Введение к работе
Актуальность
Достижения последнего десятилетия XX века и начала XXI в области изучения молекулярной генетики главного комплекса гистосовместимости, или МНС (Major Histocompatibility Complex), существенно расширили представление о строении системы HLA (Human Leukocyte Antigens) и изменили возможность типирования антигенов гистосовместимости.
В основне этиологии мультифакториальных заболеваний, к которым относятся лейкозы, лежит генетическая компонента (Tayler G.M., 2002, 2008, 2009; Масчан М.А., 2007; Маякова С.А., 2009). Возникающие под воздействием различных эндогенных и экзогенных факторов (онкогенные вирусы, неблагоприятные факторы внешней среды, ионизирующая радиация и т. д.) мутации зародышевых клеток системы кроветворения приводят к различным изменениям кариотипа (Флейшман Е.В., 2007, 2009).
Ключевым моментом в иммунном распознавании аллоантигенов является презентация пептида Т-клеткам в комплексе с HLA-молекулами (Doherty Р.С, 1975; Zinkernagel R.M., 1974, 1997). С одной и той же молекулой МНС могут взаимодействовать разные патогенные пептиды, которые, однако, отличаются по сродству к этой молекуле, и, как следствие, возникает различной интенсивности иммунный ответ, способствующий развитию заболевания или устойчивости к нему (Хамаганова Е.Г., 2006; Зарецкая Ю.М., 2008).
Заболеваемость острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) практически в пять раз больше, чем острым миелобластным лейкозом (ОМЛ), частота встречаемости которого составляет 4-5 случая на 100000 детского населения в год (Tayler G.M., 2002, 2008, 2009; Масчан М.А., 2007; Маякова С.А., 2009). Популяционные исследования полиморфизма главного комплекса гистосовместимости свидетельствуют об ассоциативной связи генов главного комплекса гистосовместимости с острым лейкозом, как у взрослых, так и у детей (Dorak М.Т., 1992, 1996, 1999; Tayler G.M., 2002, 2008, 2009; Тананов А.Т., 1982; Хамаганова Е.Г., 1989; Зарецкая Ю.М., 2000; Рий А.А., 2007).
Имеются данные, полученные отечественными авторами, которые показали повышение частоты встречаемости антигенов В17 и В40, а также снижение частоты встречаемости антигена DR7 у больных детей с ОЛЛ (Тимонова Л.А., Румянцев А.Г., 1989).
Однако практически отсутствуют данные изучения взаимосвязи HLA-системы и вариантом острого лейкоза у детей. Не охарактеризованы особенности распределения HLA-маркеров предрасположенности и устойчивости к различным вариантам ОЛЛ и ОМЛ у детей, в зависимости от их пола. Не исследован генетический полиморфизм антигенов гистосовместимости здорового детского населения московского региона. Исходя из этого, настоящее исследование представляется актуальным.
Цель и задачи исследования
Цель исследования: изучить профиль генетического полиморфизма антигенов гистосовместимости у здорового детского населения московской популяции и у детей больных ОЛЛ и ОМЛ.
Задачи исследования
-
Осуществить выбор метода HLA-генотипирования адекватного для обработки большого количества образцов пуповинной крови, соответствующего стандартам NETCORD и требованиям EFI.
-
Провести оценку методов SSO (Sequence Specific Oligonucleotides) и SSP (Sequence Specific Primers) в детекции специфичностей (групп аллелей) и аллельных вариантов генов HLA системы.
-
Изучить генетический полиморфизм антигенов гистосовместимости у здорового детского населения московского региона.
-
Исследовать характер распределения специфических генов HLA-системы класса I и II при различных вариантах ОЛЛ у детей и в зависимости от пола ребенка.
-
Исследовать характер распределения специфических генов HLA-системы класса I и II при различных вариантах ОМЛ у детей.
-
Выявить HLA-маркеры предрасположенности и устойчивости к ОЛЛ и ОМЛ у детей.
Научная новизна
Впервые в России проведено широкомасштабное исследование генов HLA-системы па большом количестве образцов пуповинной крови с использованием высокотехнологических подходов (типирование методом SSO на автоматическом процессоре и методом SSP).
Впервые изучен характер распределения групп аллелей HLA-генов (специфичностей) класса I и II у здорового детского населения московского региона, выполненный на большом количестве материала. Установлено, что профиль генов HLA-системы у детского населения московского региона соответствует европеоидам.
Впервые получены данные об особенностях распределения специфических групп аллелей HLA-системы при ОЛЛ и ОМЛ у детей.
Охарактеризованы общие маркеры предрасположенности к развитию В-ОЛЛ у детей (HLA-специфичности Cw*04, DRB1*14 и DRB1*09), Т-ОЛЛ (HLA-специфичности DRB1*01, DRB1*13 и DQB1*05), ОМЛ (HLA- специфичности Cw*05 и С*07).
Выявлены маркеры с сильной ассоциацией и высоким риском развития заболевания на популяционном уровне для вариантов ОМЛ М2 и М7 (HLA-Cw*07) и варианта ОМЛ М5 (HLA-DQB 1*06).
Показаны характерные маркеры предрасположенности в зависимости от пола к развитию В-ОЛЛ: у мальчиков (HLA-специфичности В*50, Cw*16 и DRB1*14), у девочек (HLA-специфичности А*32, В* 15, -В*47 и DRB1*03); а также к развитию Т-ОЛЛ у мальчиков (HLA-специфичности А*26 и DRB1*13).
Выявлены характерные маркеры предрасположенности к развитию ОМЛ М2 (HLA-специфичности А*24, Cw*07 и В*51), ОМЛ М4 ( HLA-специфичности А*25, В*07, DRB1*12, Cw*05 и DQB1*06), ОМЛ М5 (HLA-специфичности А*68, DRB1*07 и DQB1*06) и ОМЛ М7 (HLA-специфичности В*39, В*49, Cw*07 и DRB1*11).
Показаны общий маркер устойчивости к заболеванию ОМЛ у детей (HLA-специфичность DRB1*07) и характерный маркер устойчивости к развитию В-ОЛЛ у мальчиков (HLA-специфичность DRB1*03), к развитию варианта ОМЛ М4 (HLA-DQB1*02).
Научно-практическая значимость
Научное значение имеет объективная оценка характера распределения специфических групп аллелей генов HLA-системы у здорового детского населения московской популяции с помощью молекулярно-генетического метода исследования. В результате выполненной работы предложен эффективный метод HLA-типирования большого количества образцов пуповинной крови (с применением технологий SSO и SSP), который может быть использован в медицинских учреждениях аналогичного профиля в России. Применение этого метода позволяет изучить особенности распределения генов гистосовместимости у детей больных острым лейкозом, обнаружить HLA-маркеры, определяющие риск или устойчивость к возникновению данного заболевания. Практическое значение работы вытекает из того, что установлены характерные специфические маркеры системы HLA в семьях, имеющих больного лейкозом ребенка, которые обуславливают максимальный риск к развитию заболевания. Впервые представлен в работе охарактеризованный профиль распределения генов главного комплекса гистосовместимости у здорового детского населения московского региона, который может быть использован в качестве контрольной группы в области изучения «HLA и болезни» и в популяционных исследованиях. Впервые создана база данных образцов ДНК больных детей с ОЛЛ и ОМЛ, которая может быть использована для дальнейших исследований.
Положения, выносимые на защиту
1. Типирование образцов пуповинной крови по локусам HLA-системы с
применением современных технологий молекулярной биологии является
необходимым чувствительным методом, требующим для исследования
минимального количества исследуемого материала.
2. Предложенный метод типирования образцов пуповинной крови, представленный
двумя технологиями ДНК типирования, такими как SSO и SSP, позволяет провести
быструю обработку большого количества биоматериала и получать достоверные и
однозначные результаты.
3. Исследование полиморфизма генов МНС позволяет изучить характер
распределения аллельных специфичностей HLA-системы среди детского здорового
населения московской популяции.
4. Изучение иммуногенетических особенностей при острых лейкозах у детей
позволяет обнаружить маркеры, определяющие риск или устойчивость к
возникновению заболевания.
Внедрение результатов в практику
Результаты исследования внедрены в практику работы Государственного учреждения здравоохранения «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения города Москвы», ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава.
По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ в России и за рубежом.
Материалы диссертации доложены на: XIV конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2010), 5-ой иммуногенетической международной конференции «East-West Immunogenetics Conference» (Пилсен, 2010), 36-ом Международном симпозиуме Европейской
группы ЕВМТ (Вена, 2010г.), III научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ» (Москва, 2010), 24-ой Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (European Immunogenetics and Histocompatibility Conference, EFI and 17-th the Italian Society for Immunogenetics and Transplantation, AIBT) (Флоренция, 2010).
Структура и объем диссертации
