Генетический контроль реакций фотосинтеза у ядерных мутантов гороха Божок Галина Владимирована

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор литературы 10

1.1. Характеристика пластидного генома 10

1.2. Исследование фотосинтетических мутантов 19

1.2.1. Идентификация ядерных генов, влияющих на активность 21

1.2.2. Идентификация ядерных генов, определяющих активность 30

1.2.3. Идентификация пластидных генов, определяющих активность 33

1.2.4. Идентификация ядерных генов, контролирующих обе фотосистемы 35

1.2.5. Овнаружение ядерных генов, контролирующих транспорт электронов между фотосистемами 36

1.2.6. Обнаружение мутаций, блокирующих энергообразовательную функцию. 41

1.2.7. Генетический контроль реакций,связанных с восстановлением НАДФ+ 42

1.2.8. Мутации, фенотипическое проявление которых' зависит от'влияния внешней 'среды.. 42

1.2.9. Выявление мутаций, ведущих к повышению активности фотохимических реакций... 44

2. Материал и методы 49

2.1. Объект исследования 49

2.2. Метод регистрации послесвечения 50

2.3. Метод электронного парамагнитного резонанса ... 52

2.4. Методы, характеризующие реакции'электронтранс-портной цепи хлоропластов 54

2.5. Определение содержания цитохромов 56

2.6. Определение фиксации С02 и продуктов фотосинтеза 5?

2.7. Определение активности карбоксилирущих ферментов 58

3. Генетическая и фенотипическая характеристика мутантов гороха 60

3.1. Анализ расщепления в потомстве гетерозиготных линий гороха 61

3.2. Исследование'аллелизма у пяти хлорофильных мутантов 68

3.3. Количественная характеристика растений, гетерозиготных по хлорофильным мутациям... 69

3.4. Исследования'микроскопического строения хлоропластов.. 72

3.5. Содержание хлорофильных пигментов и их спектральная характеристика 79

3.6. Обсуждение полученных результатов 83

4. Исследование углеродфиксирующей способности'у'мутантов гороха .и их исходных форм . 90

4.1. Исследование скорости фиксации углекислого газа 90

4.2. Включение меченого углерода в низкомолекулярные продукты метаболизма 92

4.3. Активность карбоксилирущих ферментов и пара метры'стабильности й' температурной активности РДФК 98

4.4. Обсуждение полученных результатов 108

5. Фотохимическая активность и содержание' цитохромов у. мутантов гороха и их исходных сортов 112

5.I. Замедленная флуоресценция нативных'листьев'и хлоропластов. 112

5.2. Исследование скорости восстановления ферри-цианида, НАДФ+ и пластоцианина. 115

5.3. Светоиндуцированные редокс-превращения эндогенного пластоцианина 121

5.4. Исследование сигналов электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) 123

5.5. Светоиндуцированные редокс-превращения цито-хрома 126

5.6. Спектральные характеристики цитохромов хлоро-пластов мутантов гороха и их исходных сортов 130

5.7. Количественное определение содержания цитохромов 137

5.8. Обсуждение полученных результатов 140

Заключение 149

Выводы 158

Литература

• Идентификация ядерных генов, влияющих на активность
• Идентификация ядерных генов, контролирующих обе фотосистемы
• Метод электронного парамагнитного резонанса
• Анализ расщепления в потомстве гетерозиготных линий гороха

Введение к работе

Исследование генетической автономии пластид, а также функциональных связей между локализованной в них генетической информацией и геномом ядра привлекает большое внимание исследователей, поскольку это открывает новые перспективы в понимании генетических систем, ответственных за эффективность превращения световой энергии в химическую и за формирование структур,в которых осуществляется этот процесс. В настоящее время установлено, что хлоропласты растений содержат свою собственную генетическую информацию, представленную несколькими идентичными молекулами хлоропластной ДНК.

Успехи в познании генетической организации пластома, связанные с развитием методов генной инженерии, клонированием отдельных генов хлоропластного генома, созданием рекомби-нантных молекул ДНК, установлением полной нуклеотидной последовательности отдельных генов хлоропластного генома, ставят вопрос о возможности использования знаний генетики фотосинтеза в практической селекции. Поскольку фотосинтез поставляет энергию, необходимую для всех биологических функций, а также определяет материальную основу, от которой зависят биосинтетические процессы, то он играет ключевую роль в продукционном процессе. Быстрый прогресс в исследованиях по генетике фотосинтеза позволяет надеяться, что в ближайшем будущем генетики и селекционеры смогут оценивать эффективность фотосинтеза разных растений не только по фенотипическим особенностям, но и непосредственно по генотипу.

Изучение генетики фотосинтеза показало, что помимо хло-ропластных генов многие гены, влияющие на структуру и функции фотосинтетического аппарата, локализованы в геноме ядра,. Установлено, что большинство функционально активных белков хлоропластов состоят из единиц, кодирующихся ядерными и хло-ропластными генами. Активно работающий фотосинтетический аппарат, определяющий метаболизм, рост и развитие растений, создается на основе тесного взаимодействия двух генетических систем - генома ядра и пластома.

Изучение фундаментальной природы взаимодействия этих генетических факторов растительной клетки в биогенезе и функционировании хлоропластов может открыть новые возможности усовершенствования самого фотосинтетического аппарата и путей повышения эффективности его работы.

Одним из возможных подходов изучения генетического контроля фотосинтеза у высших растений является выделение и изучение мутантов, у которых блокированы отдельные этапы становления и функционирования фотосинтетического аппарата. При этом наиболее удобными объектами исследования будут те организмы, у которых возможно сочетать физиолого - биохимический и генетический анализ.

В своей работе мы поставили задачу через исследование мутантних форм выяснить влияние генов ядра на определенные реакции фотосинтеза и создать генетическую модель, удобную для разрешения проблем взаимодействия и регуляции генетических систем растительной клетки. Нам представлялось важным исследовать у мутантов физиолого-биохимические параметры фотосинтетического аппарата, чтобы выявить взаимосвязь между генетической системой ядра и фотосинтетической активностью хлоропласта. Биохимическая характеристика мутантов и установление конкретных блоков в реакциях фотосинтеза дает возможность определить, какие из этих реакций контролируются генами ядра. Кроме того, биохимическая идентификация генетических блоков позволяет использовать мутанты в качестве модельных объектов в исследованиях механизмов фотосинтеза и его регуляции.

В качестве объекта исследования был выбран посевной горох ( Pisum sativum L. ) - растение, позволяющее сочетать генетические и физиологические методы анализа.

В работе решались следующие задачи:

1. Изучение генетической природы использованных мутантов гороха.

2. Исследование фенотипических проявлений индуцированной мутации у ядерных мутантов гороха.

3. Изучение активности карбоксилирующих ферментов и распределение меченого углерода в продуктах фотосинтеза у нормальных и мутантных растений гороха.

4. Анализ фотохимических реакций электронтранспортной цепи у ядерных мутантов гороха.

5. Количественная оценка отдельных компонентов электронтранспортной цепи у ядерных мутантов гороха и их исходных сортов.

Основные положения, которые выносятся на защиту:

1. Индуцированная хлорофильная мутация приводит к по -вреждению рецессивных неаллельных генов ядра.

2. Отсутствие углеродфиксирукщей активности связано с мутационными нарушениями фотохимических реакций, но не карбоксилирующих процессов.

3. Идентифицированные нарушения реакций фотосинтеза у исследованных мутантов гороха обусловлены мутациями ядерных генов.

4. Моногенные рецессивные ядерные мутации у исследованных линий гороха оказывают множественный плейотропный эффект.

Новизна.

На основании комплексного исследования фотосинтетического аппарата у пяти ядерных неаллельных рецессивных мутантов гороха впервые охарактеризованы последствия генетических нарушений ядра на всех этапах фотосинтеза у высших растений; определены компоненты, функциональная активность которых детерминируется ядерным геномом; выявлен плейотропный характер моногенных ядерных мутаций, влияющих как на активность многих фотосинтетических реакций, так и на структуру хлоропласта.

Практическая значимость.

Исследование биохимической детерминированности отдельных ядерных генов может оказаться очень полезным в установлении взаимосвязи между процессами фотосинтеза и продуктивностью растений. Изучение мутантов, у которых нарушен только один ядерный ген, контролирующий ту или иную реакцию фото -синтеза, поможет оценить значение этой реакции в процессах, обуславливающих общую урожайность растений. Осуществленное нами всестороннее исследование фотосинтетических мутантов гороха позволило установить роль ядерных генов в формировании и функционировании фотосинтетического аппарата.

Фотосинтетические мутанты гороха уже в настоящее время широко применяются как модельные объекты в изучении природы и молекулярных механизмов различных реакций фотосинтеза. Исследованные нами мутанты гороха с генетическим блокированием реакций ФС I и Ш П используются на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ для изучения и понимания природы замедленной флуоресценции. Эта же груша мутантов была использована сотрудниками Института фотосинтеза для установления механизмов регуляции темновых реакций фотосинтеза. Кроме своего основного научного значения, коллекция хлорофильных мутантов гороха используется на кафедре генетики и селекции Биологического факультета МГУ для учебных целей при демонстрации основных менделевских закономерностей расщепления. Нет сомнений, что в дальнейшем фотосинтетические мутанты гороха найдут еще более широкое применение в изучении самых разнообразных областей генетики, физиологии, биохимии и биофизики растений. 

Идентификация ядерных генов, влияющих на активность

Одним из хорошо исследованных мутантов, не проявляющих активности ФС П, является штамм Е -34, полученный Левиным с сотр. /69, 84,85/. Хлоропластные фрагменты этого мутанта не восстанавливали дихлорфенолиндофенол натрия (ДХФИФ) и НАДФ когда донором электронов являлась вода. В то же время скорость восстановления НАДФ+ от экзогенной пары ДХФЩ/аскорба-та натрия была значительной, что указывает на интактность ФС I. Анализ мембранных белков показал, что у этого мутанта отсутствует полипептид с молекулярной массой 47000, который связывают с функционированием реакционного центра ФС П /85/. Сравнение полипептидного состава тилакоидных мембран, выделенных из мутанта F -34 и из частиц, обогащенных ФС П, показало, что три главных компонента с молекулярной массой 50000, 47000 и 3000 прямо связаны с активностью реакционного центра ФС П и отсутствуют- у мутантного штамма /70/. Сходный фенотип с F -34 имеет и мутант hfd -49.. Хлоропластные фрагменты этого штамма не осуществляют реакцию восстановления НАДФ+, метилвиологена и бензохинона. Отсутствуют светоинду-цируемые изменения C55Q, предполагаемого акцептора электронов от ФС П /III/.

Интересные результаты получены с мутантом, несущим дополнительную мутацию гена-супрессора р-34, у которого на блюдали появление активности ФС П /85/ и с температурно-чув-ствительным штаммом Т4. У штамма Т4, выращенного при температуре 35С,отсутствует активность ФС П,в то же время у этого мутанта,выращенного при температуре 25С, наблюдается активность этой системы /85/. Появление активности реакций,присущих для ФС її, у супрессированного штамма F-34 и у темпе-ратурно-чувствительного штамма Т4,инкубированного в процессе роста при 25С, авторы связывают с наблюдаемой на электро-фореграммах тилакоидных мембран полосой с М.м. 47000 дальтон. Изучение ультраструктуры прямого и супрессированного мутантов F-34 показало, что у штамма,полностью лишенного активности ФС П, на наружной поверхности скола мембран тилакоидов о отсутствуют 160 А частицы, в то время как у супрессированного F-34 количество этих частиц составляло 50 % по сравнению с диким типом, и коррелировало с появлением активности ФС П /194/. Генетический анализ установил, что эти мутанты не ал-лельны /ИЗ, 135/. Можно полагать, что биосинтез полипептида тилакоидной мембраны с М.м. 47000 дальтон, который входит в реакционный центр ФС П, контролируется несколькими ядерными генами. Известно, однако, что биосинтез полипептида реакционного центра ФС П происходит на хлоропластных рибосомах /85, 88/. Возможно, что этот полипептид также как и белок 32000 дальтон синтезируется в виде более высокомолекулярного предшественника. Отделение низкомолекулярной части и встраивание его в мембрану может происходить под контролем ядерных генов. Возможно также, что гены ядра через регуляторний механизм каких-либо ядерных метаболитов контролируют процессы синтеза,осуществляющиеся в хлоропласте. Таким образом возможен целый спектр ядерных мутаций, фенотипическое проявление которых будет состоять в нарушении активности реакционного центра $С П.

У другой группы мутантов из коллекции Левина (ас-115 и ас-141) также было показано, что фотохимические реакции Ю П блокируются ядерной мутацией. Генетический анализ установил, что у ас-115 повреждение локализуется в I группе сцепления ядерной ДНК, а у ас-141-в Ш группе /135, 139/. Лаворель и Левин на основании изучения флуоресцентных свойств мутантных штаммов заключили, что у ас-141 и ас-115 изменен фотохимический центр электронов ФС її -q /130/. Кроме того,анализ спектров поглощения показал, что у данных мутантов отсутствует цитохром 559 /140/. Поскольку Q и цитохром 559 не идентичные компоненты, а ас-115 и ас-141 - моногенные мутанты и они не аллельны /135/, то возможно, что каждый мутировавший локус имеет значение в образовании или функционировании как цито-хрома 559, так HQ .Не исключено также, что эти локусы имеют только одну функцию образования цитохрома 559 HQ , а эти компоненты с близкими редокс-потенциалами вместе составляют реакционный центр ФС П.. Белки реакционного центра ФС її наряду с белками светособирающих комплексов и компонентами-перенос- чиками.электронов между реакционными центрами входят в состав многокомпонентных комплексов тилакоидной мембраны /199/.Причем, вероятно, при сборке активных фотосинтетических мембран очень важна строго определенная пространственная организация входящих в состав комплексов компонентов.

Идентификация ядерных генов, контролирующих обе фотосистемы

Кроме мутантов хламидомонады и высших растений, у которых мутация одного гена приводила к нарушению активности ФС I или ФС П, выделены мутантные штаммы с подавлением активности сразу обеих фотосистем.

Ладыгиным были получены моногенные ядерные мутанты хламидомонады ВФ-5 и ВФ-9, у которых анализ спектров ШР, кинетические кривые послесвечения, реакции фотовосстановления ДХФИФ и фотоокисление ДХШФ-Нз показали нарушение активности обеих фотосистем /19-21, 24, 26, 27/. В хлоропластах этих штаммов наблюдали образование гигантских правильных гран с полосой контакта между ними. Авторы предположили, что у этой группы, вероятно, отсутствует белок, наличие или активность которого необходимы для функционирования обеих фотосистем /45/. У этих мутантов не было ХБК I с полосой 66000 - 70000 дальтон и полипептидов 50000 и 20000 дальтон, входящих в комплекс ФС П /32/.

У мутанта кукурузы, у которого не наблюдали активности обеих фотосистем, на электрофореграммах отсутствовал комп -леке, содержащий реакционный центр ФС I, но присутствовали все белковые компоненты, принадлежащие ФС П /156/.

Скрещиванием штамма хламидомонады А-66, с нефункционирую-щей ФС 1,и штамма А-90, у которого отсутствовала активность ФС П, был получен гибридный штамм с неактивными обеими фотосистемами /24, 29/. Родительские штаммы с нефункционирующей ФС I (А-66) и ФС П (А-90) имеют повреждения одного гена. Независимое наследование мутаций А-66 и А-90 предполагает, что белки ФС I и ФС П кодируются разными генами. Гибридный штамм не обнаруживает максимумов поглощения хлорофилла при 689, 698 и 703 нм, составляющих антенну ФС 1,и нет поглощения при 685 нм - антенне ФС П. У гибрида имелся хлорофилл "в" и коротковолновой хлорофилл "а", составляющие антенну светособи-рающего комплекса /24, 29/. Ультраструктура гибрида сходна с ультраструктурой одногенного мутанта с потерей активности обеих фотосистем /45/. В клетках гибрида формируются большие "стопки" из близкорасположенных тилакоидов с отдельными точками контакта, но истинного слипания между ними не происхо-. дит /28, 29/. Авторы предполагают, что выключение функционирования обеих фотосистем можно достигнуть двояким путем.Мож-но выключить два гена, отвечающие каждый по отдельности за активность ФС I и ФС ПІ как это удалось достигнуть у гибридного штамма А-66-90 /24, 29/. В тоже время выключение из работы одного только гена у мутантов хламидомонады ВФ-5 и ВФ-9 и кукурузы приводит к аналогичному эффекту /26, 28, 32, 45, 156/.

Фотоокисленный реакционный центр ФС I - P?QQ восстанав ливается, получая электроны от первичного акцептора Ю П - Q через промежуточные переносчики, которыми являются цитохром f с максимумом поглощения при 553 нм и пластоцианин. Эти два компонента имеют очень близкий окислительно-восстанови -тельный потенциал. Поэтому долгое время последовательность их расположения в нециклическом потоке электронов трактовалась по-разному. По мнению одних авторов Pr,0Q получал электроны непосредственно от пластоцианина /161, І90Д другие же считали, что к реакционному центру ближе всего расположен цитохром f /197/. Окончательному установлению единой точки зрения помогли эксперименты, выполненные на мутантах. Левиным и др.был выделен мутантний штамм хламидомонады ас-208, у которого в результате мутации нарушена способность к синтезу пластоцианина /103, 104, 140/, Проведенный генетический анализ пока -зал, что мутация является моногенной и ядерной, а поврежденный ген локализуется в Ш группе сцепления /ИЗ, 135/,

У штамма ас-208 отсутствовало восстановление НАДФ+ как от воды, так и с электрондонорной парой ДХФИФ/аскорбат Na При добавлении к хлоропластным фрагментам мутанта пластоцианина, выделенного из штамма дикого типа, его фотосинтетичес-кая активность частично восстанавливалась. Нужно отметить,что у этого мутанта скорость восстановления ДХФИФ, акцептора цепи электронов только ФС П, хотя и имелась, но была снижена /103/. Выделение и частичная очистка препарата, содержащего пластоцианин, из штамма ас-208 не выявило в спектре поглощения полосы с максимумом 597 нм, присущей для этого белка. Реакционный центр ФС I P QQ присутствует у этого штамма, что было показано по светоиндуцированному изменению поглощения /135/.

Метод электронного парамагнитного резонанса

В настоящее время радиоспектроскопические методы являются одними из основных методов исследования структуры нативных биологических объектов. Применение метода магнитного резонанса для структурных исследований основано на том, что помимо извне приложенного постоянного магнитного поля, в котором наблюдается резонанс, в веществе существуют внутренние поля.Они могут привести к сдвигу резонанса, его расширению,расщеплению на несколько линий, т.е.к образованию спектра, изменению формы резонанса, его интенсивности и т.д.

В зеленых водорослях, листьях и хлоропластах высших растений наблюдается два фотоиндуцированных сигнала ЭПР: узкий синглетный бесструктурный сигнал и более широкий сигнал, обладающий сверхтонкой структурой. Узкий синглетный сигнал I ЭПР возникает только на свету и быстро исчезает после выключения света. Сигнал П наблюдается в темноте, увеличивается на свету и сохраняется долгое время после выключения света. Полагают, что сигнал П связан с системой выделения кислорода зелеными растениями /47, 89, 128, 191, 196/. Исчезновение сигнала П наблюдают одновременно с потерей способности хлоро-пластов осуществлять реакцию Хилла /143, 191, 198/. Сигнал I изучен более детально. В настоящее время установлено, что сигнал I ЭПР возникает при окислении светом фотоактивного пигмента P QQ /47, 50, 89, 196/. Этот сигнал не обнаруживается у мутантов с поврежденным реакционным центром ФС I /6,14, 89, 152, 198/. К.Н.Тимофеевым и А.Б.Рубиным было установлено, что освещение дальним красным светом Л 700 нм и красным светом Л = 600 нм приводит к различной кинетике сигнала I ЭПР /50/. Освещение красным светом уменьшает амплитуду сигнала I ЭПР, что, по мнению авторов, связано с увеличением электронного потока от СП к реакционному центру ФС I, вызывающему восстановление P7QQ» В этой работе было показано,что обработка листа диуроном, блокирующим цепь переноса электронов, приводит к уравниванию сигнала I ЭПР при освещении . объекта дальним и. ближним- красным светом. Таким образом, используя метод ЭПР, можно уже на нативных листьях определить, имеют ли мутанты повреждение в ФС П или в реакционном центре ФС

В настоящей работе исследование свободных радикалов Pr?QQ проводилось на модифицированном радиоспектрометре трех-сантиметрового диапазона ( v l04 мГц, что соответствует длине волны Л= 3 см); величина магнитного поля, создаваемо го электромагнитом, составляла 3000-4000 гс. Образец ( лист или хлоропласт) освещали в резонаторе светом лампы накаливания КШ-300 через водный тепловой и стеклянный светофильтры (KC-I4, Л 650 нм, Е = 20 Вт»м "2).

При освещении хлоропластов возникает фотосинтетический. электронный поток, который сопряжен с выделением 02» образованием АТФ и НАДФ-Н. Прежде, чем электрон, образовавшийся при фоторазложении воды, достигнет конечного своего акцептора г- НАДФ+, он проходит через ряд последовательных переносчиков. Кроме хинонов, все компоненты-переносчики являются белками, содержащими в своей простетической группе металлы.

. Применение искусственных доноров и акцепторов электронов с различными окислительно-восстановительными потенциалами позволяет выделить и изучить отдельные участки фотосистем. Первым искусственным акцептором, который использовал Р. Хилл в 1937 году при изучении действия света .на изолированные хлоропласта, был феррицианид. Реакция Хилла представляет собой комплекс начальных стадий фотосинтеза, связанных с фоторазложением воды. Образовавшийся электрон при участии ФС П способен восстанавливать введенные в реакционную смесь экзогенные акцепторы. Определение фотохимической активности изолированных хлоропластов регистрируется по изменению оптической плотности восстанавливаемых экзогенных красителей или полярогра-фически по измерению выделяемого или поглощаемого в реакции кислорода. В настоящее время определение фотохимической активности изолированных хлоропластов при использовании различных электрондонорннх и электронакцепторных систем широко используется в исследовании механизмов фотосинтеза и установлении поврежденного участка фотосистем у фотосинтетических мутантов.

Анализ расщепления в потомстве гетерозиготных линий гороха

Как видно из.этой таблицы, гетеротрофный рост мутантов на первых этапах осуществляется за счет органических веществ семени и. в процессе роста растения не увеличивают свою биомассу. Сухой вес 12-дневных проростков не превышает сухого веса семени, и с истощением питательных запасов растения погибают. Происходит это обычно к концу третьей недели.

Исследованиями, проведенными С.А.Гостимским и Т.А. Ежовой, было показано, что при реципрокных скрещиваниях мутан -тов с исходным сортом или с маркерными линиями гибриды F имеют нормальный-фенотип по окраске листьев, независимо от того, какая форма использовалась в качестве материнской ли -нии. Эти данные свидетельствуют о том, что полученные мутации являются ядерными /13, 15, 1.6/. Анализ расщепления в потомстве гетерозигот также подтвердил ядерную природу chlorina мутаций. Расщепление на нормальные зеленые и мутантные растения соответствовало 3:1, что свидетельствует о моногенном характере мутаций. Однако в некоторых случаях были получены отклонения от отношения 3:1.

В своей работе мы продолжили изучение расщепления в потомстве гетерозиготных растений.

Собирая отдельно семена со всех зеленых растений каждой линии, в последующих поколениях учитывали число расщепляющихся Как ранее /16/, так и нами показано, что для линий №5, В 19 и № 22 характер расщепления соответствует моногибридному. Выщепление одной части мутантных форм в потомстве гетерозигот свидетельствует в пользу ядерной рецессивной природы исследуемых мутаций. У линии В I расщепления в потомстве гетерозиготных: растений отличается от соотношения 3:1 и более подходит к соотношению 2:1. Это связано с присутствием наряду с хлорофильнои рецессивной мутацией рецессивной летальной мутации в гомологичной хромосоме. Т.А.Ежовой /15/ было показано, что летальная и хлорофильная мутации у линии В I сцеплены в фазе отталкивания и находятся на расстоянии около 8 морганид. Летальная мутация в гомозиготном состоянии приводит к гибели особей на ранних этапах эмбрионального развития.

У линии В 21 характер расщепления не соответствовал мо 67 ногибридному. Анализ отдельных гетерозиготных растений показал, что наряду с семьями, в которых наблюдали расщепление 3:1 были выявлены семьи, выщепляющие 15 частей нормальных и одну часть мутантных растений. Такую неоднородность в расщеплении можно объяснить тем, что данный фенотип у линии В 21 определяется наличием в гомозиготном состоянии двух рецессивных дупликатных генов аавв. Зеленые растения, выщепляющие I/I6 часть мутантов, являются гетерозиготами по обоим дупли-катным генам АаВв. Семьи, в которых происходит выщепление 1/4 части мутантов, являются гомозиготными по одному из рецессивных генов, но гетерозиготными по другому гену: ааВв или Аавв.

Скрещивание гетерозиготных растений линий № I, № 5,М9 и № 22 с маркерной линией "Новая форма" и анализ потомства F показал, что расщепление во всех случаях соответствовало моногибридному 3:1 (табл. 3.4).

Предварительная локализация мутаций, имеющих одинаковый внешний фенотипический эффект, может быть исследована анализом аллельных взаимоотношений. Для определения аллельности летальных мутаций скрещивали зеленые растения разных линий в полевых условиях во всех возможных вариантах. Все растения, участвующие в скрещивании, нумеровали и искусственно опыленные цветки снабжали этикетками с указанием номеров родителей. Гибриды, у которых гетерозиготным оказывался лишь один из родителей, высевали для определения частоты возможного самоопыления. Изучение фенотипа гибридов щ , у которых гетерозиготными оказывались оба родителя, определяет аллельные взаимоотношения данных мутаций. Если мутации аллельны, то среди гибридов F должно наблюдаться расщепление на нормальные и мутантные растения в отношении 3:1. Если мутации затрагивают различные гены, то все гибриды должны быть нормальными по фенотипу. Исследование аллелизма у пяти мутантов гороха не выявило наличие расщепления 3:1 (табл. 3.5).

Это свидетельствует о том, что мутация chiorina у данных линий, связанная с фенотипическим проявлением хлорофиль-ного дефекта, обусловлена разными генами. Появление небольшого количества мутантов у гибридов от скрещивания линий № 5 х № 19 и линий № 5 х № I не соответствует моногибридному расщеплению 3:1 и может быть объяснено результатом самоопыления растений, гетерозиготных по неаллельным мутациям.

Полученные неаллельные ядерные хлорофильнне мутации типа chiorina У всех исследованных пяти линий являлись летальными, и растения обычно погибали через 2-3 недели после появления всходов. Однако в начальный момент появления всходов мутантные и нормальные проростки не отличались друг от друга. Это дало возможность предположить, что гены, участвующие в процессах биосинтеза хлорофилла, возможно, не повреждены у данных линий. Видимый хлорофильный дефект развивается обычно на 5-7 день после появления всходов и, очевидно, обусловлен блокированием каких-то жизненноважных процессов, ведущих впоследствии к нарушению общего метаболизма растения.Вследствие гибели мутантных форм получение их для биохимических исследований возможно лишь только при выщеплении в потомствах гетерозиготных по данной мутации растений.