Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 18
1.1. Стресс. Эволюция представлений 18
1.1.1. Стресс наорганизменном уровне 18
1.1.1 А. Определение понятия "стресс" 18
1.1.1.2. Стресс и нейроэндокринио-иммунная система 24
1.1.1.3. Стресс и репродукция 30
1.1.2. « Стресс» на клеточном уровне 34
1.1.2.1. Сигнальная трансдукция 34
1.1.2.2. Система белков теплового шока 42
1.1.2.3. Апоптоз 44
1.1.2.4. Оксидативпый стресс 46
1.1.2.5. Геномный стресс 50
1.1.3. Стресс на уровне популяций 52
1.1.3.1. Стресс в популяциях мелких млекопитающих 53
1.1.3.2. Стресс как движущий фактор эволюции 56
1.1.4. «Стресс» и «норма реакции генотипа» 59
1.2. Ольфакторпыс стрессы в жизни млекопитающих 64
1.2.1. Эволюция хемокоммуникациопных механизмов 64
1.2.2. Роль феромонов в жизни млекопитающих 66
1.2.3. Химическая природа феромонов млекопитающих 69
1.2.4. Пути передачи ольфакторных сигналов в центральной нервной системе 74
1.2.5. Механизмы внеклеточного транспорта ольфакторных сигналов. Роль одорапт-связьшающих белков 78
1.2.6. Механизмы рецепции и внутриклеточной трансдукції» ольфакторных сигналов 84
1.2.7. Изучение механизмов развития ольфакторных стрессов у грызунов 87
1.3. Генетические аспекты изучения феромоналъных эффектов 91
II. Материалы и методы 100
2.1. Материал 100
2.2. Методы 102
2.2.1. Стрессирование мышей феромонами 102
2.2.2. Используемые стрессоры 104
2.2.3. Электрофорез главных белков мочи мышей 107
2.2.4. Анализ половых клеток самцов мышей на стадиях метафазы I и II 107
2.2.5. Анализ аномалий головок спермиев 111
2.2.6. Анализ делящихся клеток костного мозга мышей 113
2.2.7. Тест на «доминантные летали» 116
2.2.8. Оценка наличия норадрепалипа в нервных окончаниях слизистых оболочек 118
2.2.9. Оценка локомоторной активности нейтрофилов периферической крови 119
2.2.10. Оценка степени фагоцитоза 120
2.2.11. Оценка активности перекисного окисления липидов 122 - 124
2.2.12. Статистическая обработка полученных данных 124 - 124
III. Результаты и обсуждение 125-201
3.1. Отработка модели изучения влипни я стресса, индуцированного летучими веществами мочи, на сперматогенезу домовой мыши. Фсромоналышя регуляция репродуктивной функции 125-145
3.2. Влияние феромонов па костный мозг и клетки иммунной системы домовой мыши 145-167
3.2.1. Анализ нарушений митоза в клетках костного мозга мышей после феромонального воздействия 145-153
3.2.2. Анализ локомоторной активности и фагоцитирующей способности иммунокомпетентных клеток периферичес кой крови мышей после феромонального воздействия 153-167
3.3. Пути и механизмы действии феромонов на рсципиентпын организм у мышей 167-201
3.3.1. Удаление вомероназалыюго органа модифицирует цитогенетический эффект 2,5-ДМП 167-169
3.3.2. Изменения концентрации нейромедиаторов в слизистой оболочке носа и сосудистой оболочке семенников 170-171
3.3.3. Феромональная активация c-fos и c-jitn в клетках семенников молодых самцов мышей линии СВА 171-174
3.3.4. Изменения процессов перекисного окисления липидов при действии феромонов 175-181
3.3.4.1. Переписное окисление липидов в тканях костного мозга 175-176
3.3.4.2. Перекисное окисление липидов в тканях семенников 176
3.3.5. Изучение связи феромонапі.ньїх стрессоров с главными белками мочи 181
3.3.6. Цитогенетические эффекты структурно сходных или различающихся феромонов 194
IV. Заключение 202
V. Выводы 212
IV. Список литературы
- Стресс. Эволюция представлений
- Стресс» на клеточном уровне
- Стрессирование мышей феромонами
- Отработка модели изучения влипни я стресса, индуцированного летучими веществами мочи, на сперматогенезу домовой мыши. Фсромоналышя регуляция репродуктивной функции
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Все живые организмы обладают уникальной способностью реагирования на изменения окружающей среды для адаптации к этим изменениям. Достижение этой цели обеспечивают эволюционпо сложившиеся специфические механизмы рецепции внешнего сигнала, его трансформации и трансдукции к соответствующим эффекторам как на уровне одноклеточного, так и многоклеточного организма. Адаптивность ответа "живого организма определяется специфичностью (соответствием между поступающими извне сигналами и системами реагирования на них), а также силой и быстротой ответа.
У высших многоклеточных и, в частности, млекопитающих адекватность ответа определяется работой единой нейро-эпдокрипно-иммуниой системы (НЭИС). Эта система обеспечивает не только специфичность рецепции и трансдукции поступающего сигнала, но и формирует интегральный многокомпонентный ответ. Такой ответ имеет своей целью достижение максимально возможной адаптации к возникшему изменению. Он может включать в себя многочисленные изменения генетических (экспрессия генов), физиологических (эндокринных, иммунных, поведенческих и др.) и даже, если необходимо, морфологических характеристик животного (см. сб. «Современные концепции эволюционной генетики», 2000). При этом наряду со специфическими реакциями, в ответ па воздействие могут вовлекаться и более общие механизмы (эволюционно более древние), пытающиеся обеспечить адаптацию путем поддержания внутриорганпзменного и внутриклеточного гомеостаза. Их действие часто обозначают термином "стресс".
С момента появления в научной литературе терминов "стресс" и "стрессор" (Selye, 1936) прошло уже более шестидесяти лет. Создатель этих терминов и автор концепции "стресса" (или "общего адаптационного синдрома") Ганс Селье сам на протяжении многих лет способствовал ее развитию. Подразумевалось, что на действие некоторых факторов окружающей среды (стрессоров) "живая материя" отвечает неспецифическим напряжением, "которое проявляется реальными морфологическими изменениями в различных органах и особенно в эндокринных железах, контролируемых передней долей гипофиза" (Селье, 1960). При этом было очевидно, что под "живой материей" Селье понимал достаточно сложно организованные многоклеточные организмы с развитой нейроэпдокриииой системой, так как напряжение гипоталамо-гипофиз-адрспокортикалыюй системы являлось (по Селье) отличительной чертой любого стресса. Развитие науки привело Селье к пониманию того, что каждый стрессор наряду с неспецифическим (стрессорным) действием оказывает и специфическое влияние на реципиентный организм. Взаимодействуя между собой, эти две составляющие могут оказывать существенное влияние друг па друга (Селье, 1960).
В настоящее время конкретное содержание термина "стресс" может существенно отличаться в зависимости от того, на каком уровне изучается реакция: клеточном, организменном или падорганизменном. Этому способствовало обнаружение неспецифических форм адаптивного ответа на стрессоры на уровне единичной клетки. Обнаружение систем генов раннего ответа, белков теплового шока, апоптоза и псрекисного окисления лииидов наполнило понятие "общего адаптационного синдрома" новым "генетическим" содержанием. Стало формироваться представление о стрессе, как об очень древнем механизме адаптивного ответа на стрессоры окружающей среды, который возник еще у одноклеточных. Значимость стресс-реакции оказалась настолько велика, что определила эволюционный консерватизм ее отдельных звеньев у достаточно далеко отстоящих друг от друга живых организмов. Таким образом, содержание понятия "стресс" непрерывно эволюционировало, расширялись рамки его применения.
Особенно важным оказалось понимание значения внутриклеточного гомеостаза для нормального протекания генетических процессов и, в частности, мутационного (Керкис, 1940; Лобашев, 1947; Хромов-Борисов, 1976). Стало появляться все больше данных о влиянии нейроэндокринной системы иа генетические процессы (Лобашев и др.,1973; Лопатина и др., 1975). Изменения уровня хромосомных аберраций в некоторых органах и тканях при адреналэктомии, денервации, гормональных инъекциях доказывали существенное влияние нейроэндокринной системы животных на мутационный процесс. Было показано, что эмоциональный стресс, как особое состояние нейроэндокринной системы, также меняет уровень хромосомных аберраций и, даже, частоту рекомбинации в делящихся клетках некоторых тканей (Середенин, Дурнев, 1980; Бородин, Беляев, 1980). На модели действия феромональиого стрессора у домовой мыши было показано, что одним из звеньев стресс-реакции является нарушение стабильности хромосомного аппарата в мейотически делящихся половых клетках самцов (Даев, 1983). Таким образом, все больше и больше данных свидетельствуют о наличии генетических эффектов стресса.
Развитие взглядов на интеграцию внутри единой нейроэндокрипно-иммунной системы, создание новых моделей изучения стресс-реакций и совершенствование методов исследований позволяют по-новому взглянуть на проблему стресса с точки зрения генетики. Для последней крайне важным оказалось понимание того, что результатом действия сильных стрессоров является изменение активности различных генных систем. При этом обнаруживается скрытая генетическая изменчивость. Её можно рассматривать как ещё одну неспецифическую ответную реакцию и ответ на сильное воздействие. Последние данные, однако, позволяют считать, что:
качественной отличительной чертой стресса является запуск механизмов, позволяющих не только проявить размах уже существующей генетической изменчивости, по и индуцировать её de novo, оказывая непосредственное влияние на стабильность генетического аппарата соматических и половых клеток. Это способствует появлению дополнительного материала для естественного отбора и ускоряет эволюционный процесс в периоды кардинальных (как общих для всех, так и специфических для каждого организма) изменений окружающей среды.
Особый интерес представляют специфические для каждого вида (или организма, или клетки) стрессоры, которые определяются особенностями биологии этого вида (организма, клетки) и индивидуальными генотипическими различиями. Поиск и эффективное использование таких стрессоров может ускорять и направлять эволюцию живых организмов. В качестве аналога можно привести создание метода селективных сред для культивирования клеток. Его использование привело к быстрому прогрессу в области создания клеточных культур с "заданными" свойствами.
У многоклеточных, с усложнением их организации, появляются новые уровни интеграции механизмов адаптивного ответа па внешнее воздействие. Сложность анализа интегрированного ответа млекопитающих усугубляется частым использованием "комплексных" стрессорных воздействий. Трудно представить, на сколько разных действующих компонентов можно разложить, например, "доместикацию", "иммобилизацию", или "метод физических нагрузок", которые зависят от конкретных применяемых методов. То же можно отнести и к большинству других часто применяемых в исследовательской работе "стрессорных" воздействий.
В настоящей работе, исходя из биологии используемого объекта (линии лабораторных мышей), мы пытались изучать некоторые генетические звенья действия специфических стрессоров естественного происхождения, вычленяя из них элементарные действующие факторы (конкретные вещества). В качестве таких стрессоров использовали феромоны - биологически активные вещества, выделяемые организмами во внешнюю среду с хемокоммуникационными целями.
В век научно-технического прогресса комплекс проблем связанных с изучением стресса приобретает огромную актуальность из-за появления в окружающей среде все новых и новых стрессоров, которые, в конце концов, могут вызвать истощение защитных резервов живой материи. В таких условиях изучение всех закономерностей развития стресс-реакции и, особенно, её повреждающего действия па генетический аппарат клеток, становится приоритетным, так как конечным следствием подобных эффектов может быть гибель живых организмов.
Цель и задачи исследования.
Цель работы состояла в комплексном изучении генетических эффектов ольфакторного стресса у лабораторных мышей. Для ее достижения были сформулированы следующие задачи:
1. Разработка модели для изучения генетических эффектов стресса на основе геиотипепецифического действия ольфакторных стресс-факторов у домовой мыши.
2. Изучение эффектов ольфакторного стресса в половых и соматических клетках мышей.
3. Оценка влияния ольфакторного стресса па экспрессию генов главных белков мочи мышей и протоонкогенов c-fos и c-jun.
4. Изучение природы используемых стресс-фактороп и путей их действия на реципиентные организмы у домовой мыши.
5. Выявление взаимосвязи между химической структурой феромональиого стрессора и его стрессирующим действием на рециииентпый организм.
6. Оценка влияния используемого стрессора на иммупогепетические характеристики нейтрофилов периферической крови и репродуктивную функцию домовой мыши.
Научная новизна.
Разработана модель для комплексного изучения генетических эффектов "дозированного" ольфакторного стресса в половых и соматических клетках лабораторных мышей. В ней учтены физиологические и генетические особенности объекта. Модель позволяет вести комплексное изучение влияния "элементарного" стрессора у самцов мышей па стадиях гопиальных митозов, диакинеза-метафазы I, метафазы II и анафазы II мейоза на стадии анафазы-телофазы в клетках костного мозга без использования колхицина. Она позволяет изучать эффект действия стрессора на стадии зрелых сперматозоидов и оценивать репродуктивную функцию в тесте на доминантные летали. При этом па клетках костного мозга можно оценивать специфичность действия стрессора в зависимости от пола реципиента. Используя очищенные природные или искусственно синтезированные феромоны можно строго дозировать степень стрессорпого воздействия и изучать специфичность их действия.
Впервые показано, что ольфакторпый стресс проявляется на генетическом уровне в соматических и половых клетках: индуцируются нарушения митоза и мейоза; меняется экспрессия протоопкогенов и генов главных белков мочи.
Впервые показано, что феромон мыши 2,5-диметилпиразип, действуя через вомероназальный орган, индуцирует нарушения митоза в клетках костного мозга самцов и самок. Его действие меняет локомоторную активность нейтрофилов н степень фагоцитоза, что позволяет говорить об изменении активности работы генов, контролирующих эти процессы.
Цитогенетическими методами впервые проведено сравнение биологической активности нескольких феромонов домовой мыши, а также разных доз 2,5-диметилпиразина.
Впервые с использованием аналогов 2,5-диметилпиразина продемонстрирована зависимость цитогенетических эффектов в клетках костного мозга мышей от расположения и количества метильиых радикалов в пиразиновом кольце.
Теоретическая и практическая значимость.
В работе рассматривается мало исследованная проблема генетических эффектов стресс-реакции у животных. Расширяются представления о механизмах развития стресс-реакции на ольфакторный стимул у мышей. Звеньями стресса являются: изменение экспрессии ряда генов п нарушение стабильности генетического аппарата половых и соматических клеток; модификация иммунологически важных свойств нейтрофилов периферической крови. Все это связано с репродукцией и общей приспособленностью животных.
Полученные данные указывают на необходимость дальнейшего изучения генетических последствий стресса и, особенно, в половых клетках, что может сказываться в последующих поколениях. В условиях резкого возрастания антропогенной нагрузки на окружающую среду, у человека все большую негативную роль играют различные стрессы. Как показывают результаты многих работ, целый ряд важных физиологических признаков у животных регулируется при участии хемокоммупикациопных механизмов. Однако до последнего времени большинство вопросов в этой области вызывало противоречия и оставалось мало исследованным (Brennan, Kcvenie, 15 2004; Dulac, Torello, 2003). Поэтому, анализ дестабилизирующего действия феромонов на генетический аппарат делящиеся клеток костного мозга и семенников у мышей могут быть особо ценными для лучшего понимания негативных последствий стрессов вообще.
В работе на линиях лабораторных мышеи демонстрируется единство ответа нейроэндокринно-иммунной и репродуктивной систем па феромональное воздействие.
Сопоставление стрессирующего действия ряда феромонов и их аналогов говорит о сложной связи их химической структуры с цитогепетпческой эффективностью. Примененный в работе подход может быть использован при анализе механизмов специфических взаимодействий между "сигнальной" молекулой и соответствующими рецепторами.
Разработанный на лабораторных мышах подход может быть использован при комплексном анализе генетических эффектов как феромональпых, так и других стрессоров. Полученные данные могут быть использованы при разработке методов контроля репродуктивной функции у домовой мыши, при изучении механизмов индукции нарушений клеточных делений, а также для поиска эффективных иммуномодуляторов, действующих через обоняние.
Результаты работы широко используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете СПбГУ, включаются в курсы лекций для студентов других факультетов СПбГУ и других ВУЗов. Часть результатов вошла в учебник "Генетика с основами селекции" (Инге-Вечтомов, 1989).
Положения, выносимые на защиту.
1. Обобщение результатов, полученных на модели ольфакторного стресса у домовой мыши, в совокупности с данными других современных исследований показало, что понятие «стресса» должно включать в себя дестабилизацию работы генетического аппарата половых и соматических клеток у стрессированных животных. 2. Дестабилизация генетического аппарата и нарушение его целостности в делящихся половых и соматических клетках лежат в основе эффектов угнетения репродукции, иммунитета и других изменений, возникающих в ходе развития стресс-реакции.
3. Изменения активности генетического аппарата клеток иммунной и репродуктивной систем (генов, контролирующих фагоцитоз, локомоторную активность нейтрофилов, антитело продукцию, генов раннего ответа и главных белков мочи мышей) являются составной частью механизма развития стресс-реакции у домовой мыши.
4. В развитии стресс-реакции на феромональное воздействие 2,5-диметилпиразина, выявляемое по повышению уровня нарушений митоза в клетках костного мозга мышей, решающую роль играют метильпые радикалы в 2,5- положениях. Действие этого феромона у домовой мыши осуществляется через рецепторы как вомероназального органа, так и обонятельного эпителия.
5. Некоторые феромоны, для которых показана «физиологическая» активность, способны в разной степени дестабилизировать хромосомный аппарат клеток костного мозга у домовой мыши.
6. Феромональный стресс у домовой мыши - это часть консервативного природного механизма адаптивного ответа организма животных на колебания популяционной плотности. Звеном этого механизма являются индуцированные ольфакториыми стрессорами цитогенетические изменения, которые снижают общую приспособленность стрессированных животных и влияют на количество и качество рождающегося у них потомства, таким образом, внося свой вклад в микроэволюционпые процессы.
Апробация работы.
Основные материалы диссертации были представлены на: 2-м и 3-м съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (СПб, 2000; М, 2004); на 8-й Международной мультидисциплинарной конференции по биологической психиатрии «Стресс и поведение)) (СПб, 2004); па 2-й конференции МОГиС «Актуальные проблемы генетики)) (М., 2003); па Международном симпозиуме, посвященном 150-летию И.П.Павлова "Молекулярно-генетические механизмы адаптивного поведения" (СПб,1999); на 8-ой Международной конференции "Химические сигналы у позвоночных" (Итака, США, 1997); на 27-ой Международной конференции по репродуктивному поведению (Бостон, США, 1995); на 1-м Всемирном Конгрессе по стрессу (Bethesda, США, 1994); па 4-м Европейском конгрессе по клеточной биологии (Прага, 1994); на Всемирном конгрессе по ландшафтной экологии (Оттава, Канада, 1991); на 19-м Ежегодном совещании EEMS (Родос, Греция, 1989); на 14-м Ежегодном совещании EEMS (Москва, 1984); в трудах ещё более чем 20 Всероссийских и других съездов, совещаний, конференций.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 23 статьи в отечественных и зарубежных изданиях.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, списка сокращений, 3 глав обзора литературы, 2 глав, описывающих материалы и методы, 3 глав, содержащих результаты и их обсуждение, заключения, выводов и библиографии. Работа изложена на 280 страницах машинописного текста, включает 37 таблиц и 29 рисунков. Список цитированной литературы представлен 674 источниками.
Стресс. Эволюция представлений
Более 155 лет назад Клод Бернар пришел к пониманию важности постоянства внутренней среды организма для поддержания жизни. Позднее Вальтер Кэннон, изучая механизмы поддержания необходимых для жизни физиологических параметров организма, ввел термин "гомеостаз". Этим словом он определил стабильное состояние живого организма, параметры которого могут колебаться только в определенных пределах. Кэннон писал также, что выше некоего критического давления среды, попытки поддерживать гомеостаз оказываются несостоятельными. Напряжение в организме достигает в буквальном смысле переломного пункта, когда начинаются вторичные (побочные, не относящиеся к делу) изменения. Они могут явиться причиной дальнейших уже необратимых повреждений (Cannon, 1932; 1935).
Кэннон использовал термины "стресс" (в значении деформирующей силы, или силы растяжения) и "напряжение" как они понимаются в физике (Рис. 1). Основанием служила аналогичность событии, происходящих при деформации материалов и биологическом нарушении гомсостаза. Эластичная деформация материала обратима и полностью устраняется при удалении действующей силы. В живом организме это соответствует колебаниям, не нарушающим гомеостаз. Пластичная деформация наступает за "пределами эластичности" материала и ведет к его деформации, т.е. к структурным изменениям. Повторяющееся воздействие приводит к "усталости" материала, потере его некоторых свойств и к ломкости. "Пределы эластичности" аналогичны пределам колебаний гомеостаза организма, а "пластическая деформация" - "побочным (не относящимся к делу) изменениям". Ломкость же материала соответствует фатальному повреждению гомеостати чеекпх механизмов и гибели организма после истощения всех защитных резервов (Kopin, 1995). Организмы, однако, имеют более сложные механизмы ответа па факторы окружающей среды. В частности: а) существуют механизмы репарации повреждений; б) возможна адаптация к повторяющимся воздействиям; в) сам ответ на изменение может восприниматься как воздействие; г) поведенческий ответ может уменьшить или совсем избежать действия какого-либо фактора.
Ганс Селье развил идеи Кэннона и предложил концепцию, согласно которой помимо специфического (иногда локального) ответа, не нарушающего гомеостаз организма, последний отвечает на воздействие ещё и иеспецифической стереотипной реакцией, которая получила название "стресс реакции" или "общего адаптационного синдрома". В «классическом» узком понимании термин "стресс" применяют по отношению к высшим многоклеточным, млекопитающим и человеку. "Стресс - это состояние неспецифического напряжении и живой материи, которое проявляется реальными морфологическими [вменениями в различных органах и, особенно, в эндокринных железах, контролируемых передней долей гипофиза" (Селье, 1960). Синдром разворачивается в три стадии с начальным появлением острых симптомов (стадия тревоги), их последующим исчезновением (стадия резистентности) и, наконец, повреждением организма с полной утратой резистентности (Selye, 1936; Sclyc, 1950; Сслье, 1960). Факторы, индуцирующие развитие стресс-реакции, - стрессоры, различны по своей природе, но ответная реакция на их действие имеет ряд общих характерных черт (Рис.2). Таковыми являются: гипертрофия коркового слоя надпочечников; язвы желудочно-кишечного тракта; "инволюция" тимико-лимфатического аппарата; лимфопеиия, угистсиие функций щитовидной железы, угнетение продукции гопадотропинов и подавление репродуктивной функции животных (Selye, 1950).
Стресс» на клеточном уровне
Структура рецепторов, воспринимающих воздействия окружающей среды, соответствует природе действующего фактора. Исходя из характера нашей работы, мы ограничимся здесь кратким описанием только одной из наиболее типичных систем сигнальной транедукции.
Многие внешние воздействия имеют химическую природу. Способность чувствовать внеклеточные сигнальные молекулы и правильно отвечать па изменения их концентрации является одним из важнейших свойств отдельном клетки внутри многоклеточного организма. По своей природе такие молекулы часто гидрофобны и имеют небольшой молекулярный вес. Это определяет наличие в клетке механизма транспорта подобных сигналов через клеточную мембрану. Существуют относительно простые "самодостаточные" системы, когда внутриклеточная часть рецептора обладает собственной лигапд-индуцибельной, например, тирозинкиназной или другой активностью. Однако огромное большинство других систем представляют собой многокомпонентные белковые комплексы, которые часто регулируются гетеротримерными гуанин-связывающими белками (G-белками). В состав таких систем входят: а) рецептор (GPCR) - семидомепный трансмембранный белок с лпгапд специфичным и G-белок-специфичным сайтами связывания па внешней и внутренней сторонах мембраны, соответственно; б) посредник - принадлежащий одному из подклассов О-белков(ОРз), способный передать сигнал соответствующим эффекторам; в) эффектор - генератор внутриклеточного ответа путем, например, изменения концентрации ионов или вторичного посредника (Matsukavva et al., 2004; Wieland etal., 1997).
Строение генов, кодирующих GPCR и GPs, а также пх роль в формировании ответа клетки на внешний сигнал интенсивно изучаются. К настоящему времени получено огромное количество данных, из которых для нас важно остановиться на следующих результатах (Рис.4).
Структура внеклеточных компонентов рецептора определяет его специфическое связывание с лигандом. Внутренние петли связаны с G-бслком, который высвобождается при возникновении связи "лиганд-рсцептор". Сам GP представляет собой гетеротример, состоящий из а- и ру- субъедипиц. Существует не менее 19 подтипов а-, 5 р- и 12 у-субъедпшщ. Таким образом, создаются сотни специфических G-белков. Показано, что данная система сигнальной транедукции имеет широкие возможности как дивергенции, так и конвергенции сигнальных путей. Многие рецепторы способны активировать несколько разных G-белков, т.е. запустить разные сигнальные пути передачи информации в клетке (Bordet, 2004). И наоборот, разные внешние воздействия могут включить общие пути прохождения сигнала внутри клетки (Hamm, 1998; Offermanns, Schultz, 1994). Это служит одной из предпосылок существования неспецифического ответа клетки на стрессовые воздействия.
Следует отметить тканеспецифичность экспрессии некоторых субъединиц G-белков млекопитающих, а также специфичность связывания их с эффекторами. Стимуляция только одного рецептора может активировать до 500 G-белковых молекул. Таким образом, рассмотренный этап является первым шагом амплификации внешнего сигнала.
Внутриклеточными эффекторами G-белковых субъедипиц являются аденилилциклазы различных типов, фосфодиэстсразы, фосфолипазы, ras-MAP-киназы, а также калиевые и кальциевые каналы. Через систему молекул -вторичных посредников амплифицированный сигнал передается в ядро, где важную роль играет реакция фосфорилировапия различных транскрипционных факторов (Inoue et al., 2001; Mordrel, 1993; Bockaerl, 1997; Wirtz, 1997). Именно ими регулируется уровень экспрессии различных генов, в том числе и участвующих в формировании стресс-реакции клетки. При стрессе в первую очередь активируются гены раннего ответа, такие как, например, с-fos, c-jun и другие протоонкогены (Даев, Дукельская, 2005; Spelsberg et al., 1989; Mordret, 1993; Woloschak, 1997). Их продукты - белки - по большей части представляют собой взаимодействующие транскрипционные факторы. Так, например, показано, что взаимодействие СНОР-С/ЕВР, JunD, АР-1 и других факторов, регулирует клеточный рост и процессы апомтоза (Ubeda et al., 1999; Vial, Marshall, 2003). На крысах in vivo и в культуре клеток млекопитающих получены данные в пользу активации различными стрессорами гена раннего ответа erg-І. Это происходит опосредованно через подкласс специфических МАР-кипаз. При стрессе меняется также степень его фосфорилировапия и ДНК-связывающая активность, что отражается на функционировании целого ряда гепов-мишенен для белка Erg-1 (Clio et al., 2004; Limetal., 1998).
Важно отметить, что в клетке существуют параллельные системы ответа на внешние стрессорные сигналы (Nicotera, Melino, 2004). Такая "избыточность" может приводить к неконтролируемой каскадной стимуляции и развитию тяжелых заболеваний. Для предотвращения этого в клетке существуют механизмы аттенъюации сигналов на уровне агоиисгов, GPCRs,
G-белков и последующих стадиях трансдукции. Во-первых, сам агоиист может подвергаться быстрому удалению из межклеточного пространства с последующей его деградацией. Во-вторых, имеет место феномен десенсибилизации рецептора, опосредованный G-белками. В-третьих, высокоактивные рецепторы могут удаляться с мембраны эпдоцптозом. Кроме того, может ингибироваться синтез соответствующего рецептора. Генетический контроль всех этих процессов является предметом детального изучения (BOhm et al., 1997).
Существуют разные пути трансдукции стрессорпых сигналов, например, где роль вторичного посредника играет керамид, образующийся из сфингомиелина (Mathias et al., 1998). Одним из универсальных путей трансдукции многих внешних сигналов в клетке является активация протеинкиназы А (ПКА) при циклизации аденозинмоиофосфата (цАМФ). Этим модулируется связывание транскрипционного фактора CREB (binding protein) с CRE (cAMP response element) - регуляторными последовательностями в промоторных областях многих генов. Негативная регуляция осуществляется другим CREB-связанньщ транскрипционным фактором CREM (cAMP response element modulator). Таким способом регулируется, например, плотность /?2-адренергическпх рецепторов (BOhm ct al., 1997), которые участвуют, в том числе и в формировании стрессорного ответа.
Стрессирование мышей феромонами
Исходным материалом для работы служили высокоинбредиые линии лабораторных мышей CBA/Sto, C57BL/6Sto (в дальнейшем СВА и В6, соответственно), BALB/c, гибриды CBAB6F1, и аутбредпая линия ICR/Alb (в дальнейшем ICR). Эти животные часто используются в физиологических и генетических исследованиях (Бландова и др., 1983; Beynon, Hurst, 2003; Foster et al., 1981; Rugh, 1990; Silver, 1995). Животные выбранных лнпиіі хорошо охарактеризованы в многочисленных исследованиях по цитогене-тическим, поведенческим и иммунологическим признакам, что определило их выбор в качестве материала работы. Они имеют разное происхождение и, таким образом, различаются генетически. Высокая степень инбридинга делает животных этих линий гомогенными по своим внутрилинейным характеристикам. Межлинейные гибриды, являясь гетерозиготными по всем локусам, сходны с исходными линиями по степени генетического и фспоти-пического единообразия. Они часто используются в различных экспериментах вследствие единообразия, гибридной силы и легкости разведения (Handbook on genetically standardized JAX mice, 1991; Silver, 1995).
Следует отметить, что между самцами мышей семейства линий С57 и другими были выявлены различия при электрофоретичсском анализе содержания белков мочи (Hudson et al., 1967; Robertson et al., 1996). Предполагается, что в этом семействе линий нарушен метаболизм тестостерона (Bartke, Shire; 1972; Shire, Bartke, 1972). Линии отличаются по параметрам, характеризующим состояние гипаталамо-гипофиз-гонадного комплекса, уровню агрессии и стрессируемости зоосоциальпыми стимулами (Науменко и д., 1983; Новиков и др., 1982). Самцы линий В6 и СВА охарактеризованы по их феромональной способности индуцировать блок беременности (Parkes, Bruce, 1961; March lews ka-Koj, 1977). Причем, показано менее выраженное действие феромонов самцов линии В6, что хорошо согласуется с предположениями о нарушении у них метаболизма тестостерона и, по-видимому, пониженной активностью адренокортнкальної! системы (Shire, 1981).
Материал обычно получали из питомника АМН РФ "Рапполово". Аутбредных животных линии ICR, с которыми некоторое время работали на базе Отдела химии Университета Индианы в Блумингтоне, получали из центра разведения животных Harlan Sprague-Dawley, Inc. (Индианаполис, Индиана, США). Животных исходных линий метили ампутацией фаланг пальцев под эфирным наркозом по обычной методике (Ковалевский, 1958). Всех мышей содержали в стандартных полипропиленовых клетках размером 22x30x10 см. В качестве подстилки использовали опилки. Неинвертированньш световой (12 час:12 час) и вентиляционный режимы поддерживали автоматически. Пищевой рацион и условия кормления животных были идентичны.
После недельной адаптации по принципу случайности формировали семьи, состоящие из 2-3 самок и одного самца заданных генотипов. На 12-14 день самцов отсаживали от самок, которых, по мере обнаружения беременности, рассаживали поодночке в чистые клетки, где и проходили роды.
На 10-12 день после родов проводили определение пола и мечепие мышат, пометы выравнивали по величине до 6-8 животных. На 20-22 день из молодых самок и самцов формировали экспериментальные группы, которые состояли из 4, 5 или 6 мышат, выровненных по весу. Как правило, по достижении животными возраста 30±1 день их использовали в дальнейших экспериментах. При этом опирались па данные литературы: 1) о влиянии феромонов половозрелых животных на половое созревание молодых животных (Новиков, 1988); 2) о существовании у мышей чувствительного к внешним воздействиям периода онтогенеза с 20 по 36 день (Jcan-Faucher et al., 1978; Scott et al., 1974); 3) на собственные данные по возрастной динамике частоты феромонально индуцированных нарушений меііоза у молодых самцов мышей (Даев, 1994).
Некоторые эксперименты были проделаны на взрослых животных. При изучении роли вомероназальпого органа в формировании цитогснетнческого ответа на феромопалыюе воздействие использовали мышат ICR, которым в возрасте 21 дня был удален вомероназальный орган: этот материал был любезно предоставлен доктором Вэй Донг Ма (группа профессора М. Новотного, Отдел химии, Ун-т Индианы, Блумингтон, Индиана, США).
Отработка модели изучения влипни я стресса, индуцированного летучими веществами мочи, на сперматогенезу домовой мыши. Фсромоналышя регуляция репродуктивной функции
В свете разрабатываемой М.Е.Лобашевым (1947), Ю.Я. Керкисом (1940) и их последователями (Керкис и др., 1973; Лобашев и др., 1973; Лопатина и др., 1975) гипотезы системного контроля мутационного процесса, сотрудники кафедры генетики и селекции Санкт-Петербургского (Ленинградского) госуниверситета продолжили изучение модифицирующего влияния пейроэндокринной системы животных па мутационный процесс (Пименова, 1975; Полянская, 1971; Цапыгина, 1972; 1974).
Анализ данных литературы, имеющейся к моменту начала работы ( в конце 1970- начале 1980-х годов), привлек наше внимание к феромональным сигналам у домовых мышей, как мощному средству воздействия на состояние нейроэндокриииой системы. Однако, механизмы хемосигнализации у животных на тот период оставались малоисследованной областью науки. И, тем более, ничего не было известно о модифицирующем влиянии феромонов на мутационный процесс в клетках органов-мишеней.
Первые указания на это были получены нами в 1978-79 годах. Было обнаружено, что пересадка молодых самцов мышей в клетки, где до этого содержали половозрелого фертильного самца-одиночку, приводит к достоверному повышению уровня как спонтанных, так и индуцированных X-лучами хромосомных аберраций в половых клетках. Результаты были подробно изложены в кандидатской диссертации и ряде печатных работ (Цапыгина и др., 1979; 1981; Даев, 1983), поэтому здесь излагаются кратко. Нарушался процесс первого меГютнческого деления и структура хромосом, о чем судили по возрастанию частоты унивалентов и, собственно, хромосомным аберрациям.
Подобные данные явились основанием для создания модели, на которой можно более тщательно изучать влияние феромонов на сперматогенез у молодых самцов домовой мыши. Так, было показано, что провокационный фон (Х-облучение) способствует выявлению межлипейных различий по чувствительности к феромопалыюму воздействию. Процедура " хэндл ни га" и пересадка в клетки с чистой подстилкой так же модифицировала частоты изучаемых типов нарушений, по в меньшей степени (Даев, 1983; Цапыгина и др., 1979). Можно отмстить также, что уровни радиоиндуцироваппых хромосомных аберраций и аутосомпых унивалентов менялись в разной степени в зависимости от вида стрессора ("хэпдлнпг"+ "чистая подстилка" или "хэндлинг"+ феромоны самцов разных линии). Это может отражать сложность применяемого стрессора, отдельные компоненты которого действуют преимущественно или на стабильность хромосомного аппарата или на процессы мейотической конъюгации и расхождения бивалентов (Цапыгина и др., 1979; 1981). Кроме того, разработка и использование метода давленых препаратов семенных канальцев позволили обогатить препараты метафазными пластинками. Одновременный отказ от применения колхицина па наш взгляд способствовал получению более точных данных, приближенных к естественной ситуации,
В ходе экспериментальной работы была изучена динамика частоты индуцируемых нарушений мейоза в сиерматоцптах I (Даев, 1983). С этой целью материал для цитогепетпческого анализа фиксировали через разные сроки после однократного феромоиалыюго воздействия с учетом длительности стадий сперматогенеза (Oakberg, 1957; Fabrikant, 1979). Максимальную индукцию хромосомных аберраций наблюдали через 8 час - 1 сутки после воздействия, хотя менее выраженные, но достоверные различия сохранялись и на 5-ые сутки (Даев, 1983). Полученные данные позволяют говорить, что стадия диакппеза-метафазы I наиболее чувствительна к используемому воздействию. Это совпадает с данными других авторов о дифференциальной чувствительности половых клеток па разных стадиях сперматогенеза и о повышенной чувствительности к внешним воздействиям именно этой стадии (McGaughcy, Chang, 1973; Oakberg, DiMinno, 1960). С учетом сложности применяемого стрессора были начаты попытки по выяснению природы цитогенетически активного действующего начала.
Поскольку вопрос о природе и степени летучести изучаемых соединений оставался открытым, был поставлен эксперимент по изучению воздействия летучих компонентов мочи (ЛКМ) половозрелых самцов при помощи ольфактометра с вертикальной подачей одораита в потоке воздуха (Новиков и др., 1985 Sundberg et al., 1982). Это позволило, избегая непосредственного контакта с тестируемыми стрессорами, воздействовать па животных-реципиентов только летучей фракцией экскреторных продуктов. Полученные данные свидетельствовали о высокой физиологической активности ЛКМ, так как уровень индуцируемых нарушений мейоза не отличался по величине от такового при пересаживании животных в клетки с "грязной подстилкой". Результаты одной из повторностей эксперимента приведены в Таблице 1.
Изучение эффективности действия экзогенных метаболитов, содержащих феромоны половозрелых самцов разных инбрсдных линий па половые клетки молодых самцов, показало, что феромоны линии CBA/Sto действуют сильнее, чем линии C57BL/6Sto (Даев, 1983). Это позволило нам выбрать животных линии СВА в качестве донора стрсссирующих феромональных сигналов. Последующее изучение показало, что цито генетические эффекты феромонов, выделяемых самцами - гибридами Fl(CBAxC57BL/6) и самцами липни СВА на молодых самцов-реципиептов CBAB6F1, достоверно не различаются ни но силе действия, ни по спектру индуцируемых мейотическнх нарушений.
