Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор б
1. О тест-системах, используемых для оценки генетических эффектов загрязнителей окружающей среды 6
2. Традесканция (клоны 02 и 4430) - чувствительная тест-система для изучения радиационного и химического мутагенеза 13
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 31
Глава П. Материал и методы 31
Глава Ш. Естественный и индуцированный мутационный процесс у традесканции клон 02 39
1. Естественный мутационный процесс в волосках тычиночных нитей клона 02 традесканции 39
2. Действие рентгеновского излучения на волоски тычиночных нитей традесканции 46
3. Действие урана-238 на волоски тычиночных нитей традесканции 58
Глава ІУ. Мутационный процесс у традесканции клон 02 при действии С-тимидина и С-лизина 70
Глава У. Заключение 97
ВЫВОДЫ 104
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- О тест-системах, используемых для оценки генетических эффектов загрязнителей окружающей среды
- Материал и методы
- Естественный мутационный процесс в волосках тычиночных нитей клона 02 традесканции
- Мутационный процесс у традесканции клон 02 при действии С-тимидина и С-лизина
Введение к работе
Актуальность проблемы. Вопросы генетических последствий загрязнения окружающей среды радиоактивными продуктами приобретают в настоящее время особую актуальность. В ближайшее десятилетие ожидается повышение уровня переработки уранового сырья, добычи урановых руд, рост мощностей атомных электростанций, использование ядерных взрывов в мирных целях. В свою очередь, естественные радионуклиды, ионизирующее излучение которых состоит из ^-квантов, fi -и /-частиц, несущих большую энергию, измеряемую сотнями тысяч электровольт, вносят большой вклад в природный фон излучения. А любое дополнение к этому фону способствует увеличению общего фона излучения.
Наиболее важным путем облучения от ядерных испытаний является пероральное поступление, в котором основной вклад вносят углерод-14, цензий-137 и стронций-90 ; далее следует внешнее излучение, обусловленное цезием-137 и некоторыми короткоживущими радионуклидами. Ожадаемые коллективные эффективные эквивалентные дозы за счет испытаний, проводившихся в атмосфере до конца 1981 года, составляют 2,1.10 чел-Зв, что эквивалентно примерно двум годам дополнительного облучения всего населения земного шара за счет естественных источников (доклад ЩЦАР ООН, 1982).
В связи с вышеизложенным, большую актуальность приобретает разработка чувствительных тест-систем для выявления и оценки мутагенов окружающей среды. Причем для каждого из уровней органической жизни использование тест-систем должно иметь самостоятельное значение. Тест-системы должны обладать следующими качествами: высокая чувствительность, простой и быстрый метод, воспроизводимость полученных данных, дешевизна и т.д. Почти всеми этими качествами обладает система волосков тычиночных нитей гетеро- - 4 -зиготного по окраске цветка клона 02 традесканции, при помощи которой изучают генетические эффекты физических и химических мутагенов по тесту соматических мутаций.
Загрязнение окружающей среды требует все новых экспериментальных исследований для оценки генетического риска при таком загрязнении. В связи со сказанным проведенные нами исследования по оценке генетических эффектов при действии на традесканцию клон 02 солей урана-238, рентгеновских лучей и соединений радиоактивного углерода-14 представляются нам вполне актуальными.
Цель и задачи исследования. Целью работы было проведение анализа дозовых "зависимостей при действии различных мутагенов (рентгеновские лучи, уран-238, углерод-14) на волоски тычиночных нитей клона 02 традесканции. В соответствии с поставленной целью в задачу исследования входило: I) исследование системы ВТН клона 02 традесканции - как чувствительной радиобиологической тест-системы ; 2) изучение дозовых зависимостей выхода мутаций при действии рентгеновских лучей, урана-238 и углерода-14 ; 3) сравнение эффекта действия 14(-.-лизина и 14С-тимидина для определения7 -трансмутационного эффекта.
Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное исследование действия на волоски тычиночных нитей традесканции клона 02 рентгеновского излучения, урана-238, инкорпорированного углерода-14 с целью сравнительного изучения генетических эффектов этих факторов.
При определении мутагенного эффекта углерода-14, включенного и не включенного в состав ДНК, не выявлена повышенная мутагенная эффективность С-тимидина, которую можно было бы ожидать в связи с трансмутационным эффектом.
Произведена оценка эффективности действия всех этих факторов с использованием прямого и косвенного методов оценки частоты возникновения мутаций, разработанных для популяции человека Научным Комитетом ООН по действию атомной радиации.
Практическая значимость работы. Произведенное испытание на мутагенность урана-238 выявило максимальный эффект при действии принятой в настоящее время предельно допустимой концентрации урана в воде (1,7 мг/л) (Искра, Бахуров, 1981). Согласно литературным данньм и прогнозньм расчетам ожидается увеличение добычи урановых руд, повышение уровня переработки уранового сырья и т.д., поэтому, учитывая полученные нами данные, рекомендовано пересмотреть эту величину ПДК.
Рекомендовано использовать систему ВТН клона 02 традесканции в качестве высокочувствительной мутационной и радиобиологической тест-системы, обладающей ценными свойствами, а именно: хорошая воспроизводимость данных, простой метод учета мутаций, возможность использования тест-системы на месте работы в производственным условиях и т.д.
Для сравнения мутагенности различных факторов предложено использовать прямой и косвенный критерии оценки, разработанные НКДАР ООН для оценки генетического риска облучения человека.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
О тест-системах, используемых для оценки генетических эффектов загрязнителей окружающей среды
Проблема генетической опасности мутагенов окружающей среды является чрезвычайно важной. Загрязнителями окружающей среды могут быть природные и искусственные источники ионизирующих излучений, химические добавки, используемые в промышленности, пестициды, автомобильные и промышленные продукты сгорания и т.д. По своей природе загрязнители делятся на физические, химические и биологические (Засухина, 1979). К физическим факторам относятся различные виды излучений, которые могут модифицироваться химическими веществами, являющимися в свою очередь загрязнителями окружающей среды, представляющими большую опасность. К биологическим факторам относятся вирусы, мутагены растительного происхождения, такие как афлотоксин, циказин и др. Действие каждого из них сильно варьирует при сочетанном воздействии с факторами другой природы. Необходимость в качественной и количественной оценке отрицательных эффектов от этих загрязнителей породила потребность использовать специально подобранные, чувствительные к этим мутагенам тест-системы. Причем для всех уровней органической жизни нужны свои специфические тест-системы. Использование комплекса различных тест-систем позволяет улавливать изменения, которые возникают под воздействием мутагенов окружающей среды. Использование набора различных тест-систем, включающих представителей про- и эукариотов, связано со специфичностью в действии ряда факторов, которые могут быть мутагенны для одних и неактивны в генетическом отношении для других объектов.
Материал и методы
Культивирование растений клона 02 проводилось согласно методике, разработанной в Брукхэйвенской Национальной лаборатории (США), откуда и был нами получен этот клон (underbrink et a],l973).
Растения удобно культивировать в обычной теплице, но поскольку они очень чувствительны, необходимо избегать таких условий как чрезмерная влажность, тепловой шок, присутствие газов и т.д. Растения обычно выращивали в глиняных горшках или в ящиках в смеси песка, почвы и торфа. Раз в одну - две недели растения удобряли разбавленной жидкой питательной средой Тамийя (Tamiya et ai. , 1953). Регулярно удаляли старые соцветия и побеги, что стимулировало развитие в узлах новых побегов и гарантировало постоянное снаб жение новыми соцветиями. Каждые полгода исходные растения делили и пересаживали на новую почву. Клоновые растения хорошо приживаются и через 6-8 недель дают соцветия для исследований.
Соцветие содержит компактную кисть мелких бутонов, самый молодой бутон находится в основании соцветия. До эксперимента удаляют все цветы и старые бутоны, т.к. они слишком зрелые, чтобы -получить от них генетическую информацию о результатах экспериментальной обработки. Удаление зрелых бутонов приводит к тому, что в соцветии остается их мало и для получения достаточной информации данные группируют из нескольких опытов.
Цветок имеет три голубых лепестка, окруженных чередующимися с ними тремя чашелистиками ; шесть тычинок - 3 противолепеетковых и 3 противочашелепестковых. Противолепестковые тычинки иногда длиннее и могут содержать более, чем на 8% больше волосков. В нормальных условиях каждая тычинка содержит 40-50 и более волосков. В свою очередь каждый волосок содержит до 32 клеток. Волоски, имеющие менее, чем 12 клеток в длину, в экспериментах по мутагенезу обычно учитываются как невыжившие. Это позволяет наряду с изучением зависимости мутабильности от дозы, анализировать также дозо-вую зависимость выживаемости после мутагенного воздействия.
Естественный мутационный процесс в волосках тычиночных нитей клона 02 традесканции
При помощи тест-систем, в том числе системы ВТН традесканции, определяют после воздействия различных мутагенов темп мутационного процесса относительно уровня естественного мутирования. Анализ ВНТ в контрольных вариантах наших экспериментов позволил накопить большой статистический материал по изменению уровня спонтанных мутаций во времени. В таблице 2 представлены данные трехлетних исследований. Согласно литературным данным спонтанная частота мутирования в расчете на волосок варьирует от низкой 0,48 + 0,15 х Ю 3 для клона 02 до высокой 5,21 + 0,2 х I0"3 для клона 4430. (A.Sparrow, R. Sparrow , 1976). В наших условиях спонтанная-частота розовых мутаций на волосок варьирует от 0,3 + 0,3 х Ю 3 до 4,6 + 0,64 х х Ю"3. Темп спонтанного мутагенеза в наших условиях несколько завышен, причем наиболее повышенный фон наблюдался в 1981 году, а в 1980, 1982 и в начале 1983 года спонтанный фон намного ниже. Всего за 1980 год было подсчитано 60530 тычиночных волосков и спонтанная частота мутаций по волоскам составила 1,4 + 0,2 х КГ3. Такой же уровень естественного мутирования был выявлен в 1982 году на материале 5I7I0 подсчитанных,тычиночных волосков. Естественный же фон 1981 года составил 3,1 + 0,2 х Ю 3 на волосок при 91295 подсчитанных тычиночных волосках. Такое повышение спонтанного уровня в 2 раза можно объяснить следующим.
Мутационный процесс у традесканции клон 02 при действии С-тимидина и С-лизина
В связи с развитием атомной промышленности особое внимание уделяется проблеме генетических последствий распада искусственных радионуклидов. Искусственные изотопы легко включаются в генетический материал, вызывая поражение.
Изучаемый нами углерод-14 является чистым /3-излучателем со средней энергией 49,5 кэВ и периодом полураспада 5730 лет. Он образуется при ядерных взрывах вследствие захвата избыточных нейтронов присутствующим в атмосфере азотом. Находясь в форме двуокиси углерода, он усваивается растениями в результате процесса фотосинтеза и затем по пищевым цепочкам попадает в тело человека. Показано, что удельная активность его в тканях тела человека приходит в равновесное состояние с количеством СО в атмосфере с задержкой приблизительно на 1,4 года (доклад НКДАР ООН, 1982 год).
В обзоре Василенко И.Я. с соавторами (1979) изложены данные о миграции и кинетике обмена С. Показано, что кинетика обмена определяется формой его химического соединения. Неорганические соединения І4С характеризуются высоким уровнем метаболизма. с в форме органических соединений (углеводов, жиров, белков) задерживается в организме на более длительный срок. Различие в кинетике обмена разных соединений 14С приводит к формированию неодинаковых доз облучения органов и тканей.
Если предположить, что 14С равномерно распределяется во всем мире, то ожидаемые дозы за счет этого нуклида, выпадающего с глобальными радиоактивными осадками, составляет 1,1 х Ю 3Гр для гонад, 1,3 х Ю"3Гр для легких, 4,4 х Ю"3Гр для клеток, выстилающих костные полости и 4,8 х Ю 3 для красного костного мозга.
Ожидаемая доза для всех других тканей принимается равной 1,2хЮ 3Гр. Ожидаемая доза за счет С формируется за очень большой период времени. К 2000 году накопится лишь 7%, к 2020 - 8%, а к 2050 - 10$ общей ожидаемой дозы (доклад НКДАР ООН, 1982 год).
Весьма важно знание относительной генетической эффективности радионуклида. Сравнение генетической эффективности инкорпорированного 1 0 и внешнего острого -излучения по показателю частоты доминантных летальных мутаций, индуцированных в постмейотических клетках мышей, показывает, что они примерно одного порядка. (Шевченко с соавт., 1981 ; Померанцева, Вилкина, 1974).
Все эти данные свидетельствуют об особой актуальности работ, проводимых с искусственными радионуклидами.
В работе с радионуклидами следует при определении мутагенного эффекта учитывать эффект трансмутации радиоактивного изотопа; следует учитывать распределение данного радионуклида по тканям, по клеточным компонентам, эффективность связывания с ДНК и величину суммарной энергии трансмутации ; а также в некоторых случаях необходимо знать места предпочтительного связывания того или иного радионуклида на ДНК (Грачева, Королев, 1977 ; Королев, 1980).
Для определения темпа мутагенеза у традесканции клон 02, а также определения трансмутационного эффекта от распада включенного в хромосому С были использованы меченные этим изотопом тимидин и лизин.
Соцветия традесканции в течение всего эксперимента находились в радиоактивном растворе. Частоту мутаций и динамику накопления определяли, начиная с восьмого дня от начала экспериментов. Динамику накопления определяли с помощью счетчика SL-4000 interecnique т Мощности доз и дозы были рассчитаны на основе графиков по накоплению изотопа. Для каждой повторности экспериментов рассчитывали выборочную среднюю и ее ошибку. Более подробно методическая часть работы описана в разделе "Материалы и методы".
Для того, чтобы определить, как распределяется включенный С в различные органы цветков, накопленные метки определяли отдельно в тычинках, чашелистиках и лепестках. На рис.II показано распределение С-тимидина по органам цветка в варианте с активностью 9,25.10 Бк/мл. Происходит интенсивное накопление метки, причем на 10-й день от начала эксперимента 53% метки было накоплено в тычинках, 19% - в чашелистиках и 26% - в лепестках. На 20-й день метка распределилась следующим образом: 37%, 27% и 35%, а на 31-й - 45%, 25% и 30 % соответственно в тычинках, чашелистиках и лепестках. Таким образом, большая часть метки накапливается в тычинках, а остальная часть распределяется между чашелистиками и лепестками. Такое же распределение метки происходит и при включении С-лизина. Трудно предположить, что может происходить внешнее облучение тычинок за счет С, включенного в лепестки и чашелистики, поэтому мощности доз и дозы были рассчитаны на основе графиков по накоплению метки в тычинке.
