Введение к работе
Актуальность проблемы
Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) является важным компонентом терапии при многих гематологических заболеваниях, врожденных нарушениях иммунной системы, наследственных анемиях, некоторых болезнях обмена и злокачественных новообразованиях (Thomas E.D., 1990; Афанасьев Б.В. и соавт. 1994; Bensinger W. et al., 1995; Schmitz N. et al., 1995; Савченко В.Г. и соавт. 1996; Румянцев А.Г., 1996; Птушкин В.В., 1997; Rubinstein P., 1999; Gluckman E., 2004). Успех трансплантации во многом зависит от достаточного количества ГСК и их биологических свойств, поэтому, важным вопросом при применении ПК в клинике является оценка трансплантата, в основе которой лежит определение количества и жизнеспособности ГСК, содержащихся в трансплантационном материале (Bender J.G., 1994; Gonzalez B.E., 1997; Traineau R., 1998; Allan D.S., 2002; Cotta S.V. et al., 2002; Marino M.P. et al., 2002).
В течение последних 10 лет в качестве источника гемопоэтических стволовых клеток все чаще используют мобилизованную при помощи Г-КСФ периферическую кровь (Bensinger W. et al., 1995; Schmitz N. et al., 1995; Масчан А.А., 1995; Афанасьев Б.В. и соавт. 1996; Савченко В.Г. и соавт. 1996); в связи с чем, важно определить условия и механизмы воздействия Г-КСФ на систему гемопоэза, для получения наиболее эффективного трансплантационного материала (Asano S., 1991; Welte K., et al., 1996; Kronenwett R., et al., 2000; Cutler C., et al., 2001; Maianski NA., et al., 2002).
Использование различных источников ГСК для трансплантации, а также использование множества технологических приемов для получения непосредственного трансплантационного материала из ПК и периферической крови требует тщательного описания и сравнения клеточного состава и характеристик ГСК в различных источниках и определение факторов, оказывающих на них влияние.
Таким образом, решение указанных вопросов позволит оптимизировать технологии заготовки, процессинга и модификации ГСК ПК и периферической крови для клинического использования.
Цель исследования:
Определить биологические свойства гемопоэтических стволовых клеток в трансплантационном материале их пуповинной, периферической крови и костного мозга.
Задачи исследования:
-
Определить количество коммитированных предшественников различных линий гемопоэза в периферической крови после мобилизации Г-КСФ и в трансплантационном материале мобилизованной периферической крови, в пуповинной крови и в материале ПК после прохождения процедуры лейкоконцентрации и в костном мозге.
-
Определить жизнеспособность предшественников различных линий гемопоэза в периферической крови после мобилизации Г-КСФ и в трансплантационном материале мобилизованной периферической крови, в пуповинной крови и в материале ПК после прохождения процедуры лейкоконцентрации и в костном мозге.
-
Определить экспрессию факторов, способствующих реализации хоуминг-эффекта гемопоэтическими стволовыми клетками периферической крови после мобилизации Г-КСФ и в трансплантационном материале мобилизованной периферической крови, в пуповинной крови и в материале ПК после прохождения процедуры лейкоконцентрации и в костном мозге.
-
Изучить профиль генов регулирующих пролиферацию и апоптоз в CD34+клетках из разных источников
Научная новизна
Трансплантационный материал ПК содержит около 11106 CD34+клеток, что меньше, чем в Г-КСФ мобилизованной периферической крови здоровых доноров (104106 CD34+клеток); однако популяция ГСК ПК содержит статистически значимо большее количество более ранних CD133+ предшественников гемопоэза, мезенхимальных и эндотелиальных клеток-предшественников, по сравнению с трансплантационным материалом, полученным из мобилизованной Г-КСФ периферической крови (p<0,0001)
Условием получения наиболее эффективного трансплантационного материала служат обоснованные стандарты сбора и количественной и качественной оценки материала при помощи автоматического анализатора клеток крови, учитывающего наличие нормобластов, определение количества и состава ГСК с учетом количества CD34+, CD133+, CD3+, CD16+56+ клеток, определения эффективности клонирования в 14 суточной культуре в метилцеллюлозе с учетом КОЕ-ГЕММ, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э, уровня спонтанного апоптоза (PI+/Annexin V+клетки).
Практическое значение
Произведена оценка трансплантационного материала, полученного из периферической крови, мобилизованной Г-КСФ. При использовании препаратов Г-КСФ в периферической крови увеличивается количество всех субпопуляций лейкоцитов. Эффект мобилизующего действия Г-КСФ зависит от количества нейтрофилов перед началом мобилизации и связан со степенью повышения концентрации в сыворотке крови IL 8 и MMP-9.
Внедрение в практику
Результаты исследования внедрены в работу ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава, ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы». Основные положения и выводы диссертации используются в подготовке специалистов гематологов, онкологов и иммунологов на кафедре клинической гематологии, онкологии и иммунопатологии с курсом поликлинической и социальной педиатрии ФУВ РГМУ. По теме диссертации опубликовано 4 работы.
Результаты работы доложены на X Съезде педиатров России, Москва, в феврале 2006, и Российском Съезде гематологов и трансфузиологов, Москва, в апреле 2006, Всероссийской конференции РНОИ, Курск, в мае 2006, Российском конгрессе «Новые технологии в перинатологии», Москва, в ноябре 2006, XII Съезде педиатров России, Москва, в феврале 2008, IV Всероссийском Съезде специалистов перинатальной медицины, Москва, в сентябре 2009.
Апробация диссертации
Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции сотрудников клинических и лабораторных отделов ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава, кафедр факультетской педиатрии Московского факультета и клинической гематологии, онкологии и иммунопатологии с курсом поликлинической и социальной педиатрии ФУВ РГМУ, Российской детской клинической больницы 18 сентября 2006 г.
Структура и объем диссертации
Материал диссертации изложен в одном томе на ____ страницах машинописного текста, содержит ___ таблицу и проиллюстрирован ___ рисунками. Указатель литературы включает источника отечественной и – зарубежной литературы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.
Работа выполнена в ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава (директор ФГУ ФНКЦ ДГОИ – член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Румянцев А.Г.), на базе лаборатории регуляции кроветворения (зав. – д.б.н. Осипова Е.Ю.) отдела молекулярной гематологии (зав. –д.м.н., профессор Румянцев С.А.)
