Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Разнообразие антигенных маркеров клеток 13
1.1.1. Понятие CD - антигенов и их значение в гематологии 13
1.1.2. Классификация CD — антигенов и роль некоторых из них в биологических процессах 15
1.2. Основные аспекты жизнедеятельности-нормальной и опухолевой клетки 25
1.2.1. Адгезия 25
1.2.2. Пролиферация 29
1.2.3. Аноптоз 30
1.3. CD — антигены и хронический лимфоцитарный лейкоз 32
1.4. Методы определения CD - антигенов (иммунофенотипирования) 41
Глава 2. Материал и методы исследования 51
2.1. Клиническая характеристика обследованных больных 51
2.2. Методы обследования и лечения 55
2.3. Иммунофенотипирование клеток крови с помощью иммунологических биочипов 57
2.4. Статистическая обработка материала 62
Глава 3. Результаты собственных исследований 63
3.1. Клинические аспекты использования иммунологических биочипов в диагностике хронического лимфоцитарного лейкоза 63
3.2. Иммунофенотип лимфоцитов и возрастно — половой состав пациентов при хроническом лимфоцитарном лейкозе 74
3.3. Прогностические факторы хронического лимфоцитарного лейкоза 78
3.3.1. Содержание популяций лейкемических клеток в разных клинических стадиях хронического лимфоцитарного лейкоза 78
3.3.2. Характеристика популяций лейкемических клеток в различных клинических формах хронического лимфоцитарного лейкоза 82
3.3.3. Время удвоения абсолютного количества лимфоцитов периферической крови и их антигенная характеристика 85
3.3.4. Ассоциации содержания CD38 — позитивных лимфоцитов и других иммунологических популяций опухолевых клеток при хроническом лимфоцитарном лейкозе 90
3.4. Опухолевая масса и ее распределение в организме при хроническом лимфоцитарном лейкозе 92
3.5. Иммунологические популяции лимфоцитов периферической крови в процессе химиотерапии хронического лимфоцитарного лейкоза 114
Заключение 123
Выводы 140
Практические рекомендации 141
- Основные аспекты жизнедеятельности-нормальной и опухолевой клетки
- CD — антигены и хронический лимфоцитарный лейкоз
- Иммунофенотипирование клеток крови с помощью иммунологических биочипов
- Иммунофенотип лимфоцитов и возрастно — половой состав пациентов при хроническом лимфоцитарном лейкозе
Введение к работе
Актуальность проблемы
Хронический лимфоцитарпыи лейкоз (ХЛЛ) - одно из распространенных опухолевых заболеваний кроветворной ткани, которое крайне неоднородно по клиническому течению, лабораторным особенностям и ответу на специфическое лечение (А.И. Воробьев и соавт., 2003; Е.А. Никитин и соавт., 2003). Уровень заболеваемости ХЛЛ в Удмуртской Республике вырос с 1998 по 2008 годы. Кроме того, среднегодовой показатель заболеваемости ХЛЛ за 1989 - 1998 годы в Удмуртской Республике составляет 3,23±0,20 случаев среди мужчин и 2,21±0,31 случаев среди женщин на 100 000 населения и является достоверно более высоким, чем по РФ в целом (1,50±0,10 и 0,80±0,03 случаев на 100 000 населения соответственно, р<0,05) (Е.П Никитин и соавт., 2009). Существующие проіраммьі химиотерапии хотя и позволяют получать длительные ремиссии, но не у всех групп пациентов, и имеют сопутствующий риск осложнений (М.А. Волкова, 2007). В связи с этим остается актуальным поиск факторов прогноза ХЛЛ. Прогнозирование течения ХЛЛ включает оценку длительности периода без лечения, решение вопроса о сроках назначения и варианте терапии, возможный ответ па нее и общую выживаемость. Гетерогенность клинического течения заболевания, а также ряда молекулярных и хромосомных изменений не исключает возможности на основе этих признаков выделять определенные варианты ХЛЛ, при которых обнаруживаются клинически значимые корреляции, хотя, по - видимому, трудно найти молекулярные признаки, которые обнаруживались бы во всех случаях, тем более, что каждый фактор характеризует определенную степень вероятности прогноза. Выявление характера связи факторов риска между собой принципиально важно для установления не только их взаимодополняемости, но и взаимозаменяемости при доступности их исследования в клинико - лабораторной практике. Кроме того, подавляющее большинство прогностических факторов при ХЛЛ могут изменяться в ходе опухолевой прогрессии (А.И. Свирновский, 2008). Генетические аномалии, имеющие прогностическое значение, реализуются в структурно — функциональных изменениях протеинов, входящих в состав рецепторного комплекса мембраны опухолевой клетки, регулируя таким образом его экспрессию и активность (Д.Д. Уотсон и соавт., 1994).
На последнем 8-ом международном рабочем совещании по CD - антигенам (8' HLDA Workshop, Аделаида, Австралия, 2004) зарегистрировано свыше 400 антигенов, при этом число вновь открываемых антигенов, начиная с 1982 года, неуклонно растет. Предполагается, что общее количество мембранных молекул лейкоцитов может быть более 4 тысяч (П. Zola и соавт., 2005). Возможность идентификации большого числа антигенов,
~3~
экспрессируемых пеогшастическими клетками, позволит выделять новые варианты лейкозов и лимфом (L. Belov и соавт., 2006), а одновременное выявление широкого спектра прогностически значимых клеточных маркеров будет более достоверно характеризовать клинические свойства и поведение опухоли.
Иммунофенотип - это набор антигенов, экспрессируемый популяциями клеток данного
индивида (Н.Н. Тупиции и соавт., 2001). В настоящее время существует несколько
общепринятых методов установления иммунофенотипа опухолевой клетки при ХЛЛ:
проточная цитофлюориметрия, иммуноцито-(гисто)-химическое исследование,
иммунофлюоресцентное исследование, общей особенностью которых является определение ограниченного числа антигенов. Поэтому является весьма перспективным применение с целью диагностики ХЛЛ новых методов анализа, позволяющих расширить спектр одновременно исследуемых антигенов при сохранении доступности и простоты их применения в клинико - лабораторной практике. К таким методам относится иммуиофенотипирование клеток ХЛЛ с помощью иммунологических микроматриц (биочшюв), которое позволяет определять от 32 до 147 маркеров (R.I. Christopherson и соавт., 2001; А.В. Шишкин, А.И. Воробьев и соавт., 2008). Однако к настоящему времени данный метод не был широко апробирован в диагностике ХЛЛ и с целью выяснения прогностического значения некоторых антигенов опухолевых лимфоцитов.
Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования явились совершенствование иммунодиагностики и оценка эффективности лечения ХЛЛ с помощью иммунологических биочипов.
Задачи исследования 1.Оценить эффективность применения иммунологических биочипов для лабораторной
диагностики ХЛЛ. 2.Установить связь между числом опухолевых лимфоцитов, экспрессирующих ряд
изучаемых антигенов, и клинико - лабораторными особенностями ХЛЛ. 3.Оценить пролиферативный и адгезивный потенциалы лейкемических лимфоцитов при
ХЛЛ. 4.0ценитъ прогноз заболеваїшя на основании варианта иммунофенотипа лейкозных клеток
при ХЛЛ. 5.Дать иммунологическую оценку эффективности традиционной химиотерапии ХЛЛ. Научная новизна исследования
Впервые установлена эффективность использования оригинальных иммунологических биочипов с целью диагностики ХЛЛ в репрезентативной выборочной совокупности
~4~
)
пациентов и оценки остаточной опухолевой массы в процессе химиотерапии; проведена комплексная оценка популяций опухолевых лимфоцитов при ХЛЛ, анализируемых по большому набору CD - антигенов, в зависимости от клинических проявлений болезни; предложены дополнительные маркеры оценки пролиферативного и адгезивного потенциалов лейкемических клеток при XJIJI; предложена качественная модель распределения иммунологических популяций лейкозных лимфоцитов в организме.
Практическая ценность работы
Для практического здравоохранения предложен метод иммунодиагностики ХЛЛ с помощью иммунологических биочипов. Выделены клинически значимые антигены, которые могут рассматриваться как критерии прогноза течения ХЛЛ.
Доказана целесообразность использования иммунологических биочипов с целью индивидуальной оценки течения ХЛЛ, а также для определения остаточной опухолевой массы в процессе химиотерапии заболевания.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Иммунологические биочипы могут быть использованы для иммунодиагностики ХЛЛ.
-
Повышенное содержание лимфоцитов, позитивных по антигенам CD71, CD95, CD98, а также CD38, CD27, CD45RA, CD72, HLA - DR, свидетельствует о высоком иролиферативном потенциале опухолевых клеток ХЛЛ.
-
Антигены CD9, CDlla, CDllb, CD21, CD22, CD29, CD31, CD38, CD44 участвуют в распределении опухолевой массы при ХЛЛ.
-
Наиболее неблагоприятный вариант ХЛЛ характеризуется повышенным содержанием в периферической крови лимфоцитов, позитивных по антигенам CD38, CD71, CD95, CD98, CD9, а также CD45RA, CD72, CD27, HLA - DR, CD21, CD22, CD44.
Внедрение результатов работы в практику
Результаты диссертационного исследования внедрены в практическую деятельность врачей гематологического отделения и клинической лаборатории ГУЗ «1-ая Республиканская клиническая больница» МЗ УР, в работу автономной некоммерческой организации «Центр наношщустрии УР», учебно - экспериментальной лаборатории, центра трансфера технологий ГОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия Росздрава» и в учебный процесс кафедры факультетской терапии с курсами эндокринологии и гематологии ГОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия Росздрава».
Апробация работы
Основные результаты исследования были доложены на научно - практической конференции врачей - гематологов (Ижевск, 2008), на научно - практической конференции
~5~
«Современные методы диагностики и лечения злокачественных опухолей» (Ижевск, 2008), на 12-ой Международной Путинской школе - конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2008), Всероссийской научной конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии» (Москва, 2008), на И Российском форуме «Российким инновациям - российский капитал» (Саранск, 2009), на объединенном заседании кафедр факультетской терапии с курсами эндокринологии и гематологии, пропедевтики внутренних болезней с курсом сестринского дела, вігутрешіих болезней с курсами лучевых методов диагностики, лечения и ВПТ, на проблемной комиссии по внутренним болезням с вопросами нефрологии, эндокринологии, гематологии и курортологии с физиотерапией ГОУ ВПО «Ижевская государствешіая медицинская академия» (Ижевск, 2009).
Личный вклад автора в выполнение научной работы
Автором лично проведено клиническое обследование и наблюдение пациентов с ХЛЛ в условиях стационара и поликлиники. Выполнена подготовка образцов крови и самостоятельно проведено иммунофенотипирование клеток пациентов с помощью иммунологических биочипов. Автором работы осуществлена оценка результатов исследования, анализ и статистическая обработка данных 75 пациентов, страдающих ХЛЛ. Автор принимала участие в разработке иммунологических биочипов.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 2 работы в рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией (ВАК), и 1 патент на полезную модель (пат. № 87165).
Объем и структура диссертации
Основные аспекты жизнедеятельности-нормальной и опухолевой клетки
Адгезия — это свойство клеток прикрепляться к субстрату, вступать в контактные взаимодействия с клетками, веществами в составе соединительной ткани, а также искусственно синтезированными соединениями (стекло, пластик и др.). Специфическая адгезия клетки осуществляется благодаря молекулам клеточной адгезии, которые первоначально связываются с субстратом с относительно низким сродством. Действие их основано на многократном увеличении силы связи за счет одновременного соединения многих рецепторов со многими лигандами, а также кластеризации рецепторов на мембране. У разных типов клеток имеется определенный уникальный спектр рецепторов адгезии, который также обусловливает сродство связи. Адгезия играет важную роль в жизни клетки. Во — первых, благодаря способности избирательно прикрепляться, бесформенное множество клеток образует в пространстве структурированную ткань и орган. Во - вторых, ослабление связей способствует началу миграции клетки, что, например, является важным звеном эмбриогенеза, а асимметрия в адгезии к субстрату разных участков клеточной мембраны способствует передвижению клетки. В - третьих, уникальный репертуар адгезивных молекул определяет направление миграции клетки, помогает ей найти «свою» ткань. Подвижные клетки являются чувствительными детекторами малых различий в адгезивности (например, клетки крови). Выпячивания участков мембраны, на которых расположены рецепторы адгезии, участвуют в перетягивании клетки, в результате которого клетка движется в направлении наиболее адгезивной части субстрата, даже если различия в адгезивности очень малы [2]. Адгезия является начальным этапом активации клетки, в основе которого лежит передача сигнала через цитоплазматическии домен рецептора адгезии к компонентам цитоскелета путем активации тирозинкиназ. Конечные продукты киназных каскадов переходят из цитоплазмы в ядро, где они фосфорилируют и активируют транскрипционные факторы - ядерные белки, которые связываются с определенными генами и стимулируют их экспрессию. Следствием этого является экспрессия многих специфических генов, включая гены, побуждающие клетку, например, к делению. Предполагается, что рецепторы адгезии опосредуют функциональные изменения в клетках не только под действием биохимических, но и механических стимулов, и рассматриваются поэтому как транедукторы механических сигналов от внеклеточного матрикса. Возможно, что деформации в матриксе, вызванные механическими воздействиями, изменяют конформацию внеклеточных доменов рецепторов адгезии (например, интегринов), инициируя этим внутриклеточную передачу сигналов [27].
Более того, адгезия является крайне важной в трансэндотелиальной миграции лейкоцитов, рециркуляции лимфоцитов, взаимодействии Т- и В-клеток и других иммунных процессов [27, 65].
Интересно, что адгезия клеток тесно связана с их пролиферацией. Нормальные клетки, не прикрепленные к субстрату, имеют округлую форму и не делятся. Частота деления клеток возрастает с увеличением их распластывания, однако стимулом к делению служит именно адгезия (субстратная зависимость размножения). В опухолевых клетках происходит сбой этих механизмов. Пролиферация большинства опухолей мало зависит от прикрепления их клеток к субстрату, тем не менее, прочное сцепление с внеклеточным матриксом в некоторых случаях может тормозить рост трансформированных клеток (топоипгибиция, или контактное торможение размножения) [2, 8, 27, 47].
Метастазирование опухоли в своей основе имеет нарушение процессов адгезии клеток. С одной стороны, кажется, что пеопластические клетки крайне автономны и слабо связаны с внеклеточным матриксом и другими клетками, а также легко проникают через трансэндотелиальный барьер. В основе этого, повидимому, может иметь место ослабление экспрессии и (или) снижение аффинности определенных рецепторов, а также утрата кластерного характера распределения молекул на клеточной поверхности в результате фосфорилирования этих рецепторов онкобелками (продуктами онкогенов), обладающих тирозинкиназной активностью, или мутаций и делеций в генах, кодирующих молекулы межклеточной адгезии [2, 27]. С другой стороны, опухолевые клетки в некоторой степени сохраняют свойство идентифицировать «свою» ткань (например, поражение лимфоидных структур при лимфопролиферативных заблеваниях) и заселять «излюбленные» ткани и органы [3, 17, 52]. Таким образом, неопластическая трансформация может сопровождаться не только ослаблением, но и усилением адгезии клеток к определенным компонентам внеклеточного матрикса [27].
В процессе инвазивного роста опухолевые клетки вступают в контакт с сосудистым эндотелием, проникая в систему циркуляции и осуществляя экстравазацию и формирование метастатических очагов, что также происходит посредством рецепторов адгезии напрямую: «опухолевая клетка — эндотелиоцит» или через мостик: «опухолевая клетка — фибриноген — эндотелиоцит (или тромбоцит)». Связывание неопластических клеток с тромбоцитами индуцирует агрегацию последних, что является важным условием инвазии стенки сосуда [27]. Динамика процесса установления контактов циркулирующих опухолевых клеток с сосудистым эндотелием сходна с процессом прилипания нормальных лейкоцитов и включает следующие стадии [6, 21, 27, 40, 65]
CD — антигены и хронический лимфоцитарный лейкоз
ХЛЛ - клональное лимфопролиферативное неопластическое заболевание, характеризующееся пролиферацией и увеличением в периферической крови количества зрелых лимфоцитов на фоне лимфоцитарной инфильтрации костного мозга, лимфатических узлов, селезенки и других органов [20, 52]. Установление диагноза ХЛЛ основывается на следующих критериях: абсолютный лимфоцитоз 5х109/л продолжается в течение не менее 4 недель, лимфоцитоз костного мозга составляет 30% ядросодержащих клеток, большинство клеток (более 90%) относятся к малым лимфоцитам, устанавливается типичный иммунофенотип опухолевых лимфоцитов (CD19+, CD5+, CD20+/-, CD22-/+, CD23+, CD 10-, slg iow, клональность по легким цепям иммуноглобулинов) [11, 16, 19, 20, 45, 52, 56, 79]. Наряду с вышеперечисленными дифференциально-диагностическими антигенами, позволяющими отличить ХЛЛ от других лимфопролиферативных заболеваний, неопластические клетки способны экспрессировать в некоторых случаях и другие антигены, роль которых в настоящее время активно изучается. Это связано с поиском новых прогностических факторов, которые могли бы более полно и точно охарактеризовать будущее развитие заболевания, необходимость и эффективность химиотерапевтического воздействия у конкретного больного. Сегодня нашли применение в диагностике ХЛЛ такие общепризнанные факторы неблагоприятного прогноза ХЛЛ, как клинические формы и более поздние стадии болезни, короткое время удвоения количества лимфоцитов периферической крови (менее 6-12 месяцев), диффузный тип инфильтрации костного мозга, высокий уровень экспрессии лейкозными клетками антигена CD38 и ZAP-70, повышенный уровень секреции интерлейкина — 8, отсутствие мутаций генов вариабельного региона иммуноглобулинов, наличие хромосомных аберраций, таких, как делеция llq, делеция 17q, трисомия 12 хромосомы [1, 5, 16, 23, 43, 44, 45].
В немногочисленной зарубежной литературе встречаются сведения о частой экспрессии неопластическими клетками ХЛЛ молекул CD9. Причем положительная экспрессия этого антигена наблюдается у пациентов в нулевой стадии ХЛЛ (классификация Rai) [144], однако, по данным Orfao А. и соавт. [129], у пациентов с выраженной пролиферативной активностью опухолевых клеток, которая встречается в III-1V стадиях болезни, также повышена экспрессия активационных маркеров, в т.ч. CD9. Кроме того, у пациентов с прогрессирующим течением болезни экспрессия CD9 значительно выше, чем со стабильным течением [146].
В большинстве работ, посвященных изучению экспрессии антигена CD11а на опухолевых лимфоцитах при ХЛЛ, сообщается о низком уровне экспрессии данного антигена на опухолевых клетках [66, 82, 88, 111, 124, 152], что отличает их от неходжкинских лимфом, в том числе и от лимфомы из малых лимфоцитов [66, 120, 124]. Однозначного мнения в вопросе о связи уровня экспрессии антигена CD11а с тяжестью течения и прогнозом ХЛЛ нет. Некоторые авторы считают, что случаи с тяжелым течением и продвинутыми стадиями ХЛЛ сочетаются с высокой экспрессией CDlla [82, 120], а также уровень экспрессии CDlla достоверно выше на поверхностной мембране клеток, имеющих трисомию 12 хромосомы, которая ассоциирована с промежуточным или неблагоприятным прогнозом [43, 112, 145], а делеция 1 lq, наоборот, сопровождается низкой экспрессией CDlla [141]. Другие исследователи склоняются к отсутствию существенных различий в презентации CDlla опухолевыми лимфоцитами в разных клинических стадиях ХЛЛ [152]. По данным Domingo А. и соавт. [88] и Csanaky G. и соавт. [82], низкая экспрессия интегринов, в частности CD 18 (общая субъединица р2 -интегринов), была ассоциирована с продвинутой стадией болезни (III - IV, Rai) и диффузным поражением костного мозга. В ряде работ отмечена связь уровня экспрессии CD11а с локализацией опухолевой массы [66, 114]. Случаи ХЛЛ с выраженной спленомегалией по одним данным характеризуются высокой экспрессией CDlla [66], по другим данным такая взаимосвязь в отношении CD11а не установлена [67].
В ряде работ отмечены либо отсутствие экспрессии CD1 lb на поверхности опухолевых лимфоцитов [19], либо очень низкий уровень экспрессии данного антигена, который не связан с клиническими проявлениями заболевания [120, 152]. Наряду с этим, в работе Eksioglu-Demiralp Е. и соавт. сообщается о повышенной экспрессии антигена CDllb на ранних стадиях болезни и ее снижении в ходе прогрессии болезни [90].
Согласно одним литературным данным [66, 88], низкая экспрессия CD18 опухолевыми клетками ХЛЛ ассоциирована со спленомегалией, 1II-IV стадией болезни и диффузным поражением костного мозга, а по другим источникам [67, 82] корреляция между экспрессией CD 18 и клинико-лабораторными показателями отсутствует.
В большинстве случаев ХЛЛ отмечена низкая экспрессия CD49d в сравнении с другими лимфопролиферативными заболеваниями [66, 82, 90, 124], хотя встречаются и противоположные данные [111], повышение экспрессии ассоциировано с плохим прогнозом [158], однако не значима у пациентов с преимущественным поражением селезенки [67]. Экспрессия CD49c при ХЛЛ выше, чем при других лимфопролиферативных заболеваниях [124], и ассоциирована с положительным прогнозом [124, 158]. Высокая экспрессия общего антигена рі-интегринов CD29 сочетается со спленомегалией [66], однако при ХЛЛ ниже, чем при других лимфопролиферативных заболеваниях [82, 124].
Опухолевые клетки ХЛЛ, по сообщениям большинства авторов, часто экспрессируют CD44 [66, 82, 88, 111], при этом не было обнаружено отличий в экспрессии данного антигена от нормальных В-лимфоцитов. Исследование генов, кодирующих рецептор CD44, также не выявило очевидных качественных аномалий [135]. Однако, Eistere W. и соавт. [89] приходят к иному заключению, что повышенная экспрессия CD44 встречается в более продвинутых стадиях ХЛЛ, диффузном поражении костного мозга и ассоциирована с плохим прогнозом; a Bairey О. и соавт. [67], сравнивая экспрессию антигена CD44 на леикозных В-клетках во II стадии ХЛЛ с поражением селезенки по отношению к О или I стадии, отмечают его более высокую экспрессию на клетках в более поздней стадии и считают, что данный рецептор обусловливает заселение селезенки опухолевыми клетками.
Иммунофенотипирование клеток крови с помощью иммунологических биочипов
Наряду с общепринятым клиническим обследованием всем больным проводилось изучение параметров периферической крови, мочи, основных биохимических показателей (билирубин, ЛЛТ, ACT, ЛДГ, общий белок, протеинограмма, креатинин и др.). Для уточнения диагноза и распространенности опухолевого процесса были выполнены инструментальные методы обследования (рентгенограмма грудной клетки, компьютерная томография органов грудной и брюшной полости, УЗИ органов брюшной полости и забрюшинного пространства, периферических лимфатических узлов) а также специальные методы исследования. Миелограмма выполнена у 34 (45,3%) пациентов. У 5 (6,7%) пациентов проведено гистологическое исследование трепанобиоптатов и биоптатов лимфатического узла с иммуногистохимическим анализом, а также цитологическое исследование.
У 22 (29,3%) пациентов выполнено иссле/ювание экспрессии антигенов лейкозными клетками с помощью проточной цитофлюориметрии (проточный цитофлюориметр - FACSCcanto II, Beacton Deakcinson, США) в гематологической лаборатории ГУЗ «1-ая Республиканская клиническая больница» МЗ УР, при этом анализировалось 9-20 антигенов клеток у каждого пациента.
Специфическое лечение ХЛЛ среди включенных в исследование пациентов (п=34) состояло в назначении первично — сдерживающей терапии хлорамбуцилом в дозе 6 - 10 мг 1 - 2 раза в неделю, а также в применении курсов СОР: циклофосфан 400 мг/м" внутривенно ежедневно с 1 — ого по 5 - ый день, винкристин 2 мг внутривенно в 1 - ый день, преднизолон 40 мг/м" внутрь с 1 - ого по 5 — ый день; повторные курсы с интервалом 14 — 20 дней. Монотерапия хлорамбуцилом проводилась у 20 пациентов (58,8%), только СОР - терапию получали 3 пациента (8,8%), лечение хлорамбуцилом и курсами СОР на протяжении всего периода болезни осуществлено у 11 больных (32,4%). Средняя продолжительность лечения хлорамбуцилом составила 40,9±5,6 (4 -157) месяцев, среднее количество курсов СОР - терапии соответствовало 4,1±1,4 (1 - 21). В лечение больных был добавлен преднизолон в дозе 40 — 50 мг в день при развитии аутоиммунной гемолитической анемии или аутоиммунной тромбоцитопении. Осложнение химиотерапии иммунодефицитом и развитием инфекционного процесса требовало парентерального введения препаратов иммуноглобулина и назначения антибактериальных и противовирусных средств.
У всех больных мы провели исследование содержания лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих следующие поверхностные антигены: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD1 la, CD1 lb, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD27, CD29, CD31, CD36, CD38, CD41, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72, CD95, CD98, HLA-DR, IgM, с помощью оригинальных иммунологических биочипов, разработанных н.с, к.м.н. Шишкиным А.В. в лаборатории физической биохимии системы крови (заведующий д.б.н., профессор Атауллаханов Ф.И.) ГУ «Гематологический научный центр РАМН» (г. Москва) (научные руководители темы: д.б.н. профессор Атауллаханов Ф.И. и академик РАН и РАМН Воробьев А.И.) [63, 142]. Биочип для определения поверхностных антигенов клеток представляет собой прозрачную подложку, на которой в строго определенных участках иммобилизированы антитела, способные специфически связывать поверхностные антигены исследуемых клеток. Изготовление биочипов Биочипы были изготовлены и применены в соответствии с разработанной методикой [63]. Капли, по объему соответствующие 0,5 мкл растворов антител в разведении 1:40, наносились на пластиковые покровные стекла (подложки) размером 11x22 мм («Fisher Scientific», США) автоматической пипеткой в заранее отмеченные участки. Подложки с нанесенными антителами помещались в камеру со 100% влажностью и инкубировались при +4С в течение суток, после чего высушивались на воздухе и замораживались при — 26С в герметичных контейнерах с осушителем (силикагель). Материалы для изготовления биочипов: 1. Подложки для биочипов изготовлены из пластифицированного поливинилхлорида («Fisher Scientific», США). 2. Антитела: анти - CD2 (LT2, IgG2a), CD3 (ТВЗ, IgG2b), CD4 (ЕМ4, IgG2a), CD5 (LT1, IgGl ), CD7 (LT7, IgG2b), CD8 (LT8, IgGl), CD9 (TR12, IgG2b), CDIO (LTIO, IgGl), CDlla (DE4, IgG2a ), CDUb (LTU, IgGl), CD16 (LNK16, IgGl), CD 19 (LT19, IgGl ), CD20 (LT20, IgGl), CD21 (LT21, IgGl), CD22 (LT22, IgG2a ), CD23 (LT-4F1, IgGl), CD27 (LT27, IgG2a), CD29 (TR19, IgG2a), CD31 (TR17, IgGl), CD36 (TR9, IgGl), CD38 (LT38, IgGl), CD41 (TR8, IgGl), CD44 (He7, IgG2b), CD45 (LT45, IgG2a), CD45RA (T6D11, IgG2b), CD54 (RA4A3), CD56 (LT56, IgG), CD71 (LT71, IgG2a,), CD72 (3F3, IgG2b), CD95 (LT95, IgGl), CD98 (4A11, IgGl), анти - HLA-DR (C120, IgG2a), человеческие анти - IgM (MA2, IgG) (OOO «Сорбент», Москва). В ходе работы были использованы следующие реагенты и растворы: азур (OOO «Агат», Москва), эозин («Merck» KgaA, Германия), метанол («Merck» KgaA, Германия), ЭДТА («Sigma chemical», США), детергент Tween-20 («Sigma chemical», США), обезжиренное сухое молоко («Kroger», США), бычий сывороточный альбумин BSA («Sigma chemical», США); физиологический раствор (0,15М NaCl, рН=7,2 - 7,5), фосфатный буфер, или PBS (0,14 М NaCl, 2,5 мМ КС1, 4,4 мМ Na2HP04, 1,5 мМ КН2Р04, рН=7,4), блокирующий раствор (1% раствор сухого обезжиренного коровьего молока в PBS, рН=7,4), отмывочный раствор (0,05% раствор Tween-20, разведенный PBS, рН=7,4), раствор для приготовления клеточной суспензии (раствор PBS, содержащий 0,1% обезжиренного сухого молока, 0,5 мг/мл ЭДТА, 10 - 15% гретой человеческой сыворотки). Расходные материалы, используемые в работе, включали шприцы 2, 5, 10, 20, 60 мл (Jung Rim, Medical Industrial Co., Ltd., Северная Корея); микропланшеты («Greiner Bio-One GmbH» (Frickenhausen), Германия); наконечники для автоматических пипеток 2, 15, 20, 200, 1000 мкл («Gilson, Inc.» (Middleton), США).
Иммунофенотип лимфоцитов и возрастно — половой состав пациентов при хроническом лимфоцитарном лейкозе
Представляло существенный интерес изучение содержания опухолевых лимфоцитов в периферической крови, экспрессирующих различные антигенные маркеры, у пациентов, страдающих ХЛЛ в зависимости от половой принадлежности и возраста. По результатам, представленным в табл. 3.2.1, можно сделать заключение, что существенных различий популяцио иного состава лимфоцитов, отличающихся экспрессией изученных антигенов, у больных разного пола нет.
Примечание: различия достоверны при Х, 1,84, р 0,05, связь достоверна при р 0,05
Корреляционный анализ между возрастом больных и количеством лимфоцитов, позитивных по исследуемым антигенам, также не выявил достоверных отличий (р 0,10).
Таким образом, иммунофенотип циркулирующих лимфоцитов пациентов с ХЛЛ не связан с их полом и возрастом.
В данном разделе рассматривается экспрессия лейкемическими клетками некоторых молекул адгезии и активации ХЛЛ как потенциальных прогностических факторов относительно общепринятых критериев прогноза течения ХЛЛ.
Стадирование ХЛЛ по клинико - лабораторным критериям (классификация Binet J.L. [76]) обобщенно отражает количество опухолевой массы, в некоторой степени инвазивную способность лейкемических лимфоцитов и резервы нормального кроветворения и, соответственно, определяет выживаемость больных [45], поэтому анализ содержания популяций опухолевых клеток в периферической крови у пациентов в разных клинических стадиях позволил бы предположить, какой иммунофенотип присущ опухолевым лимфоцитам в продвинутых стадиях болезни, определяющим ее агрессивность. Анализ содержания опухолевых лимфоцитов, экспрессирующих разные антигены, представлен в табл. 3.3.1.1.
По нашим результатам количество CD38 - положительных клеток в стадии А достоверно ниже (р=0,03), чем в стадиях В и С, что характеризует более благоприятный прогноз у пациентов в начальной стадии болезни, и это подтверждено в многочисленных исследованиях [1, 16, 20, 30, 45, 52]. Более того, в соответствии с полученными данными содержание в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих антиген CD9, нарастает по мере увеличения стадии, и количество CD9 - позитивных В-клеток достоверно выше в стадии С, чем в стадиях А (р=0,0008) и В (р=0,03). По - видимому, популяция лимфоцитов, экспрессирующих на мембране молекулу адгезии CD9, выживает и аккумулируется по мере развития ХЛЛ.
Также достоверно (р=0,01) обнаружено более высокое количество лимфоцитов в периферической крови, несущих на своей поверхности антиген CD1 lb/18 (р\ — интегрин) на начальной стадии заболевания в отличие от стадии В, хотя в отношении стадии С такое различие не является достоверным (р=0,32). Полученные нами результаты согласуются с исследованием Eksioglu-Demiralp Е. и соавт. [90], изучавшими экспрессию CD1 lb опухолевыми клетками в разных клинических стадиях ХЛЛ, а также с результатами работ [66, 88], которые свидетельствуют о более низкой экспрессии В-клетками общей субъединицы р2 - интегринов (CD 18) в более поздних стадиях заболевания. Учитывая, что рецепторы семейства интегринов играют роль в адгезии и миграции клеток, вероятно, по мере прогрессии ХЛЛ происходит такое распределение опухолевых лимфоцитов, при котором в периферической крови содержится меньше CDllb — позитивных В — клеток.
В процессе исследования мы также заметили определенную закономерность: в периферической крови пациентов, зарегистрированных в стадии В, содержится существенно (р=0,02) более низкое число клеток, реагирующих с антителами к ответственному за апоптоз рецептору CD95, по отношению к стадиям А и С. Помимо этого, количество циркулирующих лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности рецептор CD98, также достоверно выше (р=0,01) в стадии А в сравнении со стадией В. Также существует некоторая тенденция к достоверности более высокого содержания CD71 - позитивных клеток в стадии С по отношению к стадии В (р=0,09). В целом складывается впечатление, что содержание в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих антигены CD95, CD98 и CD71, в стадии В низкое, а в стадиях А и С более высокое. Если учесть, что антиген CD98 является трансмембранным транспортером аминокислот в клетку [32], что свидетельствует о высоком уровне синтеза белка в ней, который в отношении неопластической клетки, как известно, характерен для синтетической фазы митотического цикла, то можно предположить, что этот рецептор косвенно характеризует пролиферативную активность опухолевого лимфоцита. Также известно [32], что трансфериновый рецептор CD71 высоко экспрессирован на поверхности всех пролиферирующих клеток, и, следовательно, также может отражать пролиферативный потенциал популяции CD71 — положительных лимфоцитов, что доказано положительной корреляцией между включением в лимфоциты радиоактивного тимидина, меченного тритием, и экспрессией ими антигена CD71 [И7].
