Введение к работе
Актуальность проблемы
Множественная миелома (ММ) - злокачественное новообразование из плазматических клеток, которые являются конечным продуктом дифференцировки В-клеток и в норме обычно продуцируют антитела (Абдулкадыров 2004). В странах Запада ММ - причина приблизительно 1% всех смертей, связанных с онкологией (Bataille et al., 1994).
Существенную роль в терапии ММ играет аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК). Ряд исследований показал, что пациенты, достигшие полной клинической ремиссии (ПР) после алло-ТГСК, характеризуются длительной выживаемостью (Martinez-Lopez et al. 2007). При применении алло-ТГСК после стандартной миелоаблативной подготовки и после подготовки по щадящим схемам достигается высокий уровень ПР, варьирующий в пределах 27% - 81% (Bensinger et al., 1996; Gahrton et al. 2001; Garban et al. 2006; Kroger et al. 2002; Kroger et al. 2003; Maloney et al. 2003; Bruno et al 2007). Около 50% пациентов с ПР после стандартной миелоаблативной алло-ТГСК достигают молекулярной ремиссии (MP) (Corradini at al. 1999; Martinelli et al. 2000), которая ассоциирована с очень низким риском рецидива (Corradini et al. 2003). Таким образом, для улучшения результатов алло-ТГСК требуется достижение ПР и, в особенности, MP. Одним из способов достижения ПР является проведение посттрансплантационной терапии. Самой распространенной адоптивной терапией после алло-ТГСК является инфузия донорских лимфоцитов (ИДЛ) (Kroger et al., 2009).
Для определения статуса MP и мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ) используется полимеразная цепная реакция (ПЦР) с количественной (в режиме "реального времени") и качественной оценкой опухоль-специфичной последовательности ДНК или РНК. Самым чувствительным, на сегодняшний день, является качественный ПЦР анализ. Именно с его появлением, наряду с термином «клиническая ремиссия» появилось понятие «молекулярная ремиссия» (Rasmussen et al., 2004; Corradini et. al., 1999; Corradini et al., 1997). Наиболее универсальной мишенью для молекулярной диагностики МОБ у больных ММ служит VDJ перестройка гена тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) (Lokhorst et al., 2002). Неповторимый для каждого пациента характер перестройки гена IgH определяет необходимость разработки эффективной методики подбора индивидуальных тест-систем.
Разработка методики важна и для стандартизации процедуры молекулярного мониторинга МОБ у больных ММ, что необходимо для сопоставления результатов терапии, полученных в различных клиниках. Следует отметить, что при проведении молекулярного мониторинга МОБ у больных ММ после алло-ТГСК не учитываются особенности аллогенной трансплантации и инфузий донорских лимфоцитов, которые могут повлиять на эффективность молекулярного мониторинга.
Важной проблемой при организации молекулярного мониторинга у больных ММ после алло-ТГСК служит отсутствие диагностических образцов костного мозга (КМ). Как правило, аллогенные трансплантации проводятся в специализированных центрах, куда пациенты поступают после определенной терапии, приводящей к снижению опухолевой массы в КМ. В лучшем случае, для этих пациентов имеются образцы в виде цитологических препаратов КМ, полученных до начала терапии. Это не позволяет использовать для разработки тест-систем методики, основанные на обратно-транскриптазной ПЦР, материалом для которой служит тотальная РНК (Жеребцова, 2008).
Все это и обусловило актуальность данного исследования.
Цель исследования
Разработать и апробировать в клинических условиях методики молекулярно-генетического мониторинга минимальной остаточной болезни после алло-ТГСК у больных множественной миеломой.
Задачи исследования
-
Разработать алгоритм подбора индивидуальных опухоль-специфичных тест-систем на основе клональной VDJ-перестройки гена тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) для мониторинга МОБ у больных ММ.
-
Апробировать в клинических условиях и сравнить эффективность различных методик молекулярно-генетического мониторинга МОБ ММ, основанных на анализе опухоль-специфичной VDJ-перестройки гена тяжелой цепи иммуноглобулина (количественный ПЦР-анализ в режиме "реального времени" и качественный ПЦР-анализ).
3. Выявить особенности использования разработанных тест-систем при
молекулярной диагностике МОБ у больных ММ после проведения алло-
ТГСК и инфузий донорских лимфоцитов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. VDJ-перестройка гена IgH является стабильным маркером МОБ после
проведения алло-ТГСК у больных ММ. Комплексирование качественного и
количественного методов молекулярного анализа данного маркера
обеспечивает надежный контроль эффективности терапии больных ММ при
проведении алло-ТГСК и позволяет оперативно принимать терапевтические
меры при превышении уровня молекулярной ремиссии.
-
Молекулярная диагностика клональнои VDJ-перестройки гена тяжелой цепи иммуноглобулина обладает более высокой, по сравнению со стандартными методами анализа, чувствительностью при выявлении опухолевых клеток при ММ. Обогащение исследуемого материала при помощи селекции CD138+ клеток на аппарате MACS позволяет повысить чувствительность используемых тест-систем при молекулярной диагностике МОБ у больных ММ.
-
В случае применения алло-ТГСК и ИДЛ диагностика МОБ путем детекции опухоль-специфичной перестройки гена тяжелой цепи иммуноглобулина должна проводиться не ранее окончания периода регенерации КМ.
Научная новизна
Впервые разработан снижающий трудоемкость анализа алгоритм индивидуального подбора опухоль-специфичных тест-систем для молекулярного мониторинга МОБ ММ. Достоинством алгоритма является четко структурированная последовательность операций, условия выполнения которых оптимизированы с целью повышения чувствительности и специфичности анализа. Данный алгоритм, основанный на анализе ДНК, позволяет с минимальными затратами времени и материалов подобрать индивидуальную опухоль-специфичную тест-систему с использованием не только свежего диагностического материала, но и архивного, что имеет высокую практическую значимость.
Впервые для подбора специфичных тест-систем при мониторинге МОБ ММ обоснована необходимость сравнения нуклеотидной последовательности клональнои опухолевой перестройки гена IgH с рекомбинированными генами IgH.
Показано, что специфичность тест-систем для качественного анализа («nested» ПЦР), подобранных до начала алло-ТГСК, при мониторинге МОБ ММ сохраняется в течение не менее чем 4,5 лет.
Впервые проведен молекулярно-генетический мониторинг МОБ у пациентов, получивших терапию с применением ауто-алло тандемного подхода, адоптивной терапии малыми дозами талидомида и ИДЛ. Аллогенная ТГСК проводилась со сниженной интенсивностью кондиционирования: флударабин (150 мг/м2), мелфалан (140 мг/м2), и анти-тимоцитарный глобулин (ATG: 3 х 10-20 мг/кг) три месяца спустя после циторедуктивной ауто-ТГСК (мелфалан 200 мг/м2).
Практическая значимость
Внедрение результатов исследования в клиническую практику позволит повысить эффективность диагностики МОБ у больных ММ, что способствует своевременному принятию терапевтических мер по снижению риска рецидива заболевания.
Разработанный алгоритм может быть использован для сравнения режимов кондиционирования, для оценки эффективности иммуномодулирующей терапии, например, инфузий донорских лимфоцитов.
Апробация материалов диссертации
Результаты исследования представлены на 30, 31 и 32 Ежегодных симпозиумах ЕВМТ (г. Барселона, Испания, 2004; г. Прага, Чехия, 2005; г. Гамбург, Германия 2006), на XVI съезде Wilsede «Modern Trends in Human Leukemias XVI», 2005 г. (г. Гамбург, Германия), конференции «Биотехнология и Онкология», 2005 г. (Санкт-Петербург), на 46-ой и 47-ой ежегодных конференциях Американского гематологического общества (The American Society of Hematology Annual Meeting and Exposition), 2004 г., 2005 г.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты настоящего исследования используются в Институте детской гематологии и трансплантологии им. P.M. Горбачевой ГОУ ВПО СПбГМУ им. академика И.П. Павлова (г. Санкт-Петербург) и в Центре трансплантации костного мозга Университетской клиники Эппендорф, г. Гамбург (Германия) для
мониторига МОБ у больных ММ, а также в качестве эталона при разработке других методов анализа (Lioznov et al., 2008; Kroger et al., 2009).
Установленные в работе факты могут быть использованы в лекционных курсах ВУЗов медицинского и биологического профиля, а также в соответствующих учебниках, методических пособиях и руководствах.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них - 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации:
Материалы диссертации изложены в одной книге на 137 страницах текста, содержат 21 таблицу и 19 рисунков. Список использованных источников включает в себя 10 работ отечественных и 126 работ зарубежных авторов. Диссертация состоит из: - 4 частей, в которых изложены результаты собственных исследований; - заключения, включающего и практические рекомендации; - выводов; - списка использованных источников.
Личный вклад автора
Разработка дизайна всех исследований, первичная обработка части клинического материала, все этапы молекулярного мониторинга, разработка методик, обобщение полученных результатов проведены автором самостоятельно. Изложение всех разделов диссертации, оформление работы выполнены соискателем.
