изменений, объединённых под названием SOS-ответ (Dfais et al., 1971; Radman, 1974; Radman, 1975; Witkin, 1976). SOS-ответ включает следующие основные функции (Little, Mount, 1982): ингибирование клеточного деления, замедление клеточного дыхания, индукция профагов, деградация ДНК, индукция стабильной ДНК-репликации; SOS-мутагенез, обусловленный работой так называемой "ошибочной" SOS-репарации.

         С молекулярной точки зрения SOS-ответ является результатом дерепрессии координированно регулируемой системы генов, продукты которых по всей вероятности способствуют сохранению жизнеспособности клетки при летальном ДНК-повреждающем действии (Osana et al., 1986). Система SOS-ответа находится под контролем двух основных генов - гесА и 1ехА. Ген 1ехА кодирует синтез белка LexA - репрессора более 17 генов, состовляющих SOS регулон. Ген гесА ответственен за синтез белка RecA, который играет ключевую роль в регуляции SOS-ответа, поскольку именно этот белок в активированной форме (протеаза RecA) расщепляет репрессор LexA и таким образом запускает SOS-систему (Roberts et al., 1978; Little et al., 1994; Murli, Walker, 1993).

         Полагают, что природа SOS-индуцирующего сигнала необходимого для активации RecA белка, связана с метаболизмом ДНК, т.е. это может быть компонент или структура, присутствие которых не характерно для клетки в нормальных условия: ДНК с пробелами или "брешами", олигонуклеотиды, димеры нуклеотидов (Little, Mount, 1982; Irbe et al., 1981).

         Особого внимания заслуживает одно из важных последствий SOS- ответа - SOS-мутагенез, результат "ошибочной" SOS-репарации. SOS- мутагенез контролируется генами recA, lexA и umuDC. Предполагается, что UmuD белок расщепляется RecA белком с образованием функционально активной UmuD' формы. По всей видимости "ошибочная" репарация основана на способности специфической полимеразы вести репликативный синтез с ограниченной точностью на повреждённой матрице (Murli, Walker, 1993; Тарасов 1982).

         Адаптивный ответ. В 1977 году в клетках E.coli был обнаружен так называемый, адаптивный ответ, который заключался в увеличении резистентности клеток к действию метилирующих и этилирующих мутагенов, использованных в сравнительно высоких дозах после предварительной обработки клеток этими же мутагенами, но в низких, сублетальных концентрациях (Jeggo et al., 1977; Samson et al., 1977). Существование адаптивного ответа показано для клеток высших эукариотов, таких как мыши (Bogden et al., 1981), крысы (Renard et al., 1980; Mehta et al., 1981), китайский хомячок (Samson et al., 1980) и человек (Pegg et al., 1982).

         Специфическими индукторами адаптивного ответа являются, например, N-нитрозогуанидин, метилметансульфонат (Jeggo et al., 1977).

         Адаптивная репарация ДНК в отличие от SOS-репарации является по своей природе антимутагенной. В результате, при низких мутагенных нагрузках, до порога индукции адаптивного ответа, мутагенез является более эффективным, а после индукции, т.е. при более высоких мутагенных нагрузках происходит "включение" адаптивной репарации и снижение эффективности мутационного процесса. Это также искажает линейность дозовой зависимости частоты мутаций, однако прямо противоположным образом по сравнению со случаем SOS-ответа.

         Оксигенный стресс. На эффективность мутационного процесса и, в частности, на характер зависимости частоты мутаций от величины дозы мутагена влияет и, так называемая, система оксигенного стресса, существование которой показано как в клетках микроорганизмов, так и в клетках млекопитающих. Однако, в отличие от SOS и адаптивного ответов, система оксигенного стресса действует не на этапе репарации ДНК после возникновения в ней повреждений, а на более раннем этапе - этапе транспорта мутагенных продуктов к ДНК клеток-мишеней (Oberley, 1982; Sugiura, 1979).

         Установлено, что при действии радикалов кислорода в составе супероксид аниона (0₂~), перекиси водорода (Н2О2) и гидроксильной группы (ОН) возникает, так называемый, кислородный стресс (Christman et al., 1985; Van Bogelen et al., 1987), т.е. происходит специфическая индукция генов, контролирующих антиоксидантные защитные функции клетки (Van Camp et al., 1996; Kullik et al., 1995; Van Breusegem et al., 1995).

         Эта защитная антиоксидантная функция клеток обеспечивается, в основном, за счет 3-х основных ферментов: супероксид дисмутазы, каталазы и пероксидазы (Frank, 1985).

         В случае ответа на оксигенный стресс происходит индукция и других генов, продукты которых включены в процесс репарации ДНК и метаболизм ксенобиотиков, таких как репарационные экзонуклеазы III и IV, глюкозо-6- фосфат дегидрогеназа, гидропироксидаза I и др. (Storz et al., 1990; Baeuerle, 1991; Schrecketal., 1992).

         Показано, что концентрация этих ферментов может меняться при переходе от одной к другой ткани в пределах одного организма, а также отличаться у различных индивидов в популяции (Marckland, 1984; Lipecka et al., 1986). В результате, эти различия могут быть одной из причин тканевой индивидуальной чувствительности к действию мутагенов.

         Однако основными факторами, влияющими на характер ответа в живых системах при действии различных факторов, являются фармакокинетика и биотрансформация.

         1.7. Биотрансформация

         Биотрансформацию ксенобиотиков, в том числе и мутагенов (канцерогенов) принято рассматривать как этапный процесс, включающий в себя, по крайней мере, две фазы. В биохимических реакциях, катализирующих I фазу метаболических превращений в организме, основное место принадлежит системе микросомного окисления, а именно, микросомным монооксигеназам. Эта микросомная система представляет собой комплекс ферментов, состоящий из трех основных компонентов - флавопротеина (НАДФН-цитохром P-450-редуктаза), фосфолипида (фосфорилхолин) и гемопротеида (цитохром Р-450). Первые два компонента осуществляют транспорт электронов, последний функционирует как терминальная оксидаза. Цитохром Р-450 существует в виде множественных форм с различной, но частично перекрывающейся субстратной специфичностью. Это позволяет системе монооксигеназ осуществлять окисление различного ряда эндогенных и ксенобиотических субстратов. Таким образом, круг реакций, катализируемых монооксигеназами очень широк и включает в себя ароматическое и алифатическое гидроксилирование, формирование арен- и алкилоксидов, оксилительное N-, О-, S- деалкилирование, сульфоокисление, окислительное деаминирование, десульфирование и дегалогенирование (Абилев, 1986; Худолей и др., 1988; Ляхович и др., 1981; Lewis et al., 1998; van Iersel et al., 1999).

         В результате монооксигенных реакций образуются более полярные гидроксилированные дериваты, способные к выведению из организма. В этом смысле монооксигеназы принято считать ферментами детоксикации. Однако, эта же энзиматическая система может вызывать потенцирование биологических эффектов изначально инертных ксенобиотиков, путем превращения их в токсичные или реактивные продукты. Последние способны повреждать внутриклеточные макромолекулы, несущие как генетическую информацию, так и выполняющие структурные и регуляторные функции, приводя тем самым к проявлению токсических, мутагенных и канцерогенных эффектов.

         Маркерным ферментом монооксигеназной системы принято считать арилгидрокарбонгидроксилазу (АГГ, другое название - гидроксилаза ароматических углеводородов) - фермент, катализирующий реакции гидроксилирования в организме. Этот фермент участвует в метаболизме широко распространенных в окружающей среде полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) и ряда других ксенобиотиков. АГГ обычно используют как показатель способности биологических систем образовывать в результате гидроксилазных реакций электрофильные метаболиты. Максимальная активность этого фермента обнаружена в печени крыс, у человека его активность значительно ниже, чем у животных (Lewis et al., 1998).

         Значение монооксигеназной системы в метаболической активации генотоксикантов объясняется тем, что реакции, катализируемые этими ферментами, часто приводят к формированию конечных реактивных метаболитов (например, 2,3-оксида афлатоксина В1 из проканцерогенного афлатоксина). С другой стороны, система монооксигеназ необходима для образования промежуточных метаболитов, которые в дальнейшем трансформируются в конечные реактивные соединения с помощью других энзимов (например, N-гидроксилирование 2-ацетиламинофлуорена системой монооксигеназ предшествует превращению промежуточных продуктов в высокореактивные сульфоэфиры с помощью сульфотрансферазы (Абилев, 1986; van Iersel et al., 1999).

         Реакции II фазы метаболизма ксенобиотиков, включающие в себя связывание реактантов с эндогенными конъюгирующими агентами, приводят к изменению физико-химических свойств биотрансформируемых соединений, что ограничивает их дальнейшие превращения в организме. Однако, некоторые реакции конъюгации играют существенную роль в метаболической активации.

         Наиболее важный процесс второй фазы метаболизма канцерогенов в организме большинства позвоночных животных - конъюгация метаболитов с глюкуроновой кислотой. Этот процесс осуществляется в несколько стадий: сначала синтезируется активированный промежуточный продукт - уридинфосфатглюкуроновая кислота, а затем фермент УДФ- глюкуронилтрансфераза (УДФГТ) переносит глюкуроновую кислоту из ее комплекса с уридинфосфатом на субстрат. Субстратом для УДФГТ, как и для большинства конъюгирующих ферментов, служат продукты монооксигеназных реакций (Абилев, 1986; Худолей, Майоров, 1988; van Iersel et al., 1999).

         Важное значение в дезактивации и активации ксенобиотиков имеют также сульфотрансферазы, ацетилтрансферазы, глютатионтрансферазы.

         На содержание и активность обеих фаз метаболизма ксенобиотиков и на их метаболическую активацию важное влияние оказывают ряд эндогенных и экзогенных факторов, таких как возраст, заболевания, изменения светового режима, гормональный статус, условия содержания, иммунологические факторы, индукторы, ингибиторы, питание и диета, пол, вид, линия, стресс (Худолей, Майоров, 1988; Абилев, 1986; Дурнев, Середенин, 1998; van Iersel et al., 1999).

         1.8. Методология оценки мутагенной активности химических соединений для человека

         Генетическая токсикология - наука, которая возникла на грани 60-70-х годов и призвана оценить генетический риск для человека, связанный с загрязнением окружающей среды химическими веществами, и методологически обосновать необходимые регулирующие действия с целью сведения к минимуму этого риска. Не вдаваясь в детали, напомним, что мутагены и физической, и химической природы индуцируют спектр различных наследуемых повреждений, которые лежат в основе злокачественного перерождения клеток и возникновения в следующих поколениях наследственных болезней и дефектов умственного и физического развития. В обоих случаях биологические последствия существенно отдалены во времени от момента действия факторов, их вызывающих. После своего возникновения мутации не имеют "истории". Конкретный тип повреждения наследственного аппарата клеток с определенной вероятностью может вызвать ту или иную форму наследственной патологии и эта вероятность не зависит от причин, вызывающих повреждения хромосом, будь-то ионизирующее излучение, химические мутагены или спонтанный мутагенез.

         Установление связи между мутациями определенных генов человека и различными наследственными патологиями является предметом исследований медицинской генетики. Исследования связей такого рода в случае мутаций в соматических клетках человека относятся к проблемам теоретической медицины, в частности, молекулярной онкологии.

         Основной проблемой генетической токсикологии является оценка риска возникновения мутаций в соматических и половых клетках человека при действии химических веществ - загрязнителей окружающей среды.

         Определение области исследования генетической токсикологии имеет не только академическое, но и практическое значение. Это связано с тем, что при математической, формализованной оценке генетической опасности или популяционного риска необходимо учитывать все возможные состояния, т.е. мы должны оперировать в замкнутом пространстве событий, для которого сумма вероятностей всех возможных состояний равна единице. Это требование вытекает из необходимости не допустить потери, либо приобретения информации неучтенным нами образом.

         1.8.1. Проблема затрат на проведение биотестирования

         Уже на первом этапе возникновения генетической токсикологии было очевидно, что соображения стоимости, затрат, наряду с эффективностью, являются одним из фундаментальных принципов, лежащих в основе создаваемых тогда и существующих в настоящее время процедур, направленных на выявление мутагенов и определение степени их генотоксической опасности (Bridges, 1974).

         Необходимость учета затрат определяется по крайней мере двумя обстоятельствами. Во-первых, чрезвычайно большим числом химических загрязнителей среды. В настоящее время синтезировано более 8 миллионов химических соединений и около 100 тысяч из них тем или иным способом введены в биосферу. Вместе с тем, лишь менее половины из этих 100 тысяч веществ исследованы хотя бы в одном из существующих тестов. И, более того, темп синтеза новых химических соединений весьма велик (порядка 300 тысяч новых соединений синтезируется в год и примерно 1,5-2,0 тысячи из них поступает в биосферу в качестве реальных загрязнителей среды) и он постоянно возрастает.

         Во-вторых, проблема точной оценки мутагенного действия любого химического вещества чрезвычайно сложна и трудоемка. Она более сложна по сравнению с аналогичной оценкой для ионизирующей радиации. Фактически методами, которыми в настоящее время располагают генетика и генетическая токсикология, задача прямой оценки генетических наследуемых эффектов и, соответственно, последствий прямо у человека не может быть решена принципиально, как не решена эта проблема даже для ионизирующей радиации. Для соматического мутагенеза у человека имеются строгие доказательства, но лишь для весьма ограниченного числа химических соединений, которые, как правило, используются при лечении злокачественных опухолей. В результате, мы в любом случае, по крайней мере в настоящее время, не в состоянии получить строгого количественного ответа о мутагенных свойствах химических соединений у человека.

         Из вышесказанного вытекает, во-первых, необходимость этапности в проведении биотестирования, когда на первом, "просеивающем", относительно дешевом этапе должны быть отобраны вещества, представляющие минимальную генетическую опасность, а в отношении оставшихся должно проводиться, если это необходимо, дальнейшее тестирование на последующих, требующих больших затрат этапах (Bridges, 1976; Бочков и др., 1975).

         Принятие решений о прекращении тестирования и определение степени генетической опасности для человека или о продолжении тестирования требует разработки специальных критериев. В основе этих критериев должен лежать один принцип - максимум выявленной в ходе тестирования информации о популяционном генетическом риске для человека в пересчете на единицу затрат на проведение тестирования. Этот принцип эквивалентен минимуму невыявленного генетического риска при пересчете на единицу затрат в процессе тестирования на генотоксичность и, соответственно, при выполнении тех или других регулирующих, регламентирующих действий.

         1.8.2. Общие принципы биотестирования

         Уже на первом этапе возникновения генетической токсикологии как науки стало ясно, что при формировании стратегии тестирования необходимо учитывать, по крайней мере, два принципа. Во-первых, большое количество веществ, которые необходимо тестировать на мутагенную активность требует использования на первых этапах достаточно оперативных краткосрочных тест-систем. Во-вторых, необходимо выбрать удобные биологические стандарты, по отношению к которым можно было бы реально проводить процедуру валидизации всей совокупности имеющихся в нашем распоряжении краткосрочных тестов. Очевидны трудности, связанные с установлением непосредственной связи между ответами в тест-системах и интересующими нас последствиями у человека. Это связано с недостатком данных о веществах, для которых доказано в эпидемиологических исследованиях наличие или отсутствие мутагенной либо канцерогенной активностей. Особенно остро эта проблема стоит в отношении "строгих" немутагенов и неканцерогенов для человека. В связи с этим по филогенетическим критериям и критериям стоимости на эту роль биологических стандартов подходят мелкие грызуны (крысы и мыши). В конце 60-х - начале 70-х годов процедуры мутагенного и канцерогенного тестирования представляли собой две отдельные области исследований. Однако, когда МакКенн и соавторы (McCann, et al., 1975) показал, что 157 из 175 канцерогенов и 94 из 108 неканцерогенов дали в тесте Эймса положительный и отрицательный ответы соответственно, стало ясно, что результаты тестирования на генотоксичность могут быть использованы при оценке канцерогенного риска загрязнителей среды. Начиная с этого времени, генетическая токсикология имеет два субнаправления. Это, во- первых, оценка собственно генетического мутационного риска, то есть эффектов в половых клетках человека и, во-вторых, оценка генетических эффектов в соматических клетках человека в связи с их потенциальной канцерогенной опасностью. В соответствии с вышесказанным, общую стратегию тестирования можно представить следующим образом (рис. 1).

         результаты тестов на животных: стандартный тест in vivo тест на мутации в специфическом локусе наследственные транслокации тест на доминантные летали у грызунов результаты тестов на животных: стандартный тест in vivo - биотест на канцерогенность на животных прогноз для тестов на животных краткосрочные тесты: другие виды (микроорганизмы, насекомые, растения) тест на млекопитающих in vitro тест на соматических клетках млекопитающих in vivo

         Рис. 1. Общая стратегия биотестирования.

         Прекращение тестирования принятие решения

         Хотя, строго говоря, проблема оценки генетического и канцерогенного рисков представляет собой две различные проблемы и требует применения различной генетико-токсикологической техники, методология тестирования загрязнителей среды, особенно на первых этапах ее становления, развивалась в рамках одного направления. Для решения проблемы массового скрининга идея поэтапного тестирования кажется естественной, она была сформулирована и реализована в самом начале 70-х годов (Bridges, 1974; Bridges, 1976; Бочков и др., 1975) (рис. 2).

         Число веществ

         Увеличение стоимости тестирования, степень приближенности к человеку

         Рис. 2. Принципиальная схема поэтапного тестирования На первом этапе используются наиболее экономичные в плане материальных затрат тест-системы и по результатам тестирования принимаются решения. В случае отрицательного результата тестирование прекращается, в случае положительного результата мы переходим ко второму этапу тестирования. В результате, объём выборки тестируемых веществ сокращается при переходе от первого ко второму, от второго к третьему и т.д. этапам, однако увеличивается точность оценки потенциальной генетической опасности испытуемых соединений. С учётом того, что стоимость тестирования возрастает при переходе от первого ко второму и т.д. этапам, общие затраты при проведении массового скрининга уменьшаются. Строгое проведение в жизнь этого подхода требует, чтобы в нашем распоряжении были высокочувствительные (а⁺ =1) краткосрочные тест-системы. В противном случае уже на первом этапе могут "проскальзывать", показывая отрицательные результаты, вещества, являющиеся мутагенами либо канцерогенами для человека. Практически сразу же стало ясно, что системы с высокой чувствительностью, особенно если речь идет о регистрации канцерогенной активности, отсутствуют в нашем распоряжении. В связи с этим кажется естественной замена одного теста на группу комплементарных тестов (батарею тестов). Процесс биотестирования в каждой тест-системе, входящей в батарею, проводится не последовательно, а одновременно и лишь затем оценивается прогностическая значимость процедуры тестирования в целом для батареи тестов. В общем виде идея замены последовательного тестирования на фактически параллельное тестирование с использованием различных тест- систем и оценки значимости результатов тестирования для всего ансамбля использованных тестов предложена Брюсиком (Brusick, 1981). Логическое развитие этой идеи выразилось в предложенном позже методе, позволяющем учитывать всю доступную информацию о генотоксичности химических веществ (Lohman et al., 1992; Moore et al., 1992; Mendelson et al., 1992).

         1.8.3. Проблема ложных позитивных и ложных негативных результатов

         При использовании любой тест-системы, наряду с правильными позитивными и негативными результатами, возникают и неправильные, ложные результаты (ответы). Это определяется, во-первых, тем, что мутагенность в большей или меньшей степени обусловлена видо- и тканеспецифичными признаками организмов. Во-вторых, на характер ответа могут влиять и влияют, как это показано в многочисленных работах, сопутствующие факторы, специфичные для каждой тест-системы. К последним относятся, например, для теста Эймса - гибель клеток, для клеток млекопитающих в системе in vitro - эффекты взаимодействия тестируемых агентов с культуральной средой, условия культивирования (Lohman et al., 1992). В результате, между ответами в тест-системах и интересующими нас последствиями у человека либо у грызунов существует неоднозначная, функциональная, а корреляционная, вероятностная связь. Именно это обстоятельство и приводит к появлению ложных позитивов независимо от того, проводится тестирование для выявления мутагенной или канцерогенной потенциальной опасности. Понятно, что эффективность тестирования зависит от соотношения частот ложных и правильных позитивных и негативных результатов. Количественно это соотношение характеризуется величинами чувствительности и специфичности.

         Существующие в настоящий момент схемы тестирования в большей степени, чем предыдущие, направлены на оценку мутагенного эффекта в половых клетках человека. В связи с этим, ответы, полученные в системах in vitro и in vivo в отношении соматических клеток, рассматриваются в качестве первого этапа скрининга и имеют значение лишь в прогностическом смысле, оценивая вероятность наличия либо отсутствия у испытуемых соединений мутагенных свойств в отношении половых клеток человека. По данным Международной комиссии по защите от мутагенов и канцерогенов окружающей среды (ICPEMC Committee 1, 1983; ICPEMC Working Paper No. 1, 1986), прогностическая значимость теста Эймса в отношении эффекта в половых клетках млекопитающих лежит в пределах от 60 до 70%. Причем эта величина определяется, в основном, ложнопозитивными результатами. Тест Эймса в этом случае имеет относительно высокую чувствительность и низкую специфичность. Аналогичная картина характерна и для цитогенетических тестов в системе in vitro. Сравнение характера ответов в цитогенетических тестах in vitro и in vivo показало, что в данном случае прогностическая значимость ответов по отношению к мутагенезу in vivo относительно невелика, поскольку в данном случае специфичность составляет величину порядка 60-65%, в то время как чувствительность имеет значение порядка 100%. Принципиально такой же характер связи установлен и для эффектов в соматических клетках in vivo, с одной стороны, и в половых клетках, с другой стороны. В целом, показано, что мутагены для половых клеток также являются мутагенами для соматических клеток, но не наоборот. Этот тезис был поставлен под сомнение (Russell et al., 1984), поскольку были выделены 7 соединений, которые показали мутагенный эффект в половых клетках, но не в соматических. В силу важности этого тезиса для общей стратегии оценки генетической опасности, эти 7 соединений (акриламид, хлорид кадмия, циклогексиламид, этанол, сахарин, трифлупромазин и сложная смесь - coal liquid А) в дальнейшем явились предметом специального анализа. В результате, их специфическая мутагенность для половых клеток не подтвердилась (Adler, Ashby, 1989; Adler et al., 1989; Wyrobek, et al., 1983). В связи с этим, в настоящее время остается справедливым, по крайней мере в основном, тезис, сформулированный Холденом, что мутагены для половых клеток являются также мутагенами для соматических клеток (Holden, 1982). Однако обратное утверждение, по-видимому, неправильно. Есть все основания полагать, что существует класс мутагенов, вызывающих эффект исключительно в соматических клетках млекопитающих. Тем не менее, степень доказанности этого тезиса не так велика, как хотелось бы. Это определяется недостатком данных о мутагенных ответах в половых клетках и соответствующих ответах в соматических клетках млекопитающих (Adler, Ashby, 1989; Adler, Ashby, Wurgler, 1989). В этой связи особую ценность приобретает разработка относительно простых и экономичных тестов в половых клетках млекопитающих, позволяющих регистрировать кластогенность и другие типы генотоксичных эффектов, техника учета которых разработана ранее для соматических клеток. К числу таких тестов относятся: микроядерный тест, изменение внепланового синтеза ДНК, щелочной элюции ДНК и т.д. в половых клетках млекопитающих (Tates et al., 1983). Усовершенствование техники измерений касается также модификации протоколов проведения ранее известных тестов и, в первую очередь, цитогенетических тестов в клетках млекопитающих in vitro и in vivo (Cliet et al., 1989; Tates et al., 1989).

         1.8.4. Схемы биотестирования

         По мере развития новых тест-систем и количественной оценки существующих происходит пересмотр принятых в различных странах схем биотестирования химических соединений на генотоксичность. При этом происходит изменение требований к протоколу проведения традиционных тестов и замена одних тестов на другие в составе предлагаемых батарей. Однако главное связано с изменением критериев оценки получаемых в ходе тестирования результатов. Рассмотрим более подробно последние изменения в процедуре тестирования на примере США и Европы.

         В США Агентство по защите окружающей среды (USEPA) регулярно публикует требования для оценки мутагенного риска загрязнителей окружающей среды (Duesberg, 1987). Схема проведения тестирования, предложенная в 1979 г. Службой токсических веществ (OTS) Агентства по защите окружающей среды США (Rssel et al, 1984), включает в себя три этапа, причем тестирование проводится отдельно для выявления мутагенности в отношении генных мутаций и хромосомных аберраций (рис. 3).

         Использование первых 4-х тестов этих двух схем (тест Эймса, генные мутации in vitro и in vivo, а также цитогенетический тест in vivo) представляет собой первый этап тестирования, который связан с определением мутагенных свойств, как таковых, у испытуемых соединений. Если все они дают отрицательный результат, тестирование прекращается и делается вывод о немутагенности химических соединений. В противном случае осуществляется переход ко второму этапу, который включает в себя два теста: тест на доминантные летали у грызунов и тест на рецессивные летальные мутации у дрозофилы. На этом этапе оценивается способность испытуемых соединений повреждать наследственные структуры в половых клетках. При наличии отрицательных результатов процедура тестирования прекращается. В случае положительных ответов в тесте на доминантные летальные мутации у грызунов и тесте на рецессивные летальные мутации у дрозофилы, соответственно, тестирование продолжается с использованием теста,

         А. Генные мутации

         Тест Эймса

         1П vitro > нет дальнейшего тестирования исследование канцерогенности на грызунах

         ОгозорИПа Сцепленные с полом рецессивные летали исследование канцерогенности на грызунах мутации в специфических локусах

         Б. Хромосомные аберрации

         In vitro цитогенетика in vivo цитогенетика нет дальнейшего тестирования исследование -4- канцерогенности на грызунах доминантные летали _+ исследование канцерогенности на грызунах наследственные транслокации Рис. 3. Предложенные ОТБ системы тестирования. регистрирующего наследственные транслокации у грызунов либо мутации в специфических локусах у мышей. Одновременно для оценки канцерогенного риска испытуемых соединений наличие одного позитивного ответа на любом этапе тестирования требует автоматического перехода к двухгодичному тесту на канцерогенную активность у грызунов. В настоящее время эта схема изменена следующим образом (рис. 4): + in vitro тест Эймса генные мутации⁵¹ + in vivo цитогенетический тест в клетках костного мозга аберрации хромосом или * микроядра взаимодействие с ДНК гонад мутации в специфических локусах наследственные транслокации " видимые" или биохимические * для учёта генных мутаций in vitro могут быть использованы: лимфомамыши L5178Y, tk-локус, учет маленьких и крупных колоний клетки СНО или клетки фибробластов легкого V79 + тест in vitro на кластогенность

         Рис. 4. Используемая в настоящее время схема тестирования на мутагенность, предложенная OTS (Auletta et al., 1993). доминантные летали

         В рамках этой схемы двухгодичный биотест на канцерогенность должен быть автоматически включен в процедуру тестирования не в случае одного, как это было в предыдущей схеме, а при наличии как минимум двух позитивных ответов на первом этапе тестирования, один из которых должен быть получен в системе in vivo. При наличии лишь одного позитивного ответа или двух в системе in vitro требуется дополнительный анализ, включающий в себя привлечение информации об ответах в других тест- системах, данных о связи между структурой и активностью, и данных об уровне предполагаемого воздействия на человека. Второе отличие данной схемы от предыдущей связано с исключением из процедуры тестирования специального теста на кластогенность в системе клеток млекопитающих in vitro. Это связано с тем, что, как это было показано в ряде работ, две тест- системы, а именно тест на клетках лимфомы мыши L5178Y/tk и тест на клетках СНО AS52, способны регистрировать как генные мутации, так и хромосомные аберрации разных типов, а также гомологичную рекомбинацию и генную конверсию (Hsie, 1987; Stanowski, Tindall, 1987; Moore et al., 1989; Applegate et al., 1990). Это, в свою очередь, позволило объединить две схемы тестирования отдельно в отношении генных мутаций и хромосомных аберраций в одну. И, наконец, произошла замена теста, регистрирующего рецессивные летальные мутации у дрозофилы, на тесты, оценивающие взаимодействие испытуемых соединений с ДНК в клетках гонад млекопитающих. Эта замена связана с двумя обстоятельствами. Во- первых, в течение 80-х годов были разработаны тесты, регистрирующие внеплановый синтез (Sega, 1982; Working, Butterworth, 1984; Bentley, Working, 1988), a также разрывы и поперечные сшивки ДНК (Bradley, Dysant, 1985; Scare, Schrotel, 1985) в половых клетках грызунов. Во-вторых, как мы уже говорили выше, существуют данные, указывающие на относительно низкую прогностическую эффективность этого теста по отношению к эффектам в половых клетках млекопитающих (Brusick, 1983; Rssel et al., 1984). Сравнение данных, полученных в тесте на рецессивные летальные мутации у дрозофилы, с данными теста, регистрирующего мутации в специфических локусах у мыши (MSL-тест), показало, что степень соответствия между этими двумя тестами не превосходит 60-70%. С другой стороны, результаты тестов при учете внепланового синтеза ДНК и щелочной элюции показывают хорошую корреляцию с таковыми для MSL- теста (Bentley et al., 1994). Для учета эффекта генных мутаций рекомендуется традиционно использовать развитый первоначально для оценки мутагенного эффекта радиации (Rssel, 1951) тест, регистрирующий видимые мутации в специфических локусах у мыши MSL-тест (Rssel et al., 1981; Rssel et al., 1984), а также MBSL-тест, учитывающий биохимические мутации с помощью электрофореза белков (USEPA, 1989; USEPA, 1990). Следует подчеркнуть, что при получении отрицательного ответа на первом этапе тестирования процесс тестирования не прекращается автоматически, как это было в предыдущей схеме. Эти отрицательные результаты поступают в аналитический блок (data review), в котором лишь после анализа принимается решение о продолжении или прекращении процедуры тестирования. При проведении такого анализа учитываются данные о предполагаемом уровне воздействия на человека, любая информация о мутагенных свойствах испытуемых соединений, данные о химической структуре и отношении между структурой и активностью (SAR), возможном механизме действия, информация о фармакокинетике и метаболизме, влиянии на репродуктивные функции и т.д. Таким образом, по сравнению с предыдущей схемой современная процедура тестирования становится менее жесткой, менее детерминированной. В ней в большей степени присутствуют динамичные эффекты, связанные с принятием решения, которые, в свою очередь, соотносятся не только с результатами, полученными в ходе тестирования, но и обусловливаются другими факторами. Увеличение доли динамичного начала характерно также для эволюции процедуры тестирования в случае европейских стран и объединенной Европы в целом.

         Схема, предложенная Экспертным комитетом по тестированию мутагенов Департамента здоровья (DH) Великобритании в 1989 г., включает в себя три стадии:

         РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННА* 41

         Стадия I. Тесты in vitro бактериальный тест на генные мутации тест на кластогенность в клетках млекопитающих (метафазный анализ) тест на генные мутации в клетках млекопитающих Стадия II. Тесты in vivo (эффекты в соматических клетках) тест на кластогенность в клетках костного мозга тест на кластогенность в клетках других тканей Стадия III. Тесты in vivo (эффекты в половых клетках) тесты, показывающие взаимодействие с ДНК тесты, показывающие потенциальный наследственный эффект тесты для количественной оценки наследственных эффектов

         Рис. 5. Схема, предложенная Департаментом здоровья Великобритании (Brusick, 1988).

         Как видно, схема не детализирована и позволяет в принципе использовать более широкий набор тестов по сравнению со схемами OTS USA. Конкретное наполнение схемы может меняться при переходе от одной страны к другой, от одного класса химических загрязнителей к другому.

         Следует сказать, что в настоящее время не существует общепринятой процедуры оценки потенциальной генетической опасности химических соединений. Эти процедуры принятые в разных странах таких как Канада (Brusick, 1988), Япония (Ishidate, 1988; Shirasu, 1988), Россия (Дурнев и др., 2000), также как в случае США, Великобритании, о которых мы говорили выше, отличаются друг от друга. Тем не менее в основе всех этих процедур принятых в разных странах лежит сравнительно небольшой набор традиционных тестов, таких как тест Эймса, тесты по учёту генных мутаций и хромосомных аберраций in vitro, тесты по учёту цитогенетических нарушений in vivo, тест по учёту доминантных летальных мутаций у грызунов. Это связано в первую очередь с тем, что процесс валидизации вновь создаваемых тестов является весьма продолжительным и трудоёмким процессом. С помощью методов генной инженерии созданы специально для целей тестирования новые экспериментальные модели, такие как трансгенные мыши (Ashby et al., 1997), fish метод (Wyrobek et al., 1996; Hummelen et al., 1997; Baumgartner et al., 1999).

         Эти методы являются перспективными и с ними связывают будущее генетической токсикологии (MacGregor et al., 2000; Kirhland et al., 2000). Тем не менее в настоящее время международной конференцией ICEM в феврале 1993 г. в Мельбурне рекомендовано использовать следующие группы тестов (Report WSGTP, 1993): а) бактериальные тесты в) тесты по учёту генных мутаций в клетках млекопитающих in vitro с) тесты по учёту хромосомных аберраций в клетках млекопитающих in vitro д) учёт микроядер и хромосомных аберраций in vivo е) тесты на внеплановый синтез ДНК in vitro и in vivo. ж) тесты по учёту эффектов в половых клетках млекопитающих.

         Основные различия в схемах биотестирования применяемых в разных странах связаны с различиями в организации этапов общей процедуры тестирования и соответственно в формировании батарей тестов используемых на этих этапах. При этом основные различия связаны с организацией первого и в определённой степени второго этапа тестирования.

         Понятно, что отсутствие общепринятой процедуры регистрации генотоксичности химических соединений создаёт определённые трудности, особенно в условиях возникновения объединённой Европы. В последние годы предпринято ряд попыток разрешения этой проблемы в рамках специально созданной программы по гармонизации процедуры оценки генетической активности химических соединений (D'Arcy, Harron, 1998; Muller et al., 1999; Ashby, 1996).

         Эти трудности в значительной степени определяются отсутствием количественной меры для оценки эффективности тест-систем, батарей тестов и процедуры тестирования в целом.

         1.9. Оценка уровня потенциальной мутагенной опасности химических соединений

         Понятие генетического риска вещества включает в себя оценку возможных либо реальных генетических последствий его применения, в первую очередь, для человека. В отличие от генетического риска, генетическая опасность представляет внутреннюю характеристику, присущую данному веществу. Она отражает, во-первых, наличие или отсутствие мутагенной активности у анализируемого соединения и, во- вторых, при условии наличия этой активности, ее степень. Как уже говорилось, понятие мутагенности не абсолютно, а является видоспецифическим или, даже скорее, тест-специфическим признаком. Мутагены для одной системы могут оказаться и часто оказываются немутагенами в других тест-системах (Мепёе^Ьоп еХ а1., 1992). В этой связи, поскольку прямые наблюдения мутагенности в отношении человека практически отсутствуют, количественная оценка степени мутагенности для человека чрезвычайно затруднена. При определении уровней потенциальной генетической опасности в настоящее время, как правило, оценивается степень доказанности мутагенных свойств химических соединений по отношению к человеку (Тарасов, 1994, 1998). Реально все вещества по признаку мутагенной активности распределены в альтернативном пространстве событий (мутагены - немутагены). Однако наши знания, вес доказательств, имеющихся в нашем распоряжении, вероятность того, что конкретное химическое вещество принадлежит к одному ("да") либо к другому ("нет") классу, меняются при переходе от одного химического вещества к другому. В результате, эта вероятность (вес доказательств) определена в непрерывном либо дискретном пространстве событий от 0 до 1. Вес доказательств определяется степенью сцепленности, расстоянием между интересующими нас последствиями, выбранными нами в качестве отсчета, и имеющимися в нашем распоряжении данными, в том числе и ответами, полученными в ходе тестирования. Понятно, что прямая регистрация индукции мутаций в половых клетках человека имеет наивысший вес доказательств для оценки генетической опасности, но, если эти данные использовать для оценки канцерогенности, то эти результаты будут иметь меньший вес. Другими словами, вес доказательств зависит также от точки отсчета (стандарта). В качестве такового используются последствия (мутагенные или канцерогенные) у человека либо у мелких грызунов (крыс, мышей). В общем виде вклад различных групп тестов в оценку ответов у человека представлен схематически на рисунке 6 (Впшск , 1988).

         Рис. 6. Вклад различных групп тестов в оценку последствий у человека.

         Реально в полном объеме эта схема не во всех случаях реализуется. Если у нас по тем или другим причинам отсутствуют данные по грызунам in vivo, мы можем ограничиться прогностическим уровнем оценки, в других случаях использовать прямые наблюдения на человеке вместе с данными на грызунах, не учитывая данных, полученных на прогностическом этапе. Выбор реальной схемы оценки зависит от наших методических возможностей, а также от оценки величины генетического риска тестируемого соединения. В таблице 1 представлены 8 категорий, характеризующих уровни потенциальной мутагенной опасности в отношении половых клеток человека, предложенные Агентством по охране окружающей среды США (ШЕРА, 1989).

         Таблица 1. Категории доказательств (вес доказательств) для оценки потенциальной генетической опасности химических веществ в отношении человека.

         При этом понятия "достаточные" и "предполагаемые" доказательства характеризуют вес доказательств в отношении химического взаимодействия в гонадах.

         Достаточные доказательства включают в себя регистрацию факта взаимодействия химического вещества с ДНК или другими компонентами хроматина половых клеток либо индукцию внепланового синтеза ДНК или цитогенетических эффектов в половых клетках.

         Предполагаемые доказательства связаны с регистрацией косвенных неблагоприятных эффектов в половых клетках, таких как, например, аномалии морфологии сперматозоидов или обнаружение неблагоприятных репродуктивных эффектов, таких как снижение фертильности.

         Мы видим, что в силу недостатка наших знаний ранжирование химических веществ по уровню потенциальной генетической опасности в настоящее время не может быть обеспечено на строгом количественном уровне. Фактически в качестве меры используются логические и феноменологические представления, определенные в значительной степени на экспертном уровне. Естественно, в идеале необходимо стремиться к другой, более формализованной и строгой шкале оценок. Однако приведенная выше схема ранжирования загрязнителей среды отражает реалии сегодняшнего дня.

         Похожие диссертации на Количественная оценка эффективности тестирования и определения потенциальной мутагенной опасности химических соединений

         

         Принципы организации и оценка эффективности медико-генетической службы в РоссииМатулевич Светлана Алексеевна

         Цитогенетическая диагностика и оценка эффективности терапии хронического миелолейкоза ингибиторами тирозинкиназЗельцер, Анастасия Николаевна

         

         Комплексная оценка эффективности медико-генетического консультированияБаранова Елена Евгеньевна

         

         Эпидемиология врожденных пороков развития в Сургутском районе Ханты-Мансийского автономного округаАхмадщин Александр Юрьевич

         

         Оценка экологической опасности лигнинсодержащих соединений Яковлева Юлия Николаевна

         Клинико-морфологическая оценка эффективности соединения "Дегельм-14" при эймериозе курГиззатуллин, Рамис Разяпович

         

         Эколого-генетическая оценка эффектов соединений никеля и их модификация ретинолом Яковлева Марина Николаевна

         

         Модификация биохимических методов оценки содержания фосфорорганических соединений в пробах сложного составаПрокофьева Дарья Станиславовна

         Оценка влияния малолетучих органических соединений сточных вод южного промузла на качество воды р. Белой Фатьянова Евгения Валерьевна

         

         Сравнительная оценка воздействий экологически безопасных соединений лития на естественную резистентность и продуктивность цыплят-бройлеровПеньшина Елена Юрьевна