Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Систематика и филогения мити лин 8
1.1. Филогенетические иселедоиания митилид 8
1.2. Видовая принадлежность Mytihis ex gr. edulis, обитагощих в водах Японского моря 9
ГЛАВА 2. Методологические основы исследования 13
2.1. Молекулярная систематика и молекулярная филогенетика 13
2.2. Основные принципы кладистики 15
2. 3. Использование аллозимов в качестве генетических маркеров 18
ГЛАВА 3. Материал и методика 25
3.1. Материал исследований 25
3.2. Генетико-биохимические методы исследования 27
3.3. Популяциоино-гснетический и филогенетический анализ 31
3.4. Метод AFLP 34
3.5. Морфомстричсский и статистический анализ 36
ГЛАВА 4. Построение филогении митилид, основанная на частотах аллелей изоферментов 40
ГЛАВА 5. Подтверждение факта гибридизации MytHus trossnlus и М. galloprovincialis в российских водах японского моря 52
ГЛАВА 6. Таксономический состав популяций комплекса Mytihis ex gr. edulis, населяющих воды японского моря 59
Выводы 83
Литература 84
Приложения 100
- Филогенетические иселедоиания митилид
- Молекулярная систематика и молекулярная филогенетика
- Генетико-биохимические методы исследования
- Морфомстричсский и статистический анализ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Мидии, или мити л иды (Bivafvia: Mytilidae) являются одними из наиболее знакомых нам морских беспозвоночных. Огромное их разнообразие представлено приблизительно 250 современыми видами, входящими в состав 33 родов (Boss, 1971), или 57 современными и вымершими таксонами родового ранга (Kafanov, Drozdov, 1997). Некоторые митилиды, в том числе почти все представители подсемейства Mytilinae имеют ценность как объект рыбохозяйственпого промысла и аквакулыуры. Ископаемые остатки мидий имеют важное значение для биостратиграфии. Распространены митилиды от литоральной зоны (например, подавляющее большинство митилин, являющихся объектом нашего исследования) до глубин в несколько километров. Они формируют поселения на каменистых и галечных грунтах, сверлят камни, поселяются в илах (Ваупе, 1964; Scarlato, 1981), а также в районах глубоководных гидротермальных источников и выходах холодных минерализованных вод (Lutz, Kennish, 1993; Distel, et al., 2000). Митилиды интегрированы в состав различных экологических сообществ, а некоторые из них, в том числе многие митилины, включая Mytilus ex gr. edulis (см. спраку о систематике исследованных таксонов в разделе 3.1. на с. 26), играют важнейшую роль в формировании этих сообществ (Скарлато, Старобогатов, 1979; Seed, 1992).
Популяционныс и таксономические исследования мити л ид имеют давнюю историю. Однако, большинство филогенетических гипотез, выдвинутых в течение последнего столетия на основе классических морфологических работ для Mytilinae и Mytilidae в целом, весьма противоречивы. В частности, широко распространенные в мировом океане съедобные мидии группы «edulis», или более корректно Mytilus ex gr. edulis (Чичвархин и др., 2000), привлекали особое внимание исследователей из многих стран мира (Seed, 1968, 1971; Skibinski et al., 1978, 1983, 1994; Zouros et al., 1992; Sarver, Foltz, 1993; Gosling, 1992a, Saavedra et al., 1996;
4 Gilg, Hilbish, 2003). Помимо всего прочего, исследователей в значительной" мере интересовал вопрос изучения зон гибридизации М. edulis с М. galloprovincialis (Skibinski et al., 1978, 1983, Gosling, 1992a; Rawson, Hilbish, 1998; Gilg, Hilbish, 2003) и M. trossulus и M. galloprovincialis (Sarver, Foltz, 1993; Heath et al., 1995; Ravvson et al., 1999). Эти исследования дали толчок для оживленной дискуссии о статусе таксонов группы Mytilus ex gr. edulis, которые инициировали в том числе и данную работу.
Цели работы: Изучить генетическую дифференциацию и молекулярную систематику мигилин Японского моря на основе методов биохимической генетики, молекулярной генетики и морфомстрии. Провести анализ гибридизации и потенциала интрогрессии генов между таксонами irjynnbi близнецовых видов комплекса Mytilus ex gr. edulis.
Основные задачи:
Протестировать гипотезу о монофилии трибы Mytilini и выявить филогенетические взаимоотношения входящих в ее состав видов.
Подтвердить, либо опровергнуть с помощью методов молекулярной систематики гипотезу о конспецифичности Mytilus califomianw и М. contscus, неоднократно выдвигаемую рядом современных исследователей (Vermeji, 1991; Kenchington et al., 1995).
3. Установить видовую принадлежность представителей комплекса Mytilus ex gr. edulis, обитающих в водах Японского моря.
4. Подтвердить, либо опровергнуть гипотезу о возможности гибридизации видов Mytilus ex gr. edulis в российских водах Японского моря и оценить возможность интрогрессии генов между видами.
5. Установить применимость использования данных об аллозимной изменчивости для выведения филогении между таксонами митилид различного таксономического ранга.
5 Научная новизна работы Впервые для построения филогении дальневосточных митилин была использована совокуность данных по аллслыгои изменчивости 24 аллозимных локусов. Достоверно показана монофилия трибы Mytilini. Базальное положение в ней занимает С. grayanus. В составе этой трибы выявлена мопофилетичсская іруппа видов Mytilus ex gr. edulis, наряду с которой таксоны Crassimytilus и Pacifimylilus формируют монофилетическую группу (род Mytilus).
Впервые при помощи бутстреп-теста определены границы использования генетико-биохимических данных для филогенетических построений. Показано, что данные об аллозимной изменчивости пригодны для установления филогепетическиз взаимоотношений между таксонами митилид в пределах рода, либо близких родов одной трибы. При сравнении видов, относящихся к разным трибам и подсемействам, данный метод оказывается непригодным по причине ошибочной интерпретации элсктроморф, обладающих сходной электрофоретической подвижностью, как гомологичных.
Используя в качестве видоспецифичного генетического маркера участок неповторяющихся последовательностей гена полифенолыюго клеющего белка биссуса, а также аллозимный маркер маннозофосфатизомеразу, впервые для России исследовали двустворчатых моллюсков рода Mytilus (М. trossulus и М. galloprovincialis), обитающих в заливе Петра Великого и сопредельных водах Японского моря. Показана возможность применения данных генетических маркеров для идентификации близкородственных видов рода Mytilus и их гибридов в зонах совместного обитания, в частности в прибрежных водах Приморья. Наличие примерно 11 % гибридных особей подтверждает мнение о существовании зоны гибридизации между М. trossulus и М. galloprovincialis в этом регионе.
Практическое и теоретическое значение работы.
Определены рамки использования аллозимных признаков для выведения филогенетических взаимоотношений между таксонами мити л ид разного ранга, что может быть использовано в дальнейшем в при планировании эволюционных генетико-биохимических исследований,
Внесена ясность в систематику таксона Mytillilnae, имеющего важное хозяйственное и научное значение.
Определен видовой состав япономорских Mytilus ex gr. edults, являющихся одним из основных объектов марикультуры в этом регионе.
4) Показан факт гибридизации видов группы Mytilus ex gr. edulis, что может оказаться важным в ходе их культивирования, а также открывает перспективу фундаментальных исследований в области механизмов генетической изоляции между способными гибридизоватьея видами морских беспозвоночных, имеющими дву родительское наследование митохондриальной ДНК.
Апробация работы. Результаты исследований и основные положения докладывались на международном конгрессе «Towards a Great Future of Aquatic Genomics» (Токио, 2000), на III международном симпозиуме Modern Achievements in Population, Evolutionary and Ecological Genetics (Владивосток, 2001), на ежегодной научной конференции ИБМ ДВО РАН (Владивосток, 2000, 2001), и на Расширенном генетическом семинаре ИБМ ДВО РАН (Владивосток, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, из которых 3 на английском языке и 2 на русском, обе из которых переведены на английский язык; еще одна работа находится в печати в журнале Korean Journal of Genetics.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на ПО страницах машинописного текста, включает 16 рисунков и 9 таблиц. Список цитированной литературы содержит 157 названий, из них 125 на
7 иностранных языках. В приложение, занимающее 12 страниц, вынесены первичные данные.
Благодарности. Автор сердечно благодарен своему научному руководителю, в.и.с. ИБМ ДВО РАН, д.б.н. Ю.Ф. Картавцеву за огромную помощь и постоянную поддержку в работе. Автор искренне признателен за сбор материала на морской биологической станции «Бодега Бэй» (Bodega Bay, California) доктору Дэнису Хсджкоку, а также Клер Даген (Университег г. Сэт, Франция) за предоставленный материал М. galloprovinvialis с южного побережья Франции и М. editlis с о. Гельголанд (Северное морс). Автор глубоко признателен сотрудникам Лаборатории генетики ИБМ ДВО РАН: г.н.с., д.б.н. А.И. Пудовкину и с.н.с, к.б.н. Г.П. Манченко за ценные советы и всестороннюю помощь в процессе работы над диссертацией. Автор считает своим приятным долгом отметить поддержку исследования работ грантами РФФИ: 899-04-48912, 98-04-49168, а также грантом ФЦП «Интеграция» и специальной программой США из средств агентства CRDF.
Филогенетические иселедоиания митилид
Наиболее полную на сегодняшний день молскулярно-филогепетическую гипотезу относительно митилид сравнительно недавно предложил Дистел в своей работе, основанной па нуклеотидной последовательности митохондрпального гена 18S-pPHK (Distel, 2000). Эта филогения включала в себя 12 видов, относящихся к шести родам, а также несколько видов из других семейств, взятых в качестве внешней группы. В своей работе автор пользовался классификацией, предложенной Ньюэллом (Newell, 1969), найдя пьюэлловское подсемейство Mytilinae Rafinesquc, 1815 полифилетичным. Также Дистел отметил схожую скорость дивергенции гена 18S-pPHK у исследованных им родов .митилид, причем уровень этой дивергенции был приблизительно равен различиям между представителями различных семейств Bivalvia. Помимо этого, он предложил гипотезу о неоднократном возникновении модиолоидного и митилоидного строения тела митилид, однако эта гипотеза была поставлена под сомнение (Chichvarkhin, 2002), так как в исследование Дистеля не были включены иные митилоидные формы, кроме Mytilinae, а также по причине того, что раковина представителей рода Ногтотуа, оказавшегося причиной полифилии Mytilinae sensu Newell в действительности вряд ли может быть классифицирована как митилоидная. Помимо этого, филогения Дистела имела существенные разногласия с результатами исследований морфологии спермиев митилид (Kafanov, Drozdov, 1997).
Помимо наиболее известной основанной на палеонтологических данных так называемой «сут-райэновской» классификации (Soot-Ryen, 1969), последовательно использованной Ныоэллом и Дистел ем, было предложено еще несколько схем классификации митилид. После первого обзора Сут-Райэпа (Soot-Ryen, 1955) стало обычной практикой выделять среди митилид четыре подсемейства: МуШІпас, СгспеШпас Gray, 1840,
Lithophaginae H.Adams et A.Adams, 1857, и Modiolinac Keen, 1958. Более поздние классификации (Bernard, 1983; Moore, 1983) выделяли те же подсемейства, что и Сут-Райэн, однако их состав был весьма отличен (см. Kafanov, 1987). Позже Habe (1977) выделил пятое подсемейство, Musculinac Iredalc, 1939, a Higo et al. (1999) дополнили список подсемейств сравнительно недавно описанными Dacrydiinac Ockelmann, 1983 и Bathymodiolinae Kenk et Wilson, 1985.
Совсем иную систему предложили Скарлато и Старобогатов (Скарлато, Старобогатов, 1979, 1984; Скарлато, 1981; Starobogatov, 1992), которые разделили Mytiloidea на четыре отдельных семейства: Mytilidae, Crenellidae, Septifcridae и Lithophagidae. Последнему таксону также придается ранг семейства в недавнем обзоре двустворок северо-западной Пацифики (Coan, et al., 2000). Далее Скарлато и Старобогатов выделили дополнительно 13 подсемейств (ем. Кафанов, 1987), Эта система подразумевает также полифилию сут-райэновского семейства Mytilidae. К сожалению, диагнозы их таксонов слишком кратки, а предложенная схема классификации лишена какой-либо аргументации.
Мидий группы Mytilus ex gr. edulis, обитающих на тихоокеанском побережье России, традиционно относили к виду Mytilus edulis (Скарлато, 1981; Скарлато и Старобогатов, 1979). Однако исследователями неоднократно высказывались сомнения в этом отношении, а также о таксономической однородности поселений этой мидии. Полагали, что в приазиатской части Тихого океана обитают три подвида: М, edulis edulis Linnaeus, 1758, М. е. zhirmunskii Scarlato et Starobogatov, 1979 и M. е. kussakini Scarlato ct Starobogatov, 1979. О вероятном существовании в этом регионе двух форм «съедобной мидии» говорили Жирмунский и Писарева (1960). Кафанов и Ромейко (1987) на основании морфометрического анализа мидий из северо-западной части Японского моря приходят к иному выводу, они полагают неправомерным подразделять дальневосточных М, edulis па отдельные подвиды. Позже, о наличии таксономической гетерогенности в поселениях Mytilus в зал. Посьета отмечал Кепель (1983).
Главным образом, обсуждение таксономической принадлежности тех или иных популяций Mytilus проводилось на основе конхиологических признаков, почти все из которых крайне изменчивы, что затрудняет систематику семейства митилид в целом (Seed, 1968; Gosling, 1984; Кафанов, Ромсйко, 1987; Золотарев, Шурова, 1997). С развитием метода генетики изофермептов удалось прояснить некоторые особенности таксономии и расселения мидий. Сходство аллозимных спектров показало, что средиземноморская мидия М. galloprovincialis Lamarck, 1819 также встречается и Японии (Wilkins е al., 1983), северной Африке (Comesana et al., 1998) и в южной Африке (Grant, Cherry, 1985; Beaumont et al., 1989), на Британских островах (Ahmad, Breadmore, 1976; Skibinsky et al., 1980) и в Южной Калифорнии (MacDonald, Koehn, 1988). Мидиям M desolationis с архипелага Кергелен в южной части Индийского океана, был придан статус подвидам edulis (Blot et al., 1988). Ha протяжении атлантического побережья Европы М. edulis и М. galloprovincialis встречаются совместно, иногда скрещиваются, но доля их гибридов варьирует от локальности к локальности (Skibinski et al., 1978, 1983; Skibinsky, 1983; Comesana, Sanjuan, 1997). С помощью аллозимов оказалось также возможным дискриминировать третий вид мидий — тихоокеанскую мидию, М. trossulus Gould, 1850, встречающуюся на тихоокеанском побережье Северной Америки, и на южной границе своего ареала в центральной Калифорнии гибридизующуюся с М. galloprovincialis (McDonald, Koehn, 1988). М trossulus также встречается в некоторых районах Канады, местами гибридизуясь с М. edulis (Koehn et al., 1984), па Дальнем Востоке России (Мак-Дональд и др., 1990), а также в Балтийском морс (Varvio et al., 1988). М. trossulus был также описан Гоулдом (Gould, 1851) как М. glomeratus,
Молекулярная систематика и молекулярная филогенетика
Первые попытки построения филогении по молекулярным данным были предприняты еще в начале XX века. Близкородственные по данным классической биологии виды оказались более близкими и по иммунологическим данным. Это и было использовано при построении филогении млекопитающих (Nutall, 1904).
Молекулярная филогения - это установление и изучение эволюционных связей между организмами, в основе которого лежат данные, полученные при помощи методов молекулярной биологии. В свою очередь, молекулярная систематика является наукой о дифференциации и классификации живого мира при помощи данных, полученные при помощи методов молекулярной биологии. Молекулярные методы могут помочь решить спорные вопросы филогении и систематики, которые трудно разрешить другими методами. В качестве признаков при построении молекулярных филогении могут выступать иммунологические данные, любые данные анализа конкретных молекул (например подвижность при электрофорезе), данные по гибридизации молекул ДНК и РНК, сами первичные структуры биополимеров. Молекулярная систематика оперирует признаками, полностью независимыми от тех, что используются в других эволюционных построениях. Поэтому можно считать, что это направление является хорошим методом как для сопоставления разных гипотез, так и для самостоятельного построения системы живого мира. Более того, метод молекулярной систематики позволяет анализировать гомологичные признаки там, где классические методы пока не дали определенного результата. Например, в случае сильно дивергировавших таксонов, таких как типы или царства. К тому же, в молекулярной систематике число учитываемых признаков намного больше, чем прищнаков, используемых морфологами: анализируются сотни нуклеотидов, даже после удаления неинформативных позиций.
Результаты исследования первичной структуры нуклеиновых кислот является мощным критерием установления родственных связей.
Начиная с 1950 года число филогенетических построений на основе молекулярных данных резко возросло. Основными исходными данными становятся данные по первичным структурам биополимеров. Следствиями популярности данного подхода явилась разработка разнообразнейших методов построения филогении и методов оценки расстояния между макромолекулами белка или ДНК/РНК и появление нового направления эволюционной биологии - филогенетики. С использованием метода молекулярной систематики были получены доказательства моиофилии эукариот (Kumar, Rzhetsky, 1996), всех многоклеточных животных (Wainraight et al., 1993), происхождения двумембранных клеточных органелл (митохондрий и хлороп ластов) от про кар иоти чес ко го предка (Lang et al., 1997), и многое другое.
Первые математические методы построения филограмм на основе преимущественно молекулярных данных, возникли еще в начале 60-х годов вместе с первыми вычислительными программами. Все они были основаны на принципах нумерической таксономии (Fitch, Margoliash, 1967; Wagner, 1962; Farris, 1970 и др.). Следовательно, в данном случае родство определялось по критерию "общего сходства" — чем выше значение этого параметра, тем ближе таксоны друг к другу.
В основе современных дистанционно-матричных методов филогенетического анализа лежат те же принципы с их модификациями, которые технически менее громоздки. С их помощью за короткое время можно анализировать довольно массивные базы данных (Swofford, Olsen, 1990; Nei, Kumar, 2000; Felsenstein, 2003). Разумеется, филограмма, полученная такими методами, как и построенная при помощи других подходов, не отражает эволюционного процесса, а только демонстрирует конечную степень дивергенции таксонов.
Для выяснения эволюционного родства необходим анализ состояния конкретных признаков, которые изменялись в процессе эволюции. Обычно предполагают, что эволюционный путь признака должен быть таюш, который требует наименьшего числа его преобразований. В этом и заключается принцип "максимальной экономии", следуя которому, возможно выстроить схемы родственных отношений (Sober, 1988; Harvey, Pagel 1991; Stewart, 1993). Это универсальный кладистический метод, позволяющий анализировать любые сравнительные базы данных -морфологические, поведенческие, физиологические, молекулярные и т.д. (Swofford, Olsen, 1990).
За последние десятилетия были разработаны компьютерные программы, использующие этот принцип для анализа филогенетических связей па основе первичных структур нуклеиновых кислот (см. Swofford, Olsen, 1993; Felsenstein, 2003).
Генетико-биохимические методы исследования
В качестве источника изофермснтов использовались ткани пищеварительной железы (геп ато панкреаса) моллюсков; в некоторых случаях использовалась ткань мускулов-замыкателей (см. ниже). Препараты (экстракты белков из тканей) готовились непосредственно перед началом проведения электрофореза. Отделенный гепатопанкреас промывали в дистиллированной воде, после чего гомогенизировали в фарфоровой ступке с добавлением небольшого количества толченого стекла (для более тщательной гомогенизации) и 0,1 мл приготовленной заранее лизирующей жидкости. Полученный таким образом гомогенат центрифугировали в течение 15-20 минут при 15000 об./мии. на центрифуге К-24. В качестве проб для внесения в гель использовали отобранную пипеткой после ценрифугирования надосадочную жидкость.
Электрофорез проводился в горизонтальном блоке крахмального геля в камере для электрофореза, схема которой изображена на Рис. 1. Размер гелсвого блока в камере составлял 17x22 ем. Одновременно в таком блоке разделяли по 30 образцов. Пробы наносили с помощью фитилей из хроматографического ватмана ЗММ Chr (Whatman, Германия), пропитанных гомогенатом. Для предотвращения денатурации белков во время электрофореза, камеру помещали в холодильник (около +4С), а поверх геля помещали блоки с ледяной смесью. Контроль за скоростью протекания электрофореза осуществляли при помощи метки бромфеиолового синего. По окончании электрофореза гелевьш блок разрезали на 5-6 плоскопараллельных срезов при помощи проволочного резака.
Для приготовления 14 %-го крахмального блока, 77 г крахмала заливали в конической колбе 150 мл гелевого буфера и тщательно взбалтывали, одновременно доводя до кипения 400 мл гелевого буфера, а затем вливали его в полученную суспензию при интенсивном встряхивании и доводили гель до кипения при непрерывном встряхивании колбы, чтоб не дать гелю пригореть. Далее гель оставляли на 15-20 минут при комнатной температуре, после чего, сняв образовавшуюся на его поверхности пленку, заливали в верхнюю электрофоретическую камеру. После остывания до комнатной температуры, гелевый блок помещали на 60 мин. в холодильник при температуре +4 С. 1) Блок с охлаждающей смесью (льдом). 2) Гелевый блок. 3) Стекло. 4) Верхняя камера. 5) Фитиль с меткой (пробой). 6) Отсек с катодным буфером. 7) Отсек с анодным буфером. 8) Катод. 9) Анод. 10) Нижняя камера. 11) Разделительный отсек.
В качестве буферной среды для электрофореза большинства изоферментов использовался трис-ЭДТА-малеатный буфер рН 7,4 (Серов и др., 1977). Также, были использованы: трис-нитратный буфер рН 7.0 (Серов и др., 1977) для PGM, ГОН, GPT, 0-GAL, трис-цитратный рН 8.0 для MPI (McDonald, Koehn 1990), и буфер Портера (трис-ЭДТА-боратный) - рН 8.6 для GPI и 1РР (Серов и др., 1977).
Источником постоянного тока служил универсальный источник питания Б5-50. Электрофорез велся параллельно в двух блоках при напряжении 130 вольт (с три с-нитратным буфером) и 140 вольт (с буферами Портера и трис-ЭДТА-малеатным) и силе тока 30 и 40 миллиампер соответствен!ю в течении 12 и 10 часов.
Для обнаружения зон локализации ферментов на плоско-параллельные срезы гелевого блока по окончании электрофореза наносили соответствующие реакционные смеси в виде гелсвых аппликаций на основе 2 % агарового геля, либо заливали водной реакционной смесью и инкубировали в термостате при температуре 37С до появления окрашенных зон (Серов и др., 1977; Manchenko, 1994). Зоны активности MAD, GPT и P-Gal наблюдали в ультрафиолетовом свете. После проявления окрашенных зон активности ферментов фореграммы зарисовывали и описывали.
Исследовали 26 ферментных локусов: 1) MAD- метилумбеллиферилдеапетилаза, известна в работах многих авторов, работавших с моллюсками, как эстераза-D (ЕС 3.1.1.1), 2) LAP- лейцинамшюпептидаза (, ЕС 3.4.11.1), 3) 7/,/ глкжозо-6-фосфатизомераза(, EC 5.3.1.9), 4) 0№Ж-октопиндегидрогеназа(, ЕС 1.5.1.11), 5, 6) PGM-l и PGM-2 - фосфоглюкомутаза (ЕС 5.4.2.2), 7) Л//7-малнозофосфатизомсраза (ЕС 5.3.1.8.), 8, 9) MDH-l и MDH-2 - ПАД-зависимая малатдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.37), 10, 11) МЕ-1 и МЕ-2 - НАДФ-зависимая малатдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.40), 12)СЛГ-каталаза(ЕС 1.11.1.6), 13) XDH- ксантиндегидрогеназа (ЕС 1.1.1.204), 14, 15) РР-1, РР-2 -неорганическая нирофосфатаза (ЕС 3.6.1.1), 16) G5/Y) - глицерол-3-фосфатдегидрогєігаза (ЕС 1.1.1.8), 17) G6PD - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.49), 18) SOD-1- супероксиддисмутаза (ЕС 1.15.1.1), 19) ARGK - аргининкиназа (ЕС 2.7.3.3.), 20) GPT- глутамат-пируваттрансаминаза (ЕС 2.6.1.2), 21,22) IDH-1, 1DH-2 - изоцитратдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.41), 23, 24) ААТ-І и ААТ-2 - аспартатамииотрансфераза (ЕС 2.6.1.1), 25) FDH- формальдегид дегидрогеназа (ЕС 1.2.1.1) 26) ALD- альдолаза (ЕС 4.1.2.13).
Для электрофоретичсского анализа ONDH, ARGK, GPT, MDH, PGM брали экстракт из ткани мускулов-замыкателей. Для анализа остальных использованных в работе ферментных систем использовался экстракт тканей гепатопанкреаса.
Статистическая обработка материала включала оценку соответствия фактических и ожидаемых пропорций генотипов стадаргным критерием хи-квадрат (Рокицкий, 1973), хи-квадрат-тест па гетерогенность аллсльных частот по алгоритму Workman, Niswander (1970), оценку минимальных генетических расстояний Нся (Nci, 1972; 1978), Роджерса (Rogers, 1972), Кавалли-Сфорца (CavalM-Sforza, 1967) и другие меры (Nei, 1987).
Для статистической обработки полученных данных использовались следующие параметры аллозимной изменчивости, полученные при помощи программ Specstat (Картавцев, Соловьев, 1992), BIOSYS (Swofiord, Sclander, 1981) и GENEPOP (Raymond, Rousset, 1995): 1) р, - частота і -того аллеля. 2) Hs (Неїр) - ожидаемая из соотношения Харди-Вайнберга гетерозиготності) в одной выборке, H$=]-2f j, где/- частота /-того аллеля в выборке (Мстглср, Грсгг, 1972). 3) Но {HUbs) - наблюдаемая гетсрозиготность в выборке, Ho=Dtj/n, где Л/ - численность гетерозигот по і-тому локусу, « - число исследованных особей в популяции (Меттлер, Грегг, 1972, Айала, 1984). В качестве мер внутривидовой дифференциации использовали, в основном, F-статистнки в символике Нся (Nei, 1977): 4) F IS - меРа отклонения наблюдаемой гетерозиготно сти от ожидаемой из соотношения Харди-Вайпберга (Nei, 1978). Fjs=(Hs-Ho)/Hs. Значения FjS выше нуля отмечают дефицит, ниже нуля - избыток гетерозигот в группах.
Морфомстричсский и статистический анализ
Данные о генетической изменчивости 9 исследованных видов MytUidae представлены четырьмя различными мерами (Табл. 1). Средний размер выборки на локус составил 14-70 особей (Табл. 1). Наиболее изменчивым видом оказался модиолус М. modiolus. Так, по четырем использованным мерам - среднему числу аллелей на локус (А), доле полиморфных локусов (Р.99) и средней гетерозиготності! на особь (H0bs и Нехр) для этого вида получены следующие значения: А = 3,5, Р.99 = 54,8%, Hobs 0,317, Нсхр = 0,273 (Табл. 1). Наименее изменчивыми оказались М coruscus и С. grayamis: А 2,3, Р.99 = 35,5%, H0DS = 0,051, Нехр = 0,054; А = 2,9, Р.99 = 29,0,1 Iobs = 0,081, Нехр - 0,090, соответственно (Табл. 1).
Частоты аллелей для 9 исследованных видов мидий по каждому из 26 аллозимных локусов (изофермент PGM-2 не был включен в анализ по причине отсутствия данных по нему в двух выборках) вместе с размерами выборок по ним даны в Приложении 1. Но этим данным рассчитаны ожидаемые в предположении равновесия Харди-Вайнберга частоты генотипов и проведено тестирование по критерию хи-квадрат (х2) соответствия фактических и ожидаемых численностей. Из-за небольших размеров выборок, ограничимся здесь лишь анализом значений 2, вычисленных только для объединенных генотипических классов. Для М trossulus статистически значимые отклонения обнаружены по локусам: LAP (х2=9.74, р=0.002), ААТ-2 (х2=4.49, р-0.034), GPI (х2=10.56, р=0.001), MAD (х2=6.28, df=l, р=0.012). Для М. galloprovincialis от равновесных значений статистически значимо отклоняются фактические численности генотипов по локусам: MAD (х 2= 4.50, р-0.034) и PGM-1 (%2= 16.08, р=0.000). Для М. coruscus только по локусу LAP отмечены значимые отклонения: х2=17.66, р=0.
Примечание, n - число особей, P.99 - доля полиморфных локусов (при частоте основного аллеля 0.99), А - среднее число аллелей на один локус, Нечр - ожидаемая гетерозиготно сть, H„bS - наблюдаемая гетерозиготності., D — дефицит гетерозигот.
Для М. californiamts и С. grayemus значимых отклонений не обнаружено вообще. Для М. modiolus значимы отклонения по локусам: МЕ-1 (х2=3.59, df=l, р=0.04б), ONDH (х2=7.34, df=l, р=0.007), MPJ (Х2=27.30, dfH, р=0.000) и PGM-1 ( =5.73, df4, р=0.017). Для A.fatcatoides значимы отклонения по локусу MPI : Х2=22.1 1, df=l, р=0.000. Для S. keeni статистически значимы отклонения фактических и ожидаемых численностей генотипов по локусам: CAT (%2=16.66, df=l, р=0.000), МРІ (%2=5.06, df=l, р-0.024) и PGM-1 {у?=636, df=l, р=0.012) (Табл. 1, Приложение 1). Го есть, для всех видовых и полокусных сравнений значимы 15 из 49 тестов, или - 31%. Учитывая поправку на множественность тестов (Зайкии, Пудовкин, 1991), можно констатировать, что на 5%-ном уровне значимы 6 из 49 тестов, или - около 12%. Таким образом, одними лишь статистическими причинами не представляется возможным объяснить наблюдаемые отклонения. В подавляющем большинстве тестов наблюдаются отклонения в сторону дефицита гетерозигот (см. H0[,s и Нечр, Табл. 1), что для двустворчатых моллюсков является известным фактом.
Данные о частотах аллелей (Приложение 1) легли также в основу расчета коэффициентов генетического различия или генетических расстоянии (Табл. 2). Первоначально были рассчитаны все коэффициенты сходства/различия, представленные в программных пакетах BIOSYS-1 и PHYLIP 3.0. Как выяснилось, кластеризация видов предопределяется как используемыми коэффициентами сходства/различия, так и методикой соединения операционных таксономических единиц (ОТЕ). Дальнейший анализ строили, основываясь на стандартном генетическом расстоянии Нея (D») (Nci, 1972), при использовании трех методов кластеризации - NJ, UPGMA и Вагнера. Были использованы также данные кластерного анализа, с применением хордового расстояния Кавали-Сфорца (Рис. 3).
Полученные величины генетических расстояний минимальны для нары видов М. trossulus / М. galloprovincialis: DR = 0.111, DN = 0.054. В целом 6 видов из родов Mytilus и Crenomytilus имеют меньшие средние расстояния между собой - DR= 0.352, D = 1.416, чем остальные три вида к этой группе - DR= 0.807, DN= 2.243 (Табл. 2).
Генетические расстояния Роджерса (Rodgers, 1972) (ниже диагонали) и стандартные расстояния Нся (Nei, 1972) (выше диагонали) между выборками 9 исследованных видов митилид
Большинство из использованных мер сходства/различия дают одинаковую, в общих чертах, кластеризацию изученных видов митилид, В точности совпадают топологии кладограмм 9 изученных видов, построенных на основе генетических расстояний Роджерса и Кавали-Сфорца. Можно говорить о биологически осмысленной, устойчивой кластеризации ОТЕ (коэффициенты кофенетической корреляции R 0.9). К примеру, на деидрограмме (рис. 3), построенной на основе Dcs как мере различий, выделяются такие же кластеры, что и при использовании более сложной филетической процедуры кластеризации по Вагнеру (Рис. 4) или же при использовании стандартных Расстояний Нея и методики ближайшего соседства (NJ). При использовании этих подходов выявляются два кластера: 1) М. trossulus / М. galloprovincialis и 2) С. coruscus / P. californianus / С. grayanus, которые соединяются далее между собой, формируя третий самостоятельный кластер
