Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1.1. Эпидемиология синдрома Марфана И
1.2. Клинические особенности синдрома Марфана 13
1.3. Молекулярно-генетическая основа синдрома Марфана 19
1.3.1. Структура и функция белка фибриллина-1. 24
1.3.2. Структура и функция микрофибрилл 26
1.4. Патогенез синдрома Марфана 28
1.5. Роль других генов в клинической картине заболевания. 33
1.6. Молекулярно-генетическая диагностика синдрома Марфана 37
Глава II. Материал и методы 42
II. 1. Материал исследования 42
П.2. Методы исследования . 42
П.2.1. Выделение геномной ДНК 42
11.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 43
И.2.2.1. Исследование гена фибриллина-1 43
П.2.2.2. Исследование гена метилентетрагидрофолатедуктазы 45
П.2.2.3. Анализ полиморфных ДНК локусов 46
11.2.3. Рестрикционный анализ 48
11.2.4. SSCP-анализ 48
И.2.4.1. SSCP с щелочной денатурацией 48
П.2.5. Определение нуклеотидной последовательности 49
П.З. Статистическая обработка результатов 49
Глава III. Результаты исследования и обсуждение 52
III. 1. Эпидемиологическое исследование синдрома Марфана в Республике Башкортостан 52
Ш.2. Поиск мутаций и полиморфизмов в гене фибриллина-1 у больных синдромом Марфана 58
Ш.З. Анализ полиморфных ДНК-локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4 гена фибриллина-1 у больных синдромом Марфана и в контрольной группе 85
111:3.1. Анализ полиморфных ДНК-локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4 гена фибриллина-1 в контрольной группе 86
Ш.З. 1.1 Исследование полиморфного локуса MTS-1 86 Ш.З. 1.2. Исследование полиморфного локуса A/IS^ 90 Ш.З. 1.3. Исследование полиморфного локуса MTS-4 95
Ш.З.2. Анализ полиморфных ДНК-локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4
гена фибриллина-1 у больных синдромом Марфана. 100
Ш.3.3. Анализ гаплотипов полиморфных локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4 гена фибриллина-1 в контрольной группе ПО
Ш.4. Анализ полиморфных ДНК-локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4 гена фибриллина-1 в семьях больных синдромом Марфана 113
III.5. Анализ гаплотипов полиморфных локусов на нормальных и мутантных хромосомах у больных синдромом Марфана 119
Ш.6. Практическое применение анализа гаплотипов в семьях с синдромом Марфана 124
Ш.7. Исследование полиморфизма 677С>Т гена метилентетрагидро- фолатредуктазы {MTHFR) у больных синдромом Марфана 127
Заключение 135
Выводы . 138
Список литературы
- Эпидемиология синдрома Марфана
- Молекулярно-генетическая основа синдрома Марфана
- Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК
- Эпидемиологическое исследование синдрома Марфана в Республике Башкортостан
Введение к работе
Актуальность проблемы
Синдром Марфана (СМ) - тяжелое наследственное системное заболевание соединительной ткани, с выраженными патологическими нарушениями в скелетной, глазной и сердечно-сосудистой системах, наследуемое по аутосомно-доминантному типу (МІМ 154700). Частота встречаемости СМ в различных странах мира составляет 1:5000 - 1:10 000 [Pyeritz, McKusick, 1979; Pyeritz et al., 2000]. Для CM характерными особенностями являются высокий процент спорадических случаев (25-30%), которые обуславливаются мутациями de novo, варьирующая экспрессивность и неполная пенетрантность [Pyeritz, McKusick et al., 1979; Collod-Beroud et al., 2003]. В настоящее время в качестве основной причины заболевания рассматриваются мутации в гене фибриллина-1 (FBN1) (Human Genome Sequencing Project NT 034890) [Bayers et., 2004; Boileau et al., 2005], локализованного на длинном плече 15 хромосомы (15q 15-21) [Kainulainen et al, 1990; Dietz et al., 1991]. Ген FBN1 кодирует белок фибриллин-1 (ОМІМ 134797), являющийся основным компонентом межклеточного вещества. За более чем десятилетний период изучения гена FBN1 удалось выявить более пятисот различных мутаций по всему гену, большая часть из которых является миссенс-мутациями, затрагивающими высоко консервативные аминокислотные остатки, участвующие в процессах связывания кальция и формирования вторичной структуры белка фибриллина-1 [Collod-Beroud et al., 2003; Boileau et al., 2005]. В результате точечных замен возникают либо сайты для протеолитических ферментов и белок подвергается ферментативному гидролизу, либо изменяется конформационная структура [Downing et al., 1996; Reinhardt et al., 1997; McGettrick et al., 2000], что выражается в уменьшении количества нормального белка фибриллина-1 в межлеточном веществе соединительной ткани и, как следствие, теряется упругость и прочность стенок кровеносных сосудов, кожных покровов, хрящевых связок [Rantamaki et al., 1997; Robinson et al., 2000, Nollen et al., 2004].
Однако, несмотря на значительный прогресс, достигнутый в понимании молекулярно-генетических основ со времен открытия гена FBN1, остается еще открытым ряд ключевых вопросов, касающихся патогенеза этого заболевания. Многими исследователями отмечаются значительные трудности в сопоставлении данных молекулярно-генетического анализа с клинической картиной CM [Kainulainen et al., 1990; Black et al., 1998; Collod-Beroud et al., 2002]. Также установлено, что повреждения в гене фибриллина-1 приводят не только к развитию синдрома Марфана, но и являются причиной других заболеваний соединительной ткани, имеющих схожие клинические признаки с CM [Dietz et al., 1992; Lonqvist et al., 1994; Sood et al.,1996; Writz et al., 1996]. В ' последнее время все больше появляется исследований, показывающих участие других генов в патогенетических процессах синдрома Марфана [Guisti et al., 2003; Mizuguchi, Collod-Beroud et al., 2004], что, наряду с высоким клиническим полиморфизмом и плейотропным характером патологических нарушений, свидетельствует о гетерогенной природе заболевания.
Таким образом, инвалидизирующее течение, значительный клинический полиморфизм СМ, наличие схожих по клиническим признакам заболеваний, высокий риск повторного заболевания в семье и отсутствие терапевтических методов лечения делают наиболее актуальным проведение профилактических мероприятий, направленных на предотвращение возникновения повторных случаев заболевания в отягощенных семьях. Эффективное медико-генетическое консультирование в значительной мере зависит от результатов молекулярно-генетических исследований, направленных на выявление первичного генетического дефекта заболевания, что позволяет провести дифференциальную, пресимптоматическую и пренатальную диагностику синдрома Марфана.
Эпидемиология синдрома Марфана
Принято считать, что распространенность синдрома Марфана не зависит от каких либо расовых и этнических особенностей [Pyeritz and McKusick et al., 1979; Gray et al., 1994; Pyrietz et al., 2000;]. Однако на сегодняшний день существуют лишь разрозненные данные по изучению эпидемиологии синдрома Марфана в различных популяциях мира. По данным европейской организации по редким заболеваниям (European Organization for Rare Diseases) распространенность синдрома Марфана в Европе составляет 30 на 100 000 населения (www.orpha.net). В Соединенных Штатах Америки распространенность составляет 20:100 000 населения или 54 400 (0,02% от всего населения США) (US Census Bureau, Population Estimates, 2004). В 2004 году Сильвией де Би с коллегами была проведена работа по анкетированию больных синдром Марфана из семи стран Центральной Европы общей численностью 857 человек. По этим данным удалось приблизительно подсчитать распространенность в некоторых странах (табл. 1):
Авторами были изучены также некоторые эпидемиологические аспекты заболевания. В частности, показано, что средний возраст больных составил 21,6 лет, что подтверждает раннюю манифестацию заболевания. До этого времени синдром Марфана диагностировался в основном во взрослом состоянии (-30 лет). Количество мужчин больных в изученных популяциях было ниже (44,7%), чем число женщин (55,3%, р 0,05). В группе больных младше 25 лет насчитывалось больше мужчин (59,9%), чем женщин (р 0,01), в то время как в группе больных старше 25 лет женщин насчитывалось 39,2%. Только 495 (58%) из обследованных больных имели по крайней мере одного родственника с синдромом Марфана, что подтверждает высокий процент спорадических случаев. Было обнаружено также, что возраст больных (р 0,001) и возраст манифестации (р 0,001) значительно ниже у больных со спорадической формой заболевания по сравнению с больными аутосомно-доминантным типом наследования. В то же время существенной разницы между тяжестью заболевания в спорадических и семейных случаях обнаружено не было [De Віє et al., 2004]. Таким образом, несмотря на малое количество работ, посвященных эпидемиологическим характеристикам синдрома Марфана, прослеживаются определенные корреляции между полом, возрастом больных и началом проявления первых клинических признаков (возраст манифестации).
Многообразие и сложность морфологии и функций соединительной ткани обеспечивают активное участие основных ее элементов в развитии многих видов патологии. Клинико-морфологические нарушения при наследственных заболеваниях соединительной ткани свидетельствуют о системности поражения, поскольку соединительная ткань, составляет строму всех органов и тканей [Кадурина, 2000]. Генетически обусловленные нарушения основных компонентов соединительной ткани вызывают снижение ее стабильности и ведут к возникновению клинических нарушений органов и тканей, в которых нормальное развитие соединительное ткани имеет важное значение [Яковлев, 1994]. В настоящее время, группу заболеваний с врожденной патологией соединительной ткани обозначают термином "дисплазия" [Котовская, 1993]. Выделяют две группы дисплазий: системные наследственные синдромы, такие как синдром Марфана, синдром Элерса-Данлоса и наследственные заболевания соединительной ткани с висцеральными проявлениями, куда входят дисплазий соединительные ткани сердца, варикозная болезнь вен нижних конечностей, миопия и др. [Яковлев, 1990]. Морфологические изменения в тканях и органах неспецифичны, а их проявления сходны при различных дисплазиях. Они обнаруживаются уже в антенатальном и прогрессивно развиваются в последующих периодах жизни организма [Кадурина, 2000].
Средняя продолжительность жизни больных синдромом Марфана до недавнего времени составляла в среднем 30 лет. Успешное проведение операций на сердечно-сосудистой системе и внедрение в клиническую терапию Р-блокаторов, уменьшающих систолическое давление, увеличило продолжительность жизни до 47 лет в 1972 году и до 61 года в 1995 году [Beighton et al., 1986; Silverman et al., 1995; Nollen et al., 2004].
Дефект соединительной ткани при синдроме Марфана носит генерализованный характер и затрагивает многие системы органов. Для больных с синдромом Марфана характерны поражения сердца и крупных сосудов, причем чаще всего обнаруживаются расширение восходящей дуги аорты (реже грудного или брюшного отдела) с развитием расслаивающейся аневризмы [Roman et al., 1993; Козлова, 1996], врожденная недостаточность клапанов сердца, пролапс митрального клапана [Pyeritz, 1993]. Факторами риска расслоения аорты являются нарастающий диаметр аорты, увеличивающаяся протяженность дилатации аорты, выраженная дилатация и накопление случаев расслоения аорты в семье [Shores et al, 1994; Kaemmerer et al., 2005]. Многими исследователями отмечены различные аномалии строения и функции опорно-двигательного аппарата у больных с синдромом Марфана: воронкообразная или килевидная деформация грудной клетки, реберный горб, удлинение ребер, широкие межреберные промежутки, гипермобильность суставов, плоскостопие, сколиоз, высокий рост и длинные тонкие конечности, особенно в дистальных отделах [Козлова, 1996].
Молекулярно-генетическая основа синдрома Марфана
На сегодняшний день большинство исследователей склоняются к тому, что основной причиной развития синдрома Марфана являются мутации в гене фибриллина-1 (FBN1).
Ген FBN1 - это большой комплексный ген (Human Genome Sequencing Project NT 034890), протяженностью в 200 килобаз и содержащий 65 экзонов [Lee et al., 1991]. мРНК транскрипт имеет протяженность в 10 кЬ и кодирует 2781 аминокислоту [Lee et al., 1991].
К 2003 году в гене FBN1 обнаружено свыше 500 мутаций [Collod-Beroud, 2003]. Кроме четырех описанных случаев делеций нескольких экзонов, каких-либо крупных нарушений в гене не зафиксировано [Kainulainen et al., 1992; Liu et al., 2001; Loeys et al., 2004].
Мутации обнаружены практически во всех экзонах гена FBN1. По не ясным пока причинам, большинство мутаций представлены в единичных случаях. Все обнаруженные мутации подразделяют на три группы: 1) миссенс-мутации, затрагивающие многочисленные кальций связывающие домены (cbEGF-подобные домены), разбросанные по всему белку; 2) небольшие инсерции или делеций, вызывающие преждевременную терминацию процесса трансляции и 3) сплайсинговые мутации.
Самая большая группа мутаций представлена миссенс мутациями, следствием которых является замена одной аминокислоты на другую. Половина из них приводит к замене цистеина, что, в свою очередь, обуславливает разрыв одного из трех дисульфидных мостиков в cbEGF-домене. Мутации, затрагивающие кальций связывающие последовательности в доменах, приводят к нарушениям в структурной организации микрофибрилл путем снижения чувствительности к кальцию [Hanford et al., 1995]. Другая половина миссенс мутаций приходится на замены глицина в cbEGF-доменах, что, как предполагают, вызывает нарушения в процессе скрепления двух последовательных доменов. Существует также еще одна группа мутаций, не вызывающих очевидных изменений в cbEGF-доменах, но, предположительно, затрагивающие белок-белковые взаимодействия [Downing et al., 1996].
Около одной трети мутаций приводят к укорочению пептида профибриллина-1. Это небольшие делении, нонсенс мутации и сплайсинговые мутации [Collod-Beroud et al., 1997].
Мутации в гене FBN1 характерны не только для больных с классической и атипичной формой синдрома Марфана, но и для целой серии родственных заболеваний соединительной ткани, названных фибриллинопатией первого типа: неонатальная форма синдрома Марфана, доминантно наследуемый подвывих хрусталика [Kainulainen et al., 1994], изолированные скелетные аномалии синдрома Марфана [Milewicz et al., 1995], синдром Шпринтпена-Колдберга [Sood et al., 1996] и изолированные формы аневризмы аорты [Milewicz et al., 1996] (табл.3).
Неонатальная форма синдрома Марфана (нСМ) является самой тяжелой формой синдрома Марфана. У больных новорожденных детей обнаруживается обратное открывание сердечного клапана и дилатация проксимальной части аорты, которая ведет к серьезным сердечным осложнениям и, как правило, к смерти на первом году жизни [Robinson, 2000]. Для больных нСМ также характерны скелетные нарушения в виде арахнодактилии, долихостеномилии и деформации грудной клетки. Изучение семейных случаев нСМ показало, что большинство из них являются спорадическими [Buntinx et al., 1991]. Долгое время считалось, что нСМ является следствием мутаций не гена фибриллина-1, а другого гена, так как наблюдаемые симптомы отличались от классической формы синдрома Марфана и были схожи с врожденной суставной арахнодактилией. Но в 1995 году Годфрей с коллегами обнаружили аномальную морфологию фибриллин содержащих микрофибрилл в культуре фибробластов больных нСМ [Godfrey et al., 1995].
Позже было выявлено, что неонатальная форма синдрома Марфана также вызывается мутациями в гене FBN1, в частности, в 24-32 экзонах [Booms et al., 1999; Tieckeetal., 2001].
Изолированный подвывих хрусталика наследуется по аутосомно-доминантному пути. При этом заболевании наблюдается двусторонний подвывих хрусталика без сердечно-сосудистых осложнений, характерных для синдрома Марфана [Edwards et al., 1994]. Есть сведения о нескольких мутаций в гене FBN1, приводящих к данной патологии [Lonqvist et al., 1994, Comeglio et al., 2002].
Синдром Шпринтцена-Колдберга характеризуется краниосиностозом и марфаноидным телосложением с рядом признаков: высокий рост, арахнодактилия, долихостеномелия, деформация грудной клетки, сколиоз, гипермобильность суставов, умственная отсталость и, в редких случаях, дилатация основания аорты и пролапс митрального клапана [Greally et al., 1998]. Несмотря на то, что у больных этим синдромом обнаружены мутации в гене FBN1, остается пока не ясным, действительно ли мутации в гене фибриллина ответственны за развитие данной патологии, или же они просто дополняют клиническую картину заболевания наравне с каким-то другим геном [Robinson, 2000].
При патологии восходящей аорты была также обнаружена мутация (G1127S в 27 экзоне) в гене FBN1. Никто из больных не имел типичных симптомов синдрома Марфана. Хотя в 27 экзоне находится cbEGF-подобная область, мутация G1127S не влияет на связывание кальция [Francke et al., 1995].
При классической форме синдрома Марфана существует внутрисемейная изменчивость, и клинический статус родственников, несущих одинаковые мутации, может значительно варьировать в зависимости от возраста манифестации, вовлечения разных систем органов и тяжести заболевания. Это наталкивает на мысль, что между клинической тяжестью и мутантным аллелем нет строгой закономерности.
Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК
Анализ генов фибриллина-1 (FBN1) и метилентетрагидрофолптредуктазы (MTHFR), а также анализ полиморфных локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4, проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводилась на амплификаторе "Терцик" производства компании «ДНК-технология» с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс».
. Исследование гена фибриллина-1. Для амплификации экзонов гена FBN1 были использованы праймеры, предложенные рядом авторов (табл.7). Реакция была выполнена в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 25 мМ Tris-HCl, рН 8.4, 50 мМ КО, 1,5 мМ MgCb, 0.2 мМ каждого dNTP, по 5 пМ каждого из праймеров, 10-20 нг тотальной ДНК и 0,5 единицы Taq ДНК-полимеразы.
Для определения полиморфизма С677Т гена MTHFR в выборке больных синдромом Марфана, а также в контрольной выборке здоровых индивидов использовали рестрикционный анализ. В качестве фермента рестрикции использовали фермент Hinfi. После амплификации 10 мкл амплификата обрабатывали 5 единицами рестриктазы Hinfi в течение 12 часов при 37С. Результаты рестрикционного анализа оценивали при проведении электрофореза в 7% ПААГ с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализации под ультрафиолетовыми лучами.
Исследование образцов ДНК на наличие мутаций и полиморфизмов проводили методом анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP - single strand conformation polymorphism), основанным на различной электрофоретической подвижности однонитевых фрагментов ДНК, различающихся вследствие нуклеотидных замен по конформации молекул, в неденатурирующем полиакриламидном геле (Orita et al., 1989).
Каждый индивидуальный экзон амплифицировали с помощью специфических праймеров, фланкирующих изучаемый экзон (табл.7). SSCP-анализ проводили щелочной денатурацией. SSCP-анализ с щелочной денатурацией. После проведения ПЦР 10 мкл амплификата смешивали с 3,3 мкл 0,5 М NaOH и 0,3 мкл 0,5М ЭДТА и нагревали в течение 15 минут при 42С. После этого к пробам добавляли 3 мкл формамида, смешанного с 0,5% бромфенолового синего и 0,5% ксиленцианола, и наносили на 10% полиакриламидный гель (исходное соотношение акриламида/метиленбисакри-ламида 29:1) с 5% глицерином. В качестве электрофорезного буфера использовали 0,5 ТВЕ. Электрофорез геля длиной 20 см, толщиной 1 мм проходил при комнатной температуре при напряжении 100В в течение 20-30 часов. Окраску геля проводили в течение 15 минут азотно-кислым серебром.
Далее гель промывали дистиллированной водой и опускали в раствор, содержащий 40% формалин и NaOH. После проявления гель промывали дистиллированной водой.
Подготовка матриц для секвенирования включала очистку ПЦР продуктов от избытка праймеров, димеров праймеров и дезоксирибонуклеотидов (dNTP). Очистку осуществляли путем элюции ДНК из агарозных гелей с последующим использованием набора реагентов DIAtomtmDNA Elution по методике описанной в инструкции.
Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism модель 310 (Applied Biosystems) с использованием набора для флюоресцентного мечения DYEnamicET согласно протоколу фирмы производителя [Amersham Pharmacia Biotech DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit].
Эпидемиологическое исследование синдрома Марфана в Республике Башкортостан
В настоящее время очень мало данных по частоте и характеру распространенности синдрома Марфана (СМ) в мире, об этнических и территориальных особенностях заболевания. В связи с этим мы провели анализ всех зарегистрированных случаев СМ в Республике Башкортостан (РБ) по данным медико-генетической консультации (1981-2005).
В Республике Башкортостан выявлены и состоят на учете в Медико-генетической консультации 105 больных синдромом Марфана из 96 семей.
На рисунке 4 показана распространенность синдрома Марфана в Республике Башкортостан. На сегодняшний день распространенность заболевания в республике составляет 2,55 на 100 000 населения. Характер распространения заболевания на территории республики оказался неравномерным. Заболевание зарегистрировано в 18 из 54 административных районов и в 11 из 21 города республики. Распространенность СМ в отдельных районах колеблется от 0,99 до 9,20 на 100 000 населения. В среднем показатель распространенности СМ в РБ составил 3,67±2,32 (табл. 11).
В целом, 83,80% больных являются жителями городов и только 16,20% представлено сельским населением. Поскольку доля городского населения республики от общей численности населения составляет только 64%, то мы проверили случайность распределения больных по месту жительства с использованием критерия хи-квадрат. Согласно полученным результатам в городах проживает достоверно больше больных, нежели в сельской местности (%2=17,79, df=l, р«0,00001). Подобная закономерность может объясняться более высоким уровнем диагностики заболевания в городах РБ.
Исходя из полученных выше данных, можно сделать вывод о возможном существовании взаимосвязи между частотой заболеваемости СМ и экологически неблагоприятным фоном окружающей среды, последний фактор объясняет 25,47% вариабельности частоты СМ в республике.
Половой состав больных распределился следующим образом: 43 больных мужского пола, что составляет 40,95% от общего числа больных и 62 (59,05%) больных женского пола. Поскольку среди населения Республики Башкортостан (по данным переписи населения 2002 года: http://www.bashstat.ru/Docs/Itogi/pril2.shtm) отмечается численный перевес женщин над мужчинами, мы провели статистический анализ, позволяющий оценить случайность обнаруженной половой структуры среди больных СМ. Различия в распределении пола не достигли статистической значимости (X2=l,50,dfM,p=0,2206).
Средней возраст больных на момент постановки диагноза составил 13,4 лет, что ниже, чем в .ряде европейских стран, где средний возраст манифестации составил 21,6 лет [De Bei et al., 2004]. Разный возраст манифестации, по-видимому, связан с разным подходом к постановке диагноза. В связи с тем, что некоторые клинические признаки могут прогрессировать по мере роста организма [Shores et al., 1994], то в европейских странах диагноз, преимущественно, ставится, после того как сформируются все основные диагностические признаки [De Bei et al., 2004]. В то время как в Республике Башкортостан клинический диагноз "синдром Марфана" ставится при наличии одного главного признака в двух системах и одного малого в третьей, что также согласуется с Джентовскими критериями постановки диагноза [DePaepe et al., 1996].
Число спорадических случаев синдрома Марфана в Республике Башкортостан составило 30,3%, что подтверждает высокий процент возникновения мутаций de novo [Pyeritz and McCusick, 1979; Collod-Beroud et al., 2003].
