Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Показатели, определяющие продуктивность растения 9
1.1.1. Величина фотосинтезирующей поверхности как фактор продуктивности 11
1.1.2.Содержание хлорофилла как фактор продуктивности 13
1.2. Параметры фотосинтезирующего аппарата растений 14
1.3. Роль фитогормонов в росте и формировании фотосинтетического аппарата растений 16
1.3.1. Действие фитогормонов на физиологические процессы растений 16
1.3.2. Действие фитогормонов на формирование фотосинтетического аппарата 22
1.4. Характеристика листовых мутантов гороха 27
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 32
2.1. Объект исследования 32
2.2. Условия выращивания 32
2.3. Морфометрический анализ 34
2.3.1 .Определение сухой массы 34
2.3.2.Определение поверхностной площади 34
2.4. Определение процента сухого вещества 34
2.5. Определение продуктивности (первичной, конечной и семенной) 35
2.6. Измерение площади, затеняемой растением 35
2.7. Светоиропускающая способность посева 35
2.8. Анализ хлорофиллов 36
2.9. Анализ фитогормонов 37
2.9.1. Количественное определение цитокининов 37
2.9.1.1 .Выделение и очистка экстрактов 37
2.9.1.2. Иммуноферментный анализ цитокининов 38
2.9.2. Количественное определение ЛБК 39
2.9.2.1. Выделение и очистка ЛБК 39
2.9.2.2. Определение ЛБК методом газовой хроматографии 40
ГЛАВА 3. Результаты
3.1.Анализ роста и морфогенеза диких, а/и tl мутантов гороха 41
3.2.Содержание хлорофилла в автотрофных тканях мутантов 56
З.З.Особенности гормонального комплекса изучаемых генотипов 60
3.3.1. Содержание цитокининов в близко-изогенных линиях 60
3.3.2. Изменение содержания ЛБК в онтогенезе близко-изогенных линий 62
3.4. Продуктивность растений гороха с различной морфологией листа...66
3.5. Параметры фотосинтетического аппарата листовых мутантов 73
3.6. Светопропускающая способность посевов 79
Заключение 87
Выводы 88
Список литературы 90
- Величина фотосинтезирующей поверхности как фактор продуктивности
- Действие фитогормонов на формирование фотосинтетического аппарата
- Определение ЛБК методом газовой хроматографии
- Изменение содержания ЛБК в онтогенезе близко-изогенных линий
Введение к работе
Актуальность темы. Возможные подходы к получению форм растений с устойчивой продуктивностью неизменно привлекают внимание исследователей. Такие подходы обычно включают воздействие экзогенными факторами (в частности, синтетическими физиологически активными веществами (ФЛВ)) и выделение генотипов с заданными хозяйственно ценными свойствами. Культура гороха характеризуется высокой полегаемостью и, вследствие этого, потерями урожая и сниженной продуктивностью, особенно, в годы с высоким уровнем осадков. Учитывая это, генетики и селекционеры все чаще используют морфотипы с нетрадиционной архитектурой, в частности, с измененной морфологией листа.
Особое внимание уделяется афильному морфотипу, у которого в результате гомеозисной мутации по гену /(/"листочки преобразованы в усики. Благодаря сильному переплетению последних, посевы афилыюго гороха (генотип af) приобретают устойчивость к полеганию, что, в свою очередь, снижает потери урожая. Использование таких листовых мутантов позволяет избежать необходимость применения ретардантов и других ФЛВ, что обеспечивает экологическую чистоту получаемой продукции. До настоящего времени основное внимание физиологов растений было сосредоточено на вопросах реализации продуктивности листовых мутантов при их выращивании в регионах, различающихся климатом, при разных уровнях минерального питания и т. д. [Harvey, Goodwin, 1978; Дебелый, Князькова, 1986; Goldman, Gritton, 1992; Alvino, Leone, 1993; Вербицкий, Митропольский, 1994; Гужов и др., 1997; Zadorin et al., 1998; Амелин, 2001; Новикова, 2002]. При этом зачастую сравнивали неродственные между собой сорта
обычного и афильного типов, т.е. не учитывалась сортоспецифичность
(генетическое окружение, т.е. совокупность всех генов организма, не '
являющихся объектом данного исследования). Это объясняет нередкую противоречивость результатов исследований. Исходя из сказанного возникла необходимость углубленного морфо-физиологического изучения близко-изогенных по типу листа линий гороха в нескольких генетических окружениях. Это позволит оценить влияние как определяющих морфологию листа генов, так и генетического окружения (специфики сорта) на изучаемые параметры, а также выявить оптимальную модель архитектуры растения гороха, обеспечивающую его устойчивую продуктивность.
Цели и задачи исследовании. Целью работы явилось изучение зависимости между продуктивностью, размерами листового аппарата, содержанием в нем хлорофилла и фитогормонов у мутантов гороха с генетически детерминированными изменениями морфологии листа. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
Провести всесторонний анализ роста и морфометрических показателей различных компонентов растения у близко-изогенных линий гороха, отличающихся по морфологии листа.
Исследовать распределение содержания АБК и цитокининов в различных компонентах растения у близко-изогенных линий гороха, отличающихся по морфологии листа.
Изучить зависимость между размерами листового аппарата (ЛА), содержанием в нем хлорофилла (ХЛ) и продуктивностью близко-изогенных линий гороха.
Проанализировать приспособительные морфо-физиологические реакции листовых мутантов гороха с разной степенью полегаемости и взаимозатенения.
Научная новизна. Впервые доказано отсутствие зависимости между продуктивностью (общей и семенной), морфологией листа и содержанием в нем хлорофилла у близко-изогенных линий гороха. Приоритетными являются данные об одинаковых параметрах фотосинтетического аппарата (ФСА) (процентной доле хлорофилла в светособирающем комплексе (ССК) и отношению хлорофилла а/в), характеризующих эффективность функционирования ФСА, в различных компонентах листа дикого, afu //типов в нескольких сериях близко-изогенных линий. Одинаковая с листочковыми генотипами продуктивность а/ гороха с уменьшенными размерами листового аппарата и сниженным содержанием в нем хлорофилла, как экспериментально доказано, определяется неполегаемостыо, высокой светопропускающей способностью посева и доступностью световой энергии для верхних и для нижних листовых метамеров, особенно в постфлоральный период развития. В то же время, на ранних этапах онтогенеза - в предфлоральный период развития найдена положительная зависимость между накоплением общей сухой биомассы и размерами листового аппарата, а также содержанием хлорофилла в расчете на единицу площади посева. Впервые на близко-изогенных линиях доказано, что в предфлоральный период онтогенеза коэффициент корреляции между накоплением сухой биомассы и общим содержанием хлорофилла выше, чем между накоплением биомассы и общими размерами листового аппарата. Впервые измерено содержание цитокининов и АБК у листовых мутантов гороха. Выявлена положительная зависимость между содержанием цитокининов и размерами компонентов листа у дикого, а/ и // генотипов гороха. Найдено, что концентрация АБК увеличивалась в онтогенезе всех генотипов. Показано отсутствие зависимости между уровнем АБК,
размерами компонентов листа и содержанием в них хлорофилла. На основании полученных на близко-изогенных линиях данных сделан вывод о возможном участии цитокининов и АБК в реализации генетически детерминированных изменений морфологической программы развития листа гороха.
Научно-практическая значимость работы. Совокупность экспериментальных данных представляет интерес для развития фундаментальных и прикладных исследований морфогенеза листа и продуктивности растений. Экспериментальное обоснование оптимальной архитектуры растения гороха может быть использовано в селекционной работе для получения форм растений с улучшенной морфологией, обеспечивающей одинаковую с листочковыми формами продуктивность.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференции "Иммуноанализ регуляторов роста в решении проблем физиологии растений, растениеводства и биотехнологии" (Уфа, 2000); на 2-ой Международной конференции "Регуляция роста, развития и продуктивности растений" (Минск, ИЭБ НЛИБ, 2001); на Международной конференции "Genetic collections, isogenic and alloplasmic lines" (Novosibirsk, 2001); на Международной конференции "Актуальные вопросы в физиологии растений в XXI веке" (Сыктывкар, 2001); на IV Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений в биотехнологии" (Москва, МСХА, 2001); на IV и V Международном симпозиумах "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования" (Пущино, 2001, 2003); на 2-ой Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002); на 5-ом съезде ОФР России (Пенза, 2003).Эти
материалы обсуждались на заседаниях комиссии по аттестации аспирантов и стажеров ИФР РАН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ и одна статья находится в печати в журнале "Физиология растений".
Проведенные в диссертации исследования были поддержаны Российским Фондом Фундаментальных исследований (проект 01-04-48233).
Величина фотосинтезирующей поверхности как фактор продуктивности
Гормональная система представляет собой специализированную систему эндогенной регуляции процессов жизнедеятельности растения. На данный момент выделяют пять основных классов фитогормонов. Это - ауксины, гиббереллины, цитокинины, абсцизовая кислота и этилен. В последнее время доказана гормональная природа еще одного класса регуляторов роста - брассиностероидов [Хрипач, 1993; Mussig et al., 2003; Chono et al., 2003]. Кроме основных, существуют другие типы физиологически активных веществ: полиамины, фузикокцин, жасмоновая кислота и др., которые способны в той или иной степени имитировать свойства одного или нескольких известных гормонов [Полевой, 1982, 1989; Никелл, 1984; Уоринг, Филлипс, 1983; Коф и др., 1990; Кефели, 1994; Davies, 1995; Ucda et al., 1995; Муромцев, 1996; Shevyakova et al., 2001].
В большинстве случаев наибольшей активностью обладают свободные формы фитогормонов. Однако для проявления физиологического действия фитогормонов, по-видимому, необходима его рецепция на мембранах с помощью специфических гормон-связывающих белков [Кулаева, Кузнецов, 2002; Романов, 2002]. Основные регуляторные соединения гормонального типа образуются из аминокислот (ИУК, этилен), органических кислот (АБК, цитокинины, гиббереллины) или веществ стероидной природы (брассиностероиды). Синтез фитогормонов осуществляется главным образом в меристематических тканях. На определенных стадиях развития растений местом синтеза ИУК, АБК, гиббереллииов могут быть хлоропласты и митохондрии [Кулаева, 1982; Wightman, Fregeau, 1982; Fregeau, Wightman, 1983; Уоринг, Филлипс, 1983; Полевой, 1987; Кефели, Протасова, 1988].
В функции ауксинов входит регуляция роста клеток в фазе растяжения, синхронизация их деления in vitro, дифференцировка ксилемы, корнеобразование, прорастание пыльцы, завязывание и рост плодов [Campanoni et al., 2003]. Ауксины обусловливают апикальное доминирование, участвуют в регенерационных процессах и т. д. [Полевой, 1986; Kamisaka et al., 1988; Geine, 1994; Jackson, 1994; Davies, 1995; Kerstetter et al., 1997; Scarpella et al., 2002]. Наряду с гиббереллинами, ауксины ответственны за удлинение стебля интактного растения [Коф, 1991; Kof et al., 1994; Yang et al., 1996]. Действие ауксинов на мембранном уровне связано, по-видимому, с гиперполяризацией мембраны, сопряженной с выбросом протонов во внеклеточное пространство. За счет этого увеличивается пластичность клеточной стенки [Геринг, 1985; Полевой, Саламатова, 1991; Медведев, 1996; Kamisaka, Herrera, Zarra, 1988; Cleland, 1995]. На более поздних этапах, по данным этих авторов, ауксины вызывают активацию синтеза РНК и белков. Физиологическое действие, характерное для цитокининов, - это стимуляция клеточного деления. Эти вещества влияют на процессы растяжения и дифференцировки клеток, а также хлоропластов. Доказана роль цитокининов в формировании соцветий [Jones et al., 1995]. С помощью обработки цитокининами удается прервать покой семян, клубней и спящих почек, снять апикальное доминирование [Nandi et al., 1988; Vazgues-Ramos et al., 1990]. Регуляция старения экзогенным цитокинином проявляется в задержке возрастного распада хлорофилла, белка и РНК [Аверина, Шлык, 1981; Дерфлинг, 1985; Кузнецов и др., 1990; Кулаева, 1973, 1984, 1980, 1982; Grabski et al., 1996; Rupp et al., 1999; Чернядьев, 2000]. В настоящее время предполагается, что местом первичного действия цитокининов является мембрана. Изменение транспортных свойств мембран ведет к изменению активности ферментов, усилению синтеза РЫК и белка, что, в конечном счете, влияет на рост растений и обмен веществ [Кулаева, Кузнецов, 2002; Романов,2002].
Активность гиббереллинов проявляется в усилении роста стебля растений через стимуляцию роста клеток в фазе растяжения, усилении камбиальной активности. Гиббереллины активируют прорастание семян и рост плодов, а также активируют удлинение стебля, регулируют процессы цветения и оплодотворения [Ложникова и др., 1981; Коф, 1991; Phinney et al., 1984; Ingram et al., 1984; Reid, Howell, 1995; Spray et al., 1996; Gordon et al., 1999]. Полагают, что первичные эффекты гиббереллинов сходны во многом с первичными эффектами цитокининов [Муромцев и др., 1978; Муромцев, Агнистинова, 1984; Hedden et al., 1990; Zeevaart et al., 1990].
В роли антагониста ауксинов, гиббереллинов и цитокининов во многих тест-системах выступает абсцизовая кислота (ЛБК). ЛБК угнетает рост клеток в фазах деления и растяжения, подавляет рост стебля и прорастание семян, ускоряет опадение листьев, цветков и плодов [Xiong et al., 2003]. Однако в низких концентрациях она может оказывать стимулирующее действие на рост растяжением, ризогенез и другие процессы [Кефели и др., 1990; Коф и др., 1990; Chernys et al., 2000; Gonzallez et al.,2003]. Найдена отрицательная корреляция между содержанием абсцизовой кислоты и ростом листьев 4-х генотипов кукурузы [Cramer, Quarie, 2002]. Известно также, что АБК, накапливаясь при стрессах, играет большую роль в приспособительных реакциях растения к условиям окружающей среды [Полевой, 1982, 1989; Ракитина, Кефели, 1991; Уоринг, Филиппе, 1983; Hurley, 1999; Dietz et al., 2002; Cramer, Quarie, 2002; Xiong et al., 2003]. Предполагается, что в основе наблюдаемых эффектов лежит торможение ионного транспорта. Рассматривается также воздействие ЛБК на процессы транскрипции, трансляции и прямое влияние на активность ферментов [Bornman, 1983; Никелл, 1984; Кефели и др., 1990; Кулаева, Кузнецов, 2002].
Наряду с торможением удлинения стебля и активацией радиального роста, к наиболее известным эффектам, которые вызывает этилен, относится стимуляция процессов опадения, старения и созревания, подавление дифференциации тканей и участие в регуляции тропизмов. Известно, что этилен способен изменять транспортные свойства мембран и активность ферментов: повышать содержание пероксидазы и целлюлазы [Уоринг, Филиппе, 1983; Никелл, 1984;]. Суперпродукция этилена, также как и АБК, обуславливает устойчивость растений к стрессам, в частности, к УФ-радиации [Vlasov et al., 1996]. Это свидетельствует об участии перечисленных гормонов в процессах адаптации организма к неблагоприятным внешним факторам.
Действие фитогормонов на формирование фотосинтетического аппарата
Данные, полученные авторами, могут свидетельствовать о том, что фотосинтез тесно сопряжен с ростом.
На основе литературных и собственных данных Л. Т. Мокроносов [1981; 1983; 1985; 1988; Мокроносов, Гавриленко, 1992] обобщил взаимосвязь процессов роста и фотосинтеза в следующих тезисах: 1. Фотосинтетическая активность листа определяется эпигенетическими процессами таким образом, что усиление или торможение аттрагирующей активности зоны роста, дифференцировки или отложения веществ в запас сопровождается, как правило, адекватными изменениями интенсивности фотосинтеза. 2. Трофическое обеспечение процессов эпигенеза происходит при скоростях фотосинтеза значительно более низких, чем потенциальные возможности хлоропласта. При усилении запроса на ассимиляты сначала усиливается фотосинтетическая активность единицы площади листа, затем увеличивается площадь листьев. 3. Связь между донором и акцептором осуществляется через систему флоэмного транспорта и регулируется фитогормонами и концентрацией эффекторных метаболитов. 4. Между донором и акцептором формируются временные промежуточные фонды ассимилятов, чем обеспечивается частичная автономность функций фотосинтеза и роста. 5. В онтогенезе листа происходит постепенная смена акцепторной функции (начальная фаза развития) на донорную (зрелый лист). В действии фитогормонов на формирование и функционирование фотосинтетического аппарата Мокроносов выделяет два основных уровня [Мокроносов, 1983]. Прямое действие гормонов достигается путем быстрого изменения скорости процессов (влияние на состояние мембран, активность ферментов, уровень фотосинтетического фотофосфорилирования и др.). Более медленная реакция связана с действием гормонов на экспрессию генов и сопряженные процессы биогенеза основных функциональных систем фотосинтетического аппарата. Второй уровень - дистанционное влияние рост-регулирующих веществ на фотосинтез, опосредованное процессами эпигенеза и активностью донорно-акцепторной системы. Таким образом, ведущую роль в процессе взаимодействия роста и фотосинтеза автор отводит метаболитной системе регуляции.
Известно множество гомеозисных мутантов гороха Pisum sativum L., приводящих к изменению морфологии листа. Гомеозис - это резкое изменение строения органа или развития нового органа на месте другого. Обычный лист гороха (генотип AfAfTlTl StSt) характеризуется парой хорошо развитых прилистников, расположенных проксимально, и одной или несколькими парами листочков вдоль центральной листовой оси, переходящей в умеренно развитые усики.
Существует множество мутаций, приводящих к изменению морфологии листа гороха. Это рецессивные мутации "ins" и "imi" и другие [Berdnikov et al., 2002], вызывающие изменение морфологии листа в онтогенезе растения.
Наиболее полно изученными мутациями является мутация по генам Af, ТІ и St (Рис. 1). Мутация по гену Af (генотип af/aj) меняет нормальный морфогенез таким образом, что листочки заменяются многократно разветвленными, гипертрофированными и сильно переплетенными усиками. Впервые безлисточковые (афильные) формы с усатым типом листа были выделены как спонтанные мутанты в 50-х годах Kujala [1953] и Соловьевой [1958].
Мутация по гену ТІ (генотип /////) приводит к замещению усиков листочками и формированию акациевидного листа [White, 1917; Marx, 1987].
Мутация по гену St (генотип st/si) приводит к уменьшению размеров прилистников и формированию мелких полоскоподобных образований [Gritton, 1972; Marx, 1987]. Взаимодействие мутантных генов af tl и st (генотип afaf tltl stst) продуцирует растения с сильно разветвленным черешком, множеством мелких листочков и уменьшенными ланцетовидными прилистниками (рис.1.) [Wehner, Gritton, 1981]. В разных комбинациях эти гены продуцируют большое количество листовых типов [Гужов, 1984]. В дальнейшем тип листа мы будем обозначать, называя только гены в гомозиготном рецессивном состоянии, обозначая их как генотип.
Gritton [1986] приводит подробное описание процедуры получения близко-изогенных по морфологии листа линий. Она состоит в шестикратных прямых и обратных (backcross) скрещиваниях. Это приводит к замене дикого гена соответствующим мутантным почти на 100% (98,45%). Изучение физиологических основ роста листовых мутантов гороха уже несколько десятилетий привлекает внимание исследователей. В ряде работ проводилось изучение не изогенных линий, а неродственных между собой сортообразцов [Snoad et al., 1972; Snoad, 1974; Davies, 1977]. Во многих случаях проводились измерения листовых параметров и продуктивности этих форм вне зависимости от специфики генетического окружения (исходного сорта) и условий выращивания (минерального питания, водоснабжения, регионов выращивания) [Harvey, Goodvin, 1978; Lafond, Evans, 1981; Goldman, Gritton, 1992].
Лишь получение близко-изогенных по этим генам линий сделало возможным исключить влияние специфики сорта (генетического окружения) и изучить влияние соответствующей мутации на рост, продуктивность и гормональный статус растений гороха.
Как видно из литературного обзора, накоплено большое количество экспериментальных данных относительно соотношения между содержанием хлорофилла, площадью листового аппарата, и продуктивностью растения. Получены также данные о влиянии фитогормонов на формирование фотосинтетического аппарата и интенсивность фотосинтетической ассимиляции углекислоты. Однако имеется много противоречий и нерешенных вопросов. Более того, внимание экспериментаторов не привлекали вопросы влияния фитогормонов на размеры компонентов листа гороха, не изучалось соотношение между размерами листового аппарата, содержанием хлорофиллов, параметрами фотосинтетического аппарата и конечной продуктивностью растений. Для решения этих вопросов была предпринята настоящая работа, цели и задачи, которой изложены в разделе "Введение".
В качестве объектов исследования были использованы близко -изогенные по генам Af и 77 линии гороха Pisum sativum L. с обычным (генотип AfAfTlTl), афильным, т.е. безлисточковым, "усатым" (генотип afafTlTl) и акациевидным, "безусым" (генотип AfAftltl) листом (рис. 2) в нескольких генетических окружениях: Alsweet, New Season, New Line Early Perfection (NLEP), Dark Skin Perfection (DSP). Использование в экспериментах tl растений (с контрастным по отношению к af генотипу размером ЛА) позволило полнее оценить значение морфологии листа на изучаемые параметры растения и посева. Близко - изогенные линии селекции проф. E.Gritton (США) получены через ВИР им. И.И. Вавилова. Были изучены также сорта Орловчании (генотип Af/Af), характеризующийся обычным типом листа, и Норд (генотип af/af) -афильиого типа селекции ВНИИЗиКК. Ген Af локализован в первой, а ген ТІ — в пятой хромосоме гороха Pisum sativum L.
Определение ЛБК методом газовой хроматографии
Цитокинины определяли у растений дикой, а/ и // близко-изогенных линий серии Alsweet. Для анализа использовали растения в фазе 7-8 полностью сформированных настоящих листьев. Этот период для серии Alsweet предшествует переходу растения к флоральному морфогенезу. Для анализа использовали компоненты двух субапикальных практически завершивших или завершающих формирование листьев и расположенное между ними междоузлие. Апикальные и базальные части растения не анализировали.
Фиксацию и хранение тканей проводили так же, как для определения пигментов. Цитокинины выделяли из навески растительного материала, растирая его в маленькой ступке с жидким азотом, потом заливали 80-процентным этиловым спиртом с антиоксидантом бутилированным гидроокситолуолом (ВНТ) (10мг/л). Ткань заливали этиловым спиртом в соотношении 1/10 и оставляли на ночь в холодильнике при 4 С.
Затем растительный экстракт отделяли от супернатанта, промывали осадок охлажденным этиловым спиртом. Объединенный спиртовой экстракт упаривали под вакуумом. Водный остаток замораживали при -20 С. Из оттаявшего экстракта гексаном удаляли примеси. Доводили водную фазу до рН 8 40-процентным КОН. Водную фазу с рН 8 наносили на Sep-pak С-18 концентрирующей патрон (Separon SGX) и промывали водой. С С-18 патрона образец снимали 10мл 80-процентного этилового спирта. Спиртовой экстракт упаривали до водной фазы, проверяли значение рИ, которое должно было соответствовать 8. Цитокинины экстрагировали бутанолом и упаривали досуха.
Количественное определение цитокининов проводили методом иммуноферментпого анализа (ИФЛ) [Кудоярова и др., 1989]. Концентрацию гормона определяли по калибровочной кривой.
Твердофазный иммуноферментный анализ проводили на полистироловых планшетах, которые использовали в качестве сорбента. Планшеты сенсибилизировали коныогатами белок —гормон в карбонатном буфере (рН 9,2) в течение ночи при +4С. По окончании сенсибилизации, как и на всех последующих этапах, планшеты трижды промывали фосфатно-солевым буфером, содержащим Твин 20 (0,05 %).
В каждую лунку вносили по 90 мкл фосфатно-солевого буфера, содержащего 0,5-процентного балластного белка (бычьего сывороточного альбумина), 10 мкл исследуемого образца и стандарта, 100 мкл антисыворотки к изучаемому гормону. Инкубировали 1 час при 37 С. Планшеты промывали так же, как указано выше. Затем в каждую лунку добавляли 200 мкл антивидового пероксидазного коныогата и инкубировали на 1 час. После этого планшеты опять промывали и вносили 200 мкл субстрата орто-фенилдиамина для оценки содержания гормона. После развития окраски реакцию останавливали добавлением 50 мкл 4н H2SO4. Учет результатов проводили спектрофотометрически на спектрофотометре (Multiscan).
В отличие от цитокининов, абсцизовую кислоту определяли в онтогенезе растений серии NLEP. Гормон выделяли из навески растительного материала 80-процентным этанолом с добавлением антиоксиданта ВЫТ (10 мг/л). Спиртовой экстракт упаривали до водной фазы. С помощью гексана удаляли примеси. После этого водную фазу подкисляли 1-процентной НС1 до значения рН 2,5-3. Затем гормон выделяли из водной фазы в диэтиловый эфир. Выделенный в диэтиловый эфир гормон переводили в 1-процентный бикарбонат натрия. Эфир отбрасывали. После экстракции проверяли значение рН, которое соответствовало 8-8,5. Подкисляли гормональную фазу и удаляли пузырьки воздуха на ультразвуковой бане. Переносили гормональную фазу на предварительно промытый подкисленный С-18 Sep-pak концентрирующий патрон.
Вставляли патрон в систему с колонкой (9ммх20см), наполненную Sephasorb HB-Ultrafine. Для перенесения образца с патрона на колонку включали микронасос Mikrotechno В-750. Первые 10 мл спирта, которые выходили с колонки отбрасывали. Затем фракцию АБК собирали в колбу. После этого колонку промывали и готовили ее для следующего образца.
Приготовление летучих производных для газохроматографи ческого анализа. Метиловый эфир ЛБК получали, добавляя 200 мкл раствора диазометана в ацетоне, полученного из нитрозометилмочевины в генераторе диазаметана Wheaton Scientific (США) [Pierce, 1987] к очищенной и высушенной фракции, содержащей ЛБК. Реакцию метилирования проводили при 0С в течение 10 мин. После завершения реакции образец высушивали в токе азота при 35 С, растворяли в 100-500 мкл ацетона, отбирали шприцем 1-5 мкл и анализировали методом газовой хроматографии.
Условия газохроматографического анализа. Количественный анализ проводили, используя газовый хроматограф Газохром 1109 (СССР), снабженный детектором электронного захвата с 63Ni источником радиоактивного излучения. Колонка 10м х 0.53мм ИР-17 (Hewlett-Packard, США). Газ-носитель — азот: подача на колонку со скоростью 1 мл/мин. Температурный режим — изотермический. Температура детектора соответствовала 250 С, инжектора - 250 С. Температура колонки - 250С. Время удерживания Ме-ЛБК - 6 мин.
В связи с гетерогенностью тканей листа анализировали отдельно ткани каждого из его компонентов. Все определения для сортообразцов Орловчанин и Норд, а также для близко-изогенных линий серии Alswect проводились в предфлоральный период. Растения серии NLEP с длинным вегетационным периодом анализировали на разных фазах онтогенеза.
Изменение содержания ЛБК в онтогенезе близко-изогенных линий
Известно, что одна из функций ЛБК состоит в активации разгрузки флоэмы в органах - акцепторах [Thorne, 1985; Clifford et al., 1986; Brenner, Cheikh, 1995]. Кроме того, повышенное содержание ЛБК в тканях этих компонентов может быть связано со способностью гормона регулировать апертуру устьиц [Davies, 1986; Zeevaart, Creelman, 1988; Mansfield, 1990; Davies, 1995] и этим поддерживать тургесцентость растения, обеспечивая нормальный водный баланс и предохраняя его от избыточной потери воды в период активного роста. Это особенно важно для растений листочковых генотипов (AfAf Т1Т1 и А/А/ tltl), которые отличались от а/ (генотип а/а/ 7777) большей площадью листовой и, соответственно, транспирационной поверхности. Более того, по данным ЛІУІПО и Leone [1993], количество устьиц на единицу поверхности листочков и прилистников значительно больше, чем усов.
Известно, что ЛБК подавляет рост взрослых растений [Кефели и др., 1989; Коф и др., 1990; Davies, 1995]. Однако повышенное содержание ЛБК в активно растущих тканях часто сочетается с быстрым ее ростом. Активный рост листа на фоне высоких уровней гормона может объясняться снижением чувствительности тканей к ЛБК [Eze, 1981; Коф и др., 1990]. В данном случае, высокая концентрация гормона, скорее всего, обеспечивала нормальную тургесцентность растения.
В нашем случае, ЛБК, как оказалось, не являлась антагонистом цитокининов в действии на накопление хлорофиллов в различных компонентах листа (рис. 20 Л, Б, В и 18), поскольку содержание пигмента коррелировало с размерами компонентов. В то же время, пониженный уровень ЛБК в тканях а/- генотипа и повышенное его содержание в пластинках прилистников и листочков у // - генотипа может свидетельствовать о важной роли этого гормона в поддержании нормального водного обмена растения гороха.
Таким образом, использование близко-изогенных линий позволило изучить влияние именно листовых мутаций на гормональный комплекс растения и исключить действие на него специфики исходного сорта. Полученные на близко-изогенных линиях данные свидетельствуют о возможном участии фитогормонов в реализации генетически детерминированных изменений морфологической программы развития листа гороха.
Представление о решающей роли размеров листового аппарата в реализации продуктивности растения довольно долго оставался постулатом физиологии растений [Watson, 1947; 1958; Ничипорович и др., 1961; Ничипорович, 1977]. Детализация исследований показала, что продуктивность определяется ассимилирующей деятельностью не только листа, но и других хлорофиллоносных органов [Кумаков, 1967, 1972; Нальборчик, 1980]. Были получены также результаты, в которых биологическая продуктивность в большей степени коррелировала с содержанием хлорофилла [Brougham, 1960; Тарчевский, Андрианова, 1980; Андрианова, Тарчевский, 2000]. Однако, как правило, все упомянутые исследования проводили на растительных сообществах или неродственных между собой формах или сортах растений. Варьировали лишь условия или регионы выращивания [Дунаева и др., 1989; Андрианова, Тарчевский, 2000; Дуденко и др., 2002]. Это могло повлиять на корректность полученных выводов. Использование в наших опытах близко-изогенных линий с генетически детерминированным изменением морфологии листа и, вследствие этого, с измененными размерами листового аппарата и величинами содержания хлорофилла в растении позволило вплотную подойти к решению вопроса о важнейших факторах, определяющих продуктивность растения.
Прежде всего, следует отметить, что содержание хлорофилла и площадь листового аппарата варьировали в зависимости как от генотипа, так и от генетического окружения (серии близко-изогенных линий) (рис. 4, 7, 9, 16, 17, 18). Несмотря на эти различия, во всех случаях найдена одинаковая тенденция. Накопление сухой биомассы растениями с 1 м посева в предфлоральный период онтогенеза находилось в прямой зависимости и от площади листового аппарата, и от содержания хлорофилла в расчете на единицу площади посева (рис. 21).
Это подтверждают положительные коэффициенты корреляции между накоплением биомассы в предфлоральной фазе развития, с одной стороны, и показателями тотальных поверхностной площади и содержания хлорофилла, с другой (рис.21, 22). Однако коэффициент корреляции между накоплением биомассы в этот период и содержанием пигментов оказался несколько выше (г=0,89), чем между накоплением биомассы и поверхностной площадью (г=0,80) (рис. 21, 22). Подобные данные, были получены ранее на смешанных растительных сообществах [Bray, 1960; Madison, Anderson, 1963; Tieszen, Johnson, 1968]. Позднее они были подтверждены [Тарчевский, Андрианова, 1980; Андрианова, Тарчевский, 2000]. Между тем оставались в силе и утверждения других исследователей, постулировавших решающую роль размеров площадей листового аппарата посева в накоплении им биомассы [Watson, 1947; Ничипорович, 1977; Кумаков и др., 1994].
Полученные нами на близко-изогенных по морфологии листа линиях гороха данные свидетельствуют о возможности использования обеих этих величин (содержания хлорофилла и поверхностной площади растения) для оценки биосинтетической способности посева. Однако содержание хлорофилла в большей степени отражало истинную картину зависимостей (рис. 21, 22).
Несмотря на существенные различия между изучавшимися генотипами по поверхностной площади их листового аппарата и содержанию в нем хлорофилла, которые сохранялись в течение всего онтогенеза (рис. 5, 7, 9), их общая и семенная продуктивность в конце / вегетационного периода оказались практически одинаковыми (рис. 23, / 24).
