Генетическая модификация дистрофин-дефицитной мышечной ткани в клеточной терапии наследственных миодистрофий [Электронный ресурс] Кузнецов Александр Борисович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера - клиническая характеристика и биологические модели . 10

1.1.1. Клинико-генетическая характеристика прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера 10

1.1.2. Этиология и патогенез заболевания 12

1.1.3. Биологические модели миодистрофии Дюшенна/Беккера. 16

1.2. Клеточная терапия прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера 20

1.2.1. Стволовые и прогениторные клетки 21

1.2.2. Применение стволовых клеток в лечении прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера 27

Глава 2. Материалы и методы исследования 41

2.1. Характеристика экспериментальных животных 41

2.2. Идентификация мутации в гене дистрофина у мышей mdx 42

2.3. Характеристика ранних предшественников миогенеза 44

2.4. Методика трансплантации человеческих клеток мышам mdx 47

2.5. Иммуногистохимическое выявление человеческих ядер и дистрофина в мышечной ткани мышей-реципиентов 51

2.7. Исследование активности маркерных ферментов мышечного поражения в плазме крови мышей mdx. 50

2.8. Определение количества CD25+ лимфоцитов и моноцитов в крови мышей mdx до- и после трансплантации 52

2.9. Исследование реакции сердечно-сосудистой системы на трансплантацию человеческих клеток 52

2.10. Плавательный тест 53

2.11. Статистическая обработка результатов исследования 54

Глава 3. Морфо-гистохимический исследование мышечной ткани мышей mdx после трансплантации РПМ человека .

3.1. Исследование миграции и распределения человеческих клеток в мышечной ткани мышей mdx после трансплантации ранних предшественников миогенеза человека . 55

3.2. Исследование синтеза дистрофина после трансплантации ранних предшественников миогенеза человека мышам mdx. 68

Глава 4. Изучение активности биохимических маркеров миодистрофического поражения, показателей иммунного статуса и системного действия клеток человека на различные ткани и органы мышей mdx . 88

4.1. Изменение активности > маркерных ферментов мышечного поражения (креатинкиназы и лактатдегидрогеназы) у мышей mdx после трансплантации РПМ человека. 88

4.2. Влияние трансплантации РПМ человека на иммунную, кроветворную и другие системы организма. 94

Глава 5. Изменение функционального состояния скелетных мышц и сердечно-сосудистой системы до- и после трансплантации РПМ человека

5.1. Изменение двигательной активности мышей mdx после трансплантации РПМ человека. 105

5.2. Изменение основных сердечных показателей у мышей mdx после трансплантации человеческих клеток. 111

Заключение 117

Выводы 130

Список литературы

• Прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера - клиническая характеристика и биологические модели
• Идентификация мутации в гене дистрофина у мышей mdx
• Исследование миграции и распределения человеческих клеток в мышечной ткани мышей mdx после трансплантации ранних предшественников миогенеза человека
• Изменение активности > маркерных ферментов мышечного поражения (креатинкиназы и лактатдегидрогеназы) у мышей mdx после трансплантации РПМ человека.

Введение к работе

Актуальность проблемы

К настоящему времени согласно данным МЗ РФ в России зарегистрировано около 2,5 млн. людей, страдающих двигательными нарушениями различного генеза. Медико-социальная реабилитация таких больных резко ограничена наличием органических дефектов мышечной ткани, а также центрального и периферического нейронов. Среди этих заболеваний особое место занимает прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна / Беккера (МДД/Б), которая является одним из наиболее тяжелых наследственных болезней человека. Заболевание начинается в раннем возрасте, быстро прогрессирует, приводя к обездвиживанию к концу первого десятилетия жизни и смерти при явлениях сердечной и дыхательной недостаточности к концу второго десятилетия.

В последние годы достигнут большой прогресс в изучении природы данного заболевания, идентифицирован ген и белок, ответственные за развитие миодистрофии, налажена система ДНК-диагностики. Однако терапия болезни по-прежнему остается безуспешной. Большие надежды на успех в лечении этого заболевания были связаны с генотерапией. Действительно, первые работы по трансгенозу минигена дистрофина мышам mdx, были обнадеживающими. Однако, как стало ясно из последующих исследований, эффект от трансгеноза оказался непродолжительным. Возникли проблемы с доставкой генетических конструкций в ткань, а также выраженный иммунный ответ на повторное введение минигена в составе вирусных носителей (1).

Новым направлением в лечении МДД/Б могла бы стать клеточная терапия. В основополагающем исследовании А.Н. Студицкого (1977) и его сотрудников (Булякова и соавт, 1995) было показана высокая способность стимуляции репарации поврежденной мышечной ткани суспензией измельченных мышц. В работах П.Лоу (114) показана эффективность терапии МДД/Б размноженными в культуре миобластами, которыми обкалывались мышцы больных. Однако, как оказалось в последующем, клиническое действие таких процедур было незначительным, а стоимость крайне высокой. Кроме того, такие трансплантации требовали интенсивной терапии иммуносупресснтами с развитием характерных осложнений от их применении. Новые надежды на эффективную терапию МДД/Б появись после установления высокой пролиферативной активности и пластичности эмбриональных предшественников миогенеза, а также их способность восстанавливать поврежденные ткани (Г.Т. Сухих, B.C. Репин, 1998). Показаны большие терапевтические возможности лечения заболеваний нервной системы трансплантацией эмбриональных клеток ( А.С. Брюховецкий, 2003; М.А. Александрова, А,В, Ревищин, Л.И. Корочкин, 2000).

Новый импульс к применению цитотерапии МДД/Б был получен после открытия стволовых клеток независимо друг от друга научными исследованиями Джона Герхарда и Джеймса Томсона в 1998 году. Оказалось, что стволовые клетки обладают выраженным дифференцировочным потенциалом и способностью компенсировать самые различные тканевые дефекты. Это определило начало нового поиска терапии МДД с помощью стволовых и прогениторных клеток. Соответственно, задачей дальнейшего развития этого направления, исследований остается всестороннее изучение возможных механизмов влияния на дистрофин-дефицитные мышцы различных типов клеток предшественников миогенеза, в том числе эмбриональных миобластов и мезенхимальных клеток, а так же комплексный подход к диагностике пред- и посттрансплантационного состояния.

Новым практически не исследованным путем клеточной терапии не только МДД/Б, но и других патологических процессов, является изучение эффекта действия стволовых клеток при межвидовых трансплантациях. Начатые в 1912 году работы С.С. Воронова (прообраз литературного персонажа М. Булгакова профессора Преображенского) по пересадке клеток щитовидной железы шимпанзе в щитовидную железу ребенка, больного врожденным гипотиреозом развития не получили. Это было обусловлено кратковременностью положительного действия пересадки вследствие развивающейся иммунологической несовместимости тканей донора и реципиента, механизмы которой тогда были неизвестны. Понятно, что наличие дешевого источника клеток в ксеногенных трансплантатах, в случае их успешности, решает множество проблем, в том числе и этических. Трансплантации стволовых клеток животных человеку теоретически вполне возможно, учитывая мощный стимулирующий бласттрансформационный потенциал чужеродных клеток и относительно низкую иммуногенность стволовых клеток. Эта магистральная идея и легла в основу настоящего исследования, являющегося первой попыткой изучения терапевтического влияния ксеногенных (человек - мышь) трансплантаций на примере одного из самых тяжелых и распространенных заболеваний, каким является МДД/Б.

Таким образом,

Целью настоящего исследования явилось определение возможности генетической модификации дистрофин-дефицитной мышечной ткани мышей с наследственной миодистрофией при воздействии на нее ранними предшественниками миогенеза человека.

В работе поставлены следующие конкретные Задачи:

1. Определение выраженности и длительности эффекта индукции синтеза дистрофина у экспериментальных дистрофин-дефицитных мышей mdx с помощью ранних предшественников миогенеза человека.

2. Мониторинг биохимических и иммунологических показателей активности дистрофического процесса до- и после трансплантации.

3. Комплексная оценка функционального состояния различных систем организма экспериментальных животных в ответ на ксеногенные клеточные воздействия.

Научная новизна

Впервые сделана успешная попытка генетической модификации дистрофин-дефицитной мышечной ткани мышей с наследственной мышечной дистрофией (линия mdx) путем ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток миогенного ряда человека.

Впервые получены данные о высокой пластичности трансплантированных ксеногенных клеток, их способности ассоциироваться с мышечными волокнами реципиента и компенсировать генетический дефект.

Так же впервые показаны низкая иммуногенность трансплантированных ксеногенных клеток, которые в течение длительного времени функционировали в мышечной ткани мышей-реципиентов без какой-либо иммуносупрессии. В то же время, пересадка миобластов, полученных из мышечной ткани генетически близких (отеческих) биопсий, как следует из работ ряда авторов, оказалась менее успешной из-за быстрого развития отторжения пересаженных клеток. Даже при условии интенсивной иммуносупрессии циклоспорином время переживания и функционирования пересаженных клеток было меньшим, чем в наших экспериментах. Это указывает на возможность большего эффекта при использовании ксеногенных клеток, при этом очевидно, что фактором успеха при трансплантации является не столько генетическое родство трансплантированных клеток и тканей реципиента, сколько онтогенетический статус этих клеток. Не исключено, что ксенотрансплантация является дополнительным фактором усиления репаративных процессов в тканях хозяина за счет бласттрансформации клеток реципиента.

Впервые проведено комплексное исследование различных эффектов трансплантации: оценка состояния и возможностей двигательного аппарата, определение активности биохимических маркеров миодистрофического поражения (креатинкиназа, лактатдегидрогеназа), показателей иммунного статуса.

Впервые дана оценка состояния различных тканей и внутренних органов экспериментальных животных при локальных введениях эмбриональных клеток. Показана положительная реакция таких трансплантаций на сердечную мышцу, что делает перспективным клеточную терапию миокардиодистрофий и кардиомиопатий.

Научно-практическая значимость

Получены данные о возможной компенсации генетического дефекта с помощью клеточной терапии такого тяжелого наследственного заболевания как миодистрофия Дюшенна, что определяет новый этап в разработке этиологической и патогенетической терапии наследственных миодистрофий. Показано, что для проведения такой терапии не обязательно использовать генетически родственный клеточный донорский материал. По нашим данным лучший терапевтический эффект возникает при ксеногенных трансплантациях. Это исключительно важно для поиска дешевого клеточного материала, получаемого от животных, филогенетически близких по иммунологическим маркерам. Учитывая неспецифический характер действия трансплантированных клеток и их способность генетически модифицировать и корректировать различные дефекты, лечение пересадками ранних предшественников миогенеза можно использовать при большом количестве различных мышечных патологий как наследственной, так и экзогенной природы. Можно также предположить, что настоящее исследование станет новым стимулом к поиску эффективной клеточной терапии болезней человека.

Прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера - клиническая характеристика и биологические модели

Х-сцепленная рецессивная псевдогипертрофическая мышечная дистрофия, была впервые описана G.Duchenne в 1868 г. Второй более легкий вариант мышечной дистрофии был описан Becker Р.Е. в 1955 году (32-34) как самостоятельное заболевание, и только спустя более 30 лет стало очевидно, что эти два заболевания являются алельными вариантами мутации гена дистрофина. Частота второго варианта составляет 1 на 20-25 тысяч, а миодистрофии Дюшенна 1 на 3-3,5 тысячи новорожденных мальчиков.

Клиническая картина миодистрофии Дюшенна достаточно хорошо изучена (4, 5, 6, 10, 18, 68). Заболевание характеризуется сравнительно ранним началом и относительно быстрым прогрессированием процесса. Первые признаки заболевания в виде мышечной слабости появляются в возрасте 2—5 лет. У части детей отмечается задержка темпов моторного развития уже на 1—2-м году жизни. Дети начинают испытывать затруднения при ходьбе по лестнице, вставании с пола, перестают бегать. Очень типичной становится переваливающаяся («утиная») походка, тенденция к ходьбе на носочках, гиперлордоз поясничного отдела позвоночника.

За счет дистрофического процесса с сочетанием фаз регенерации и дегенерации, происходят нарушения межтканевых взаимодействий в двигательной единице мышц. Икроножные мышцы, некоторые мышцы бедер и нередко дельтовидные мышцы увеличиваются в размерах, становятся плотными при пальпации. Псевдогипертрофия мышц вызвана не только разрастанием соединительной ткани, но и усиленным липоматозом (16). В последующем появляются и неуклонно нарастают гипотрофии мышц тазового и плечевого поясов, проксимальных отделов верхних конечностей. Характерны «крыловидные лопатки», симптом «свободных надплечий».

При типичном течении заболевания к 9-12 годам больные перестают самостоятельно передвигаться, при этом появляются контрактуры голеностопных и коленных суставов, кифосколиотическая деформация грудной клетки, тотальная атрофия скелетных мышц. Наиболее ранние изменения обнаруживаются в ахилловых сухожилиях, приводящие в последующем к патологической деформации стоп. Возможны контрактуры в локтевых, коленных и тазобедренных суставах. При осмотре обнаруживаются характерные мышечные атрофии, выпадение коленного рефлекса, затем постепенно исчезают рефлексы с двуглавой и трехглавой мышц. Дольше других сохраняется ахиллов рефлекс. Для миодистрофии Дюшенна типично поражение сердечной мышцы в виде кардиомиопатии. Причиной летального исхода в конце второго десятилетия жизни является легочно-сердечная недостаточность, обусловленная поражением дыхательной мускулатуры и прогрессирующей кардиомиопатией. Миодистрофия Беккера характеризуется более поздним началом и относительно доброкачественным течением с медленным прогрессированием, инвалидизация возникает в типичных случаях к 40-летнему возрасту. При этом дилятационная кардиомиопатия диагностируется у 50-60% больных (32-34).

Лабораторная диагностика миодистрофии Дюшенна/Беккера включает использование различных методов: электрофизиологических, биохимических, гистологических, а в последние годы — гистохимических и молекулярно-генетических (7). Электромиографическое исследование, а также изучение мышечных биоптатов обнаруживает признаки первично-мышечного поражения. Удобным и информативным тестом является определение сывороточной креатинкиназы, уровень активности которой в случае миодистрофии Дюшенна в десятки раз превышает нормальные значения. Следует подчеркнуть, что данный тест может быть использован в до- или субклинической стадии заболевания (11).

Идентификация мутации в гене дистрофина у мышей mdx

Мышцы отмывали в PBS (Sigma) с добавлением антибиотиков 50 ед./мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина. Затем мышечную ткань подвергали механической диссекции в стерильных чашках Петри 35 мм (Corning) до размеров не более 1.5 мм х 1.5 мм и переносили в центирифужные пробирки (15 мл, Corning) , дважды отмывали в PBS (Sigma), затем центирифугировали при 600g в течение 3 минут.

Для получения суспензии единичных клеток ткань диссоциировали 0.2 % раствором коллагеназы (type XI ,Sigma), инкубировали при 37 С в течение 20 мин, затем обрабатывали диспазой (Sigma) и 0.1% раствором трипсина ЭДТА (Sigma) 15 мин. Для обогащения суспензии миогенными клетками использовали флаконы, обработанные коллагеном.

Популяцию клеток, обогащенную миогенными клетками, культивировали в концентрации 2x10б /мл в среде DMEM/F12 (Gibco, USA) с добавлением 15% фетальной эмбриональной сыворотки при 37 С, 5% СОг в течение 8 суток со сменой среды каждые 3 дня.

На рисунке 6А представлена фотография культуры РПМ (фазово-контрастная микроскопия) 7 дней культивирования - клетки в монослое распределены диффузно, не сливаются, оставаясь одноядерными, и сохраняют свой миогенный потенциал. Часть клеток приобрела способность к спонтанному образованию симпластов и миотубов (рисунок 6Б), некоторые из них, которые непосредственно прилежат к миотубам, представляет собой предшественники сателлитных клеток. Также в культуре РПМ были обнаружены клетки с морфологическими и иммуно-фенотипическими характеристиками мезенхимальных стволовых клеток (рисунок 6В).

В день трансплантации в культуральную жидкость добавляли Hoechst 33342 (бисбензимид) в конечной концентрации 20 мкг/мл. Затем клетки инкубировали в атмосфере с 5% С02 в течение 1 часа. Далее культуру клеток отмывали 3-4 раза в PBS (Sigma), разводили в физиологическом растворе до концентрации 4x106 /мл. Жизнеспособность выделенных клеток составляла 98% в тестах с трипановым синим и пропидиум йодидом.

Для оценки чистоты и однородности культуры ЭМПК использовали тест на белки актин, тропонин I и миозин человека, а так же на антигены CD34, CD45, CD 105. Для этого клеточную культуру инкубировали с мышиными моноклональными антителами к актину, тропонину I и миозину человека (Immunotech) с последующей инкубацией с антимышиными антителами кролика, конъюгированными с флуоресцентным красителем согласно стандартному протоколу, далее окрашенную культуру исследовали под флуоресцентным микроскопом (рисунок 7). Для исследования на наличие антигенов CD34, CD45, CD 105 клеточную суспензию после инкубации с соответствующими антителами исследовали на проточном цитофлуориметре (рисунок 8).

Как оказалось, культивированные клетки представляют собой гетерогенную популяцию, состоящую из мышечных прогениторных и стволовых клеток - эмбриональных миобластов и предшественников сателлитных клеток, являющихся стволовыми клетками постнатальной мышечной ткани (20, 37, 52, 78). Незначительная фракция (2,1%) представлена мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), являющиеся стволовыми клетками для производных мезодермы, около 2% составляют CD34+ и CD45+ миогенные клетки. Таким образом, данный трансплантат представляет собой гетерогенную популяцию стволовых и прогениторных миогенных клеток различной стадии дифференцировки и потентности, имеющих потенциальную возможность для формирования всех тканевых образований скелетных мышц. По рекомендации Г.Т. Сухих мы сочли возможным назвать культивированные миогенные клетки плодов человека 8-Ю недели гестации как ранние предшественники миогенеза (РПМ).

Мышам mdx, 12-месячного возраста, исследованных комплексно до трансплантации, вводили клетки в количестве 750 х 103 клеток. Мыши были разделены на две группы. Первая группа - мыши-реципиенты, которым вводили клеточную суспензию внутримышечно, вторая группа -контрольные мыши мутанты, которым клетки не вводили.

Мышам 1-ой группы вводили по 750 х 103 клеток однократным внутримышечным введением в центральную область m. soleus правой конечности в общем объеме стерильного апирогенного физиологического раствора 125 мкл, в левую мышцу голени вводили равный объем физиологического раствора.

Все введения проводили в стерильных условиях инсулиновым шприцем, без анестезии. Введения клеток мыши перенесли нормально, не было отмечено какой-либо реакции в виде воспаления или лихорадки.

Исследование миграции и распределения человеческих клеток в мышечной ткани мышей mdx после трансплантации ранних предшественников миогенеза человека

Через 7 суток после трансплантации клетки сохраняют свою жизнеспособность и функциональную активность, что визуально подтверждается нарастающей миграцией этих клеток по длинику мышечных волокон, а также морфологическими признаками их высокой активности. Цитоплазма клеток сливается с мембраной мышечных волокон хозяина. Овальные нефрагментированные ядра этих клеток располагаются по краю мышечных волокон, а некоторые из них обнаруживают субсарколемальную локализацию.

При окраске их на видовую принадлежность (human nucleus) видно, что ядра введенных клеток имеют человеческое происхождение (рисунки 10, 11). Зона наибольшего скопления клеток (обозначена кружком на рисунке 10) представляет собой трек от введения клеточной суспензии, другая часть клеток, которые располагаются между волокнами, представлена мигрирующими клетками (обозначена стрелкой). Визуальная оценка количества клеток, образующих трек, и клеток, расположенных между волокнами, дает возможность говорить о том, что миграция человеческих клеток на сроке 7 суток после трансплантации носит незавершенный характер.

На рисунке 10Б (зеленый фильтр) особенно хорошо видно, как мигрирующие клетки (РПМ) вступают в структурные взаимодействия с мембранами мышечных волокон мышей-реципиентов.

При большем увеличении (рисунки 11, 12) это взаимодействие характеризуется тесной ассоциацией их с мембранами мышечных волокон. Причем в отдельных участках (рисунок 14Г) ядра РПМ как бы погружаются под сарколемму на место собственных ядер мышечных волокон, которые при миодистрофии смещаются к центру волокна.

Другой важной особенность взаимодействия донорских клеток с мышечной тканью хозяина является тенденция к образованию подобия муфт вокруг мышечных волокон хозяина (рисунок 13).

Еще одной важнейшей особенность действия трансплантированных клеток является их скапливание в зонах разрыва мышечных волокон (рисунок 14). Очевидно, что РПМ человека стремятся восстановить морфологическую целостность дистрофически измененных волокон путем образования миотубов в зонах сегментарного некроза. На эту возможность указывает интенсивное окрашивание на человеческий ядерный антиген (human nucleus) в районе сарколеммы и эпимизия мышечных волокон (рисунок 14Г).

С помощью такого механизма донорские клетки пытаются «заблокировать» поврежденные фенестрированные мембраны по всему периметру мышечного волокна. Как будут видно из дальнейшего изложения, именно такой характер взаимодействия введенных клеток с мышечными волокнами реципиента способствует репаративному синтезу примембранного дистрофина.

Таким образом, спустя неделю после трансплантации РПМ устанавливается вся гамма сложных взаимодействий этих клеток с мышечными волокнами реципиента, направленных на компенсацию эффекта действия мутантного гена.

При исследовании срезов мышц через 14 суток после трансплантации общая характеристика взаимодействий РПМ человека с мышечными волокнами мышей продолжает сохраняться (рисунок 15, окраска на Human nucleus). По-сравнению с морфологической картиной мышц после трансплантации ксеногенных клеток на 3 и 7 сутки обнаруживается почти полная дисперсия пересаженных клеток из зоны введения вдоль мышечных волокон. Клетки РПМ сохраняют жизнеспособность, однако небольшое количество клеток находятся на ранних стадиях апоптоза. Ядра этих клеток имеют форму «бублика» - окрашивание бисбензимидом по краю ядра, тогда как в центре окрашивание отсутствует (рисунок 16).

Значительная часть живых клеток тесно ассоциирована с мембранами мышечных волокон, тогда как апоптотичные клетки такого взаимодействия не имеют. В отдельных полях зрения обнаруживаются линейные структуры, напоминающие эмбриональные мышечные волокна с большим числом ядер.

Распределение человеческих миогенных предшественников в мышцах мышей mdx. 14 суток после трансплантации. Часть трансплантированных клеток находится на начальных этапах апоптоза. Ядра этих клеток имеют форму «бублика» - отсутствие окраски бисбензимидом в центре ядра, (hoechst 33342). Объяснения в тексте. Б- увеличенный фрагмент рисунка I6A, на котором отчетливо видна кольцевая фрагментация хроматина в отдельных ядрах.

Изменение активности > маркерных ферментов мышечного поражения (креатинкиназы и лактатдегидрогеназы) у мышей mdx после трансплантации РПМ человека.

Как известно, креатинфосфокиназа (КФК) является маркерным ферментом мышечного повреждения. Ее активность в плазме крови при МДД повышается в десятки и сотни1 раз. Измерение активности КФК у больных МДД является наиболее информативным показателем оценки тяжести миодистрофического процесса и эффективности терапии этого заболевания.

Как уже подчеркивалось в обзоре литературы, повышение активности КФК в сыворотке крови обуславливается, нарушением проницаемости сарколеммы вследствие дефекта строения или полного отсутствия дистрофина. При этом каждое сокращение мышц вызывает очень кратковременные «проколы» мембраны. Из миосимпласта выходят в; кровь -КФК и другие биологически активные вещества, в том числе: калий (18). Это приводит к вакатному замещению ионов калия ионами кальция, которые запускают каскады активации ферментов апоптоза. По мере увеличения концентрации ионов кальция; В: мышечном волокне может возникнуть его гиперсокращение, приводящее к его фрагментарному некрозу и потере волокном механической целостности. Смещение ядер к центру волокна (видимо для защиты от проникающих внеклеточных веществ) уже не может поддерживать требуемые для нормального функционирования биохимические константы.

Активность КФК на начальных стадиях мышечной дистрофии Дюшенна может достигать нескольких тысяч ЕД/мл. По мере прогрессирования болезни значение активности креатин киназы в плазме крови может колебаться, но все же остается достаточно высоким. На терминальной стадии заболевания активность КФК падает по причине тотального повреждения скелетной мускулатуры и истощения механизмов регенерации поврежденных мышечных волокон.

Активность сывороточной креатинкиназы у мышей mdx, биологической модели МДД человека, повышена на протяжении всей жизни, наибольшие значения активности регистрируются на первых 5 неделях жизни (56, 80).

При прогрессирующей мышечной дистрофии у мышей mdx, как и у человека, наблюдается печеночная дисфункция, выражающаяся в повышенной активности сывороточной лактатдегидрогеназы (ЛДГ), аспартаттрансаминазы (ACT) и высоким уровнем холестерина в крови. Все эти биохимические показатели сочетаются с увеличением массы печени и нарушением в работе системы цитохрома Р-450 (40).

Как было сказано ранее, взятые нами в эксперимент мыши mdx были разбиты нами на 5 групп в зависимости от их генотипов, что до определенной степени аналогично генетической подразделенности человеческой популяции. У больных МДД уровень активности креатинкиназы может достигать нескольких тысяч ед/мл, тогда как у здоровых этот уровень не превышает 100-200 ед/мл. Разница в значениях измеренной нами активности креатинкиназы у мышей mdx различных генотипов имеет такую же тенденцию.

Средний показатель активности КФК для мутантных самцов был достоверно выше, чем для нормальных самцов. Так же среднее значение КФК для гомозиготных самок было достоверно выше, чем для гетерозиготных самок. При этом стоит отметить, что у гомозиготных самок при наличии мутации сразу в двух Х-хромосомах среднее значение КФК было выше, чем для мутантных самцов.

Далее нам необходимо было оценить, насколько появление синтеза дистрофина после трансплантации РПМ человека будет компенсировать «утечку» маркерных ферментов из мышечных волокон в кровь у мышей mdx. Ранее мы обнаружили наличие человеческого дистрофина в мышечных волокнах мышей mdx спустя 1, 2, 3 и 5 месяцев после трансплантации человеческих клеток (глава 3.2).

На рисунке 30 показано изменение активности сывороточной креатинфосфокиназы (КФК) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) во времени до и после внутримышечного введения мышам mdx РПМ человека.

До трансплантации активность сывороточной КФК для мутантных самцов составляла в среднем 1958,3 ± 833,3 ед/л. После введения клеток человека спустя 1 месяц после трансплантации активность КФК у мышей-реципиентов была достоверно ниже, чем до трансплантации, и составляла 687,5 ± 270,8 ед/л. Через 2 месяца после введения РПМ человека концентрация КФК продолжала падать, и оказалась достоверно ниже, чем в начале эксперимента до введения клеток, в среднем она составила 520,83 ± 145,83 ед/л. Стоит отметить, что активность креатинфосфокиназы у мышей-реципиентов на сроках 1 и 2 месяца после трансплантации упала почти до уровня активности КФК у нормальных самцов (571, 43 ± 300 ед/л). Активность креатинкиназы у мышей-реципиентов на сроке 4 месяца после трансплантации составила в среднем 1343 ± 1248 ед/л (см. таблица I).

Похожие диссертации на Генетическая модификация дистрофин-дефицитной мышечной ткани в клеточной терапии наследственных миодистрофий [Электронный ресурс]

Исследование оптической иммерсии и окрашивания биологических тканей in vivo для целей оптической диагностики и лазерной терапииГенина Элина Алексеевна

Получение, характеристика и генетическая модификация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток крысы для применения в целях тканезаместительной терапииЛисковых, Михаил Александрович

Амидированность и окислительные модификации белков тканей крыс и сывороточного альбумина при модельном и физиологическом старенииДурканаева, Ольга Анатольевна

Закономерности изменений компонентов соединительной ткани в процессе формирования лучевого пневмосклероза и возможности модификации его развитияДубровская, Виолетта Федоровна

Модификация низкомолекулярными азотистыми катаболитами мутагенного эффекта окислительного стресса и их влияние на антиоксидантный статус клеток и тканейПокудина Инна Олеговна

Влияние "мягкой" иммуносупрессивной терапии на ткань интактных и пересаженных семенников (экспериментальное исследование)Александров Николай Юрьевич

Оценка риска поражения мышечной ткани при терапии статинамиСоловкина, Юлия Владимировна

Разработка и исследование микроволновых аппликаторов для тепловой терапии биологических тканейНоврузов, Илья Игоревич

Разработка методов и аппаратуры для диагностики и терапии биологических тканей Березин Анатолий Николаевич

Лазерная терапия разрывов мягких тканей родовых путейРаисова, Гульнара Кенжехановна