Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор
1. Память и угашение выработанных условных реакций 9
1.1. Общие представления 9
1.2. Отражение индивидуальных характеристик животных в обучении и угашений аверсив-ных условных реакций 11
1.3. Роль предварительного стрессового воздействия на обучение и угашение условных реакций избегания 16
1.4. Пространственная память 17
2. Поведение и память при аффективных состояниях 22
2.1. Экспериментальные модели депрессивноподобного состояния 23
2.2. Поведенческие проявления аффективных состояний 25
2.3. Значимость генетически детерминированных поведенческих реакций как фактора риска появления психопатологии 26
2.4. Обучение и угашение памяти о страхе при аффективных состояниях 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Животные 35
2.2. Экспериментальные модели 36
2.2.1. Формирование агрессивного и субмиссивного типов поведения 36
2.2.2. Модель депрессивноподобного состояния 36
2.2.3. Стрессовое воздействие 36
2.3. Поведенческие исследования 36
2.3.1. Тест приподнятый крестообразный лабиринт 36
2.3.2. Тест свет/темнота 36
2.4. Методы для анализа процессов воспроизведения следа памяти 36
2.4.1. Условная реакция пассивного избегания 36
2.4.2. Угашение условной реакции пассивного избегания 37
2.5. Пространственная память 37
2.6. Статистическая обработка данных 39
ГЛАВА 3. Результаты исследований 40
3.1. Влияние кратковременного стресса от принудительного плавания на обучение и угашение условной реакции пассивного избегания мышей с разными стереотипами поведения 40
3.2. Особенности угашения условной реакции пассивного избегания мышей с разным уровнем тревожности 45
3.3. Угашение условной реакции пассивного избегания мышей с депрессивноподобным состоянием 49
3.3.1. Угашение условной реакции пассивного избегания мышей в экспериментальных моделях «поведенческого отчаяния» и приобретения опыта поражений 49
3.3.2. Обучение и угашение реакции пассивного избегания мышей с высокой предрасположенностью к каталепсии 54
3.3.3. Угашение памяти о страхе мышей разных линий 59
3.4. Пространственная память мышей с различным исходным функциональным состоянием 62
3.4.1. Обучение и угашение пространственного навыка агрессивных и субмиссивных мышей 63
3.4.2. Обучение и угашение пространственного навыка мышей с разным уровнем тревожности 69
3.4.3. Обучение И угашение пространственной памяти мышей разных линий 72
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 77
Выводы 81
Список литературы 82
- Отражение индивидуальных характеристик животных в обучении и угашений аверсив-ных условных реакций
- Значимость генетически детерминированных поведенческих реакций как фактора риска появления психопатологии
- Особенности угашения условной реакции пассивного избегания мышей с разным уровнем тревожности
- Обучение и угашение реакции пассивного избегания мышей с высокой предрасположенностью к каталепсии
Введение к работе
Актуальность темы Вариативность является одним из важнейших свойств живых систем и проявляется в виде различной выраженности индивидуальных реакций в ответ на одинаковые стимулы окружающей среды. В современной медицине разработка дифференцированного подхода к применению лекарственных средств и терапевтической коррекции в зависимости от индивидуального психоэмоционального статуса организма стала одной из ключевых. Болезни, связанные с травматическим стрессом, включая агрессию, депрессию и тревожность, являются серьезной проблемой с точки зрения, что все люди сталкиваются в жизни с разными формами стресса, но лишь у 15 – 20% индивидов развивается патология (Adamec et al., 2006). Поэтому чрезвычайно важно выявить индивидуальные различия, предопределяющие эластичность адаптационных процессов и резистентность к развитию негативных реакций.
Депрессия – одно из распространенных заболеваний нашего времени с тяжелыми последствиями вплоть до суицида. Симптомы депрессии проявляются на психологическом, поведенческом и когнитивном уровнях (Holmes, 2003; Willner, 2005; Григорьян, 2006; Jacobson, Cryan, 2007; Девойно и др., 2009). Среди поведенческих реакций депрессивноподобного состояния животных отмечают высокий уровень неподвижности в тесте Порсолта, изменение структуры сна, пассивность реакций на окружающие сигналы (Кудрявцева, 1999; Masuda et al., 2001; Alcaro et al., 2002; Willner, 2005; Mineur et al., 2006; El Yacoubi, Vaugeois, 2007). В то же время решающим фактором развития депрессии рассматривается снижение возможности контролировать изменения в окружающей обстановке, базирующейся на процессах памяти (Blechert et al., 2007; Burriss et al., 2008; Liberzon, Stripada, 2008). Это делает актуальным разработку проблемы зависимости процессов памяти от таких состояний в экспериментальных моделях. Несмотря на трудности воспроизведения всего спектра симптомов депрессии, было предпринято множество попыток создания адекватных моделей депрессивноподобных состояний на грызунах (Августинович и др., 2004; Willner, 2005; Einat, 2007; Brinks et al., 2008). В последние годы внимание многих исследователей приковано к разработке генетических моделей, так как генетические факторы составляют 40 – 70% риска появления психопатологий (Jacobson, Cryan, 2007; Mandillo et al., 2008; Guzman et al., 2009; Rattray et al., 2009; Singer et al., 2009). Активно развивается направление создания линий мышей, чей фенотип соответствует отдельным симптомам депрессивного состояния (Yoshikawa et al., 2002; Базовкина и др., 2005; Crowley, Lucki, 2005; Urani et al., 2005; Кондаурова и др., 2007; El Yacoubi, Vaugeois, 2007; Chourbaji et al., 2008).
Относительно зависимости обучения от индивидуального поведенческого статуса, имеющиеся в литературе данные достаточно противоречивы и частично предопределены используемыми в экспериментах мотивациями и условиями при выработке аверсивных условных реакций (Hyde, Denenberg, 1997; Laxmi et al., 2003; Ohl et al., 2003; Castro et al., 2005). Например, в немногочисленных исследованиях условной реакции пассивного избегания (УРПИ) у "депрессивных" особей наблюдались или дефицит (Sun, Alkon, 2004; Kazlauckas et al., 2005), или неизменность (Kumar, Karanth, 1996) формирования следа памяти. Но анализ только обучения не всегда позволяет оценить взаимосвязь исходного статуса и памяти.
Известно, что основной проблемой психоэмоциональных нарушений в когнитивной сфере является неспособность пациентов тормозить проявления памяти о негативных событиях (Davis et al., 2006; Delgado et al., 2006; Hermans et al., 2006; Hofmann, 2008; , , 2008; Tronson et al., 2008). И здесь важен подход с использованием процедуры угашения памяти о страхе, представляющей собой форму эмоциональной регуляции, которая имеет прямое отношение к лечению болезней, обусловленных повышенными страхом и тревожностью. Угашение рассматривается как результат измененной иерархии выученных ответов, когда приобретаемое при длительном тестировании без наказания поведение замещает ранее сформированный условный рефлекс (Bouton et al., 2006; Bruchey et al., 2007; Myers, Davis, 2007). Следует отметить, что угашение памяти о страхе у мышей анализировалось недостаточно (Laxmi et al., 2003; Waddell et al., 2004; Izquierdo et al., 2006; Rattray et al., 2009) и совсем мало внимания уделялось экспериментальным исследованиям этого процесса при депрессивноподобном состоянии, при высоком уровне тревожности (Kamprath, Wotjak, 2004).
В этой связи очевидна значимость выявления механизмов сохранения памяти при аффективных состояниях с использованием генетически детерминированных и экспериментальных моделей на животных. Актуальными представляются исследования относительно путей, которыми можно снизить сохранение нежелательной памяти, и причин, обусловливающих дефицит торможения реакции страха. Решение этих задач позволит расширить представления о центральной регуляции адаптивного поведения и наметить пути повышения эффективности корригирующих воздействий.
В то же время адаптивное поведение непосредственно связано и с ориентацией животных в пространстве, необходимой при поиске пищи, обороны от хищников, социальной организации, т. е. при специфическом обустройстве экологических ниш. При анализе пространственной памяти мышей наиболее часто используемым когнитивным тестом является водный лабиринт Морриса (D’Hooge, De Deyn, 2001; Бобкова и др., 2002; Stavnezer et al., 2002; Brooks et al., 2005). Успешность обучения решению пространственной задачи нахождения платформы зависит от множества факторов, в том числе и от генетически детерминированных особенностей поведения (Bert et al., 2005; Brown, Wong, 2007; Moy et al., 2007). Показаны достаточно сложные и противоречивые взаимоотношения между тревожностью и пространственным обучением (Lang et al., 2003; Schellink et al., 2003; Voikar et al., 2005; Tonissoo et al., 2006). Проблеме угашения пространственной памяти посвящено лишь несколько исследований (Lattal et al., 2003; 2004; Schulz et al., 2007), а о связи угашения с индивидуальными характеристиками поведения работ нет. В связи с этим важность решения вопросов взаимоотношений пространственной памяти и исходного состояния очевидна.
Целью настоящей работы было исследование способности к обучению и сохранению следа памяти при угашении в зависимости от генетически детерминированного и эмоционального статуса мышей.
В соответствии с поставленной целью, были сформулированы следующие задачи:
1. Выявить особенности обучения и угашения условной реакции пассивного избегания (УРПИ) мышей с разным уровнем тревожности, в моделях депрессивноподобного состояния («поведенческое отчаяния», приобретение опыта поражений, мыши с высокой предрасположенностью к каталепсии) и мышей разных линий;
2. Исследовать взаимосвязь пространственной памяти и базового поведенческого статуса мышей.
Научная новизна работы В настоящей работе впервые:
показана избирательность процесса угашения выработанной условной реакции пассивного избегания в зависимости от индивидуального поведенческого статуса мышей. Высокотревожное поведение, депрессивноподобное состояние в экспериментальной модели «поведенческого отчаяния» и генетически детерминированное селекций на высокую предрасположенность к каталепсии мышей предопределило нарушение угашения УРПИ;
выявлена генетически детерминированная избирательность угашения УРПИ мышей разных линий. У мышей CBA и BALB обнаружена задержка угашения, а у мышей DBA нарушено формирование нового следа памяти;
установлено, что формирование следа пространственной памяти ухудшено у мышей линий DBA и C3H и с низким уровнем тревожности у мышей С57. Дефицит угашения навигационного рефлекса обнаружен у мышей С57 с агрессивным стереотипом и линий CBA и C3H.
Теоретическая и научно–практическая ценность работы Теоретическое значение работы заключается в экспериментальных доказательствах пролонгированности сохранения памяти о страхе при угашении как когнитивном симптоме аффективных состояний (агрессия, депрессия, высоко тревожное поведение). Учитывая показанные ранее поведенческие признаки депрессии у мышей ASC с высокой предрасположенностью к каталепсии, данные настоящего исследования о нарушении у них угашения УРПИ, позволяют предложить линию мышей ASC в качестве генетической модели депрессии для поиска антидепрессантов, направленных на когнитивную сферу.
Полученные в работе данные о взаимозависимости обучения и угашения разных видов памяти от генетически детерминированных особенностей поведения служат обоснованием для использования индивидуального анализа в качестве одного из базовых критериев успешности эксперимента. Это особенно важно при доклинических исследованиях нейрофизиологических механизмов психоэмоциональных нарушений и эффективности их коррекции фармакологическими препаратами, селективными для разных типов рецепторов медиаторных систем мозга. Установленная избирательность процесса угашения УРПИ мышей с реакцией "поведенческого отчаяния" и опытом поражений при отсутствии различий в поведенческих проявлениях депрессивноподобного состояния должна быть принята во внимание при выборе адекватных моделей психопатологии.
Положения, выносимые на защиту
1. Высокая тревожность, депрессивноподобное состояние (модель «поведенческого отчаяния») мышей сопровождается нарушением угашения УРПИ при неизменности выработки рефлекса.
2. Селекция на высокую предрасположенность к каталепсии мышей привела к дефициту угашения следа памяти о страхе, являющегося основным когнитивным симптомом депрессии. Формирование нового следа памяти при угашении затруднено у мышей линий DBA, CBA и BALB.
3. Формирование и сохранение пространственной памяти определяется генотипом и поведенческим статусом мышей. Мыши линий DBA и C3H характеризовались плохим обучением в отличие от мышей линий C57, BALB, CBA и AKR. Нарушение угашения пространственного навыка отмечено у мышей с агрессивным стереотипом и линий CBA, C3H.
Апробация результатов Материалы диссертации обсуждались на VI Физиологическом съезде (Барнаул, 2008), на Конференции молодых ученых Института физиологии СО РАМН (2008).
Публикации По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 4 статьи в отечественных рецензируемых журналах и 2 статьи в зарубежных.
Структура и объем работы Диссертация включает введение, обзор литературы, методы, результаты исследования, обсуждение, выводы, список литературы из 245 источников. Работа изложена на 100 страницах, содержит 19 рисунков и 7 таблиц.
Отражение индивидуальных характеристик животных в обучении и угашений аверсив-ных условных реакций
В появлении психоэмоциональных нарушений большую роль играют индивидуальные особенности организма. Известно, что лишь у 30 - 40% людей после травматического стресса развивается патология. Поэтому чрезвычайно важно вывить в эксперименте индивидуальные, в том числе и генетически детерминированные особенности организма, предопределяющие эластичность адаптационных процессов и резистентность к появлению негативных реакций. Анализ взаимоотношений поведенческого статуса и памяти широко освещался в литературе (Andrews et al., 1996; Jonasson, 2005; Bush et al., 2007). Например, на мышах аутбредных линий CD-I с использованием множества разных тестов показана значимость фактора общей обучаемости (general learning), зависимой от индивидуальной предрасположенности к исследовательскому поведению, но не относящейся к вариациям в сенсомоторной деятельности и чувствительности к условиям, провоцирующим стресс и страх (Matzel et al., 2006).
Поскольку при выработке аверсивных УР в качестве безусловного стимула чаще всего используется ток, то нам представлялось важным отметить индивидуальную чувствительность мышей разных линий к болевому стимулу. Ранжирование по уровню реактивности на ток в автоматизированном тесте выглядело следующим образом - BALB/c FVB/NJ DBA/2J CBA/J A/J СЗІ-MIeJ 129Sl/SvJ C57BL/6J (Kazdoba et al., 2007).
Исследований выработки УР страха и УРПИ мышами разных линии достаточно много (Beuzen, Belzung, 1995; Stiedl et al., 1999; Balogh, Wehner, 2003; Ammassarieule, Castellano, 2004; Bothe et al., 2005; Brooks et al., 2005; Brown, Wong, 2007; Moy et al, 2007; Brinks et al., 2008). Мы посчитали целесообразным представить данные в таблице, полученные на наиболее часто используемых в экспериментах линиях мышей.
Из данных литературы ясно, что мыши всех линий способны к обучению УР страха и УР-ПИ, но с различной эффективностью. На эффективность обучения влияют предварительные воздействия на животное. Анализ эффектов предварительного тестирования в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ, plus-maze), открытом поле, светло/темной камере, камере Порсолта на выполнение поведенческих ответов в этих тестах и на обучение УР страха показал досгаточно сложную картину (Voikar et al., 2005). В частности, обнаружено снижение обучения у мышей линий 129/Sv и C57BL/6J при использовании в качестве условного стимула контекста, но улучшение обучения на звуковой условный стимул. Одиночное содержание особей сопровождалось ухудшением формирования УР страха, более выраженное у мышей DBA по сравнению с C57BL/6J (Voikar et al., 2005). Получено свидетельство развития генерализованной реакции страха у мышей C57BL/6J при повторном тестировании УР и дифференцированное условных стимулов (контекст и звук) у мышей BALB/c (Brinks et al., 2008), что частично не согласуется с данными других авторов (Balogh, Wehner, 2003). Лучшая обучаемость УРПИ мышей DBA/2J по сравнению с C57BL/6J и то, что предварительные преэкспо-зиции к экспериментальной установке снижали воспроизведение следа памяти у мышей C57BL/6J (подобие латентного торможения) и улучшали у DBA/2J мышей, свидетельствуют о разной способности формировать ассоциации (Baarendse et al., 2008). Некоторые исследователи отмечали неэффективность содержания мышей C57BL/6J в разных условиях на выработку УРПИ (Iso et al., 2007). Более подробно эффекты разных предварительных стрессовых воздействий на память изложены в разделе 1.3.
Существуют доказательства, что тревожность и память — близко связанные процессы (Жуков и др., 2002; Beuzen, Belzung, 1995; Ribeiro et al., 1999; Дубровина, Лоскутова, 2003; Laxmi et al., 2003). Известно, что средний уровень тревожности способствует хорошему обучению УРПИ, в то время как высокий и низкий уровни приводят к угнетению формирования следа памяти. При анализе связи тревожности и памяти с использованием тестов УРПИ, светло/темной камеры и свободного обследования на мышах разных линий показано, что более тревожные особи лучше обучаются рефлексу пассивного избегания (Beuzen, Belzung, 1995). Кроме того, поведение мышей линий C57BL/6J, DBA и BALB/c в модифицированном hole board тесте, позволяющем одновременно регистрировать показатели памяти и тревожности, свидетельствует, что мыши DBA были более тревожны с быстрым привыканием к тестовым условиям (ОЫ et al., 2003). Мыши C57BL/6J были менее эмоциональны с низким уровнем эраузла по сравнению с мышами BALB/c. Авторы считают, что когнитивные функции у DBA мышей связаны с тревожностью, у C57BL/6J - с локомоциями. Генетические исследования на мышах (Ponder et al., 2007) показали, что формирование следа памяти о страхе (классическая УР страха) и тревожность контролируются некоторыми общими генами. Например, мыши линий C57BL/6J и A/J, селекционированные по высокому и низкому уровням обучения УР страха, показали различия по параметрам страх-потенцированной акустической реакции вздрагивания (fear-potentiated startle response). В то же время не было различий ни по чувствительности к току, ни по выработке УР с положительным подкреплением, ни по пространственной памяти в лабиринте Морриса. Мыши с высоким уровнем УР страха обнаружили повышенную тревожность в тестах открытого поля и ПКЛ, что подтверждает генетическую связь между тревожностью и реакцией страха. Генетический анализ позволил идентифицировать определенные хромосомные области в миндалевидном комплексе и гиппокампе, обусловливающие данные поведенческие проявления при селекции.
В исследованиях УР страха на инбредных линиях мышей внимание фокусировалось на анализе воспроизведения рефлекса через 24 часа и мало известно о длительности сохранения памяти у мышей разных линий. Известно лишь несколько попыток сравнительного анализа развития уташения у мышей разных линий (Adams et al., 2002; Laxmi et al., 2003; Waddell et al., 2004; Hefner et al., 2008). Существенные вариации формирования и сохранения УР обнаружены у мышей линий AKR/J, BALB/cByJ, СВАЛ, СЗН/HeIbg, C57BL/6J, DBA/2J, LP/J, 129/SvevTac (Balogh, Wehner, 2003). Тест на 14-й день после обучения выявил, что мыши некоторых линий проявили генерализованную реакцию замирания (фризинга), характерную для мышей C57BL/6J, но не DBA/2J. Обсуждается возможность рассмотрения мышей гиперреактивного фенотипа, сохранивших УР страха через 14 дней, как модель психопатологии, обусловленной сохранением страха. Сходный эффект более длительного сохранения воспроизведения памяти о страхе мышами C57BL/6J по сравнению с DBA/2J выявлен также в процедуре страх-потенцированной реакции вздрагивания другими исследователями (Laxmi et al., 2003; Waddell et al., 2004). Показана зависимость сохранения УР страха от интенсивности болевого раздражения и количества сочетаний условного стимула с наказанием при выработке рефлекса. Параллельно выявлено, что новое «тормозное» обучение у мышей C57BL/6J связано с ростом тревожного поведения в тесте «свет/темнота» (тест проводился после угашения), отражающее эмоциональную сенсиїизацию как следствие потери предсказуемости безусловного наказания (Laxmi et al., 2003). Хотя исходно мыши C57BL/6J были менее тревожны, судя по тестам ПКЛ и открытого поля (Van Gaalen, Steckler, 2000). Причиной быстрого угашения страх-потенцированной реакции вздрагивания у мышей DBA/2J может быть дефицит функционирования гиппокампа (Waddell et al., 2004). Однако, на мышах линий BALB/cWahl (с дефектом в corpus callosum и интакшой гиппокампальной комиссурой) и 9XCA/Wah (полное отсутствие corpus callosum и дефект гиппокампальной комиссуры) показано, что угашение контекстуальной УР страха блокировано у мышей 9ХСА и сопровождается существенными нарушениями синаптической пластичности (Schimanski, Nguyen, 2004). Формирование же навыка и угашение УР страха на звук у этих особей не отличались от мышей линий BALB/cWahl. Эти факты свидетельствуют, что интактность гиппокампальной комиссуры является критической для угашения контекстуальной УР страха.
Значимость генетически детерминированных поведенческих реакций как фактора риска появления психопатологии
Депрессия — это гетерогенная, многогранная патология с симптомами, проявляющимися на психологическом, поведенческом и когнитивном уровнях. Именно многогранность проявлений депрессивных состояний и явилась причиной трудностей моделирования такой патологии в лабораторных условиях. Некоторые симптомы, присущие депрессивным пациентам в клинике, типа постоянных мыслей о смерти, попыток суицида, невозможно смоделировать у животных. Несмотря на трудности воспроизведения всего спектра симптомов депрессии, было предпринято множество попыток создания моделей депрессивноподобных состояний на грызунах. В ряде обзоров подробно освещены вопросы валидности существующих моделей (Кудрявцева и др., 1989; File, 1996; Саркисова и др., 2002; Holmes, 2003; Арушанян, Бейер, 2004; Chourbaji et al., 2005; 2008; Cryan, Holmes, 2005; Willner, 2005; Slattery et al., 2007; Burriss et al., 2008). Экспериментальные модели депрессии на животных используются с целью познания патофизиологических механизмов данной болезни и предсказания клинической эффективности новых психотерапевтических средств. Модель на животных должна соответствовать трем критериям: 1. Сходство проявлений (face validity) — схожесть поведенческих и физиологических характеристик модели и симптомов моделируемого заболевания; 2. Прогностическая достоверность (predictive validity) - соответствие между реакциями модели на факторы, усиливающие или ослабляющие проявления патологии; 3. Конструктивная достоверность (construct validity) — сходство физиологических и нейрохимических механизмов между моделью и патологией.
Среди моделей депрессивного состояния достаточно валидной является.л/одель сенсорного контакта, основанная на формировании субмиссивного поведения в результате ежедневных конфронтации (Кудрявцева и др., 1989; Августинович и др., 2004). Различные вариации зоосоциальных конфликтов используются при моделировании депрессии (Blanchard et al., 2003; Willner, Mitchell, 2002"; De Jong et al., 2005; Malatynska, Knapp, 2005; McArthur, Borsini, 2006). Модели депрессии, основанные на взаимоотношениях между животными, предполагают три типа таких отношений. Первый - доминантно-субмиссивные взаимодействия в группе и характеризующиеся агонистическими и оборонительными позами. Второй - отношения победителя и слабого, измеряемые при конкуренции. Третий - отношения резидент/интрудер, отражающиеся в появлении статуса побежденного.
На основе вызванной потери удовольствия и интереса разработана модель депрессивного состояния, заключающаяся в хроническолі предъявлении различных стрессоров (ограничение движения в маленькой камере, ночное освещение, питьевая и пищевая депривации и др.). Она широко используется для анализа механизмов депрессии и тестирования эффективности ан-тидепрсссаитов (Moreau et al., 1995; Strekalova et al., 2004; 2005; Henn, Vollmayr, 2005; Willner, 2005; Mineur et al., 2006; Onaivi et al., 2006; Wood et al., 2008).
Воздействие стрессоров, вызывающих соматосенсорный дискомфорт (принудительное плавание, болевое раздражение, подвешивание за хвост), используются и как типичные в поведенческих тестах на депрессию, и как модели развития депрессивного состояния. Это парадигмы — (.(.выученная беспомощность» и «поведенческое отчаяние» (Porsolt, 2000; Masuda et al., 2001; Urani et al., 2001; 2005; Alcaro et al., 2002; Chourbaji et al., 2005; Ducottet, Belzung, 2005; Henn, Vollmayr, 2005; McArthur, Borsini, 2006; Jacobson, Cryan, 2007).
Олъфакторная булъбэктомия также используется как модель депрессивного состояния (Holmes, 2003; Zueger et al., 2005; Mucignat-Careta et al, 2006; Slattery et al., 2007).
Экспериментальные модели, в частности дофамин-дефицитзависимый депрессивный синдром у крыс (Крупина и др., 2001), социальная депривация (Hall, 1998), пренатальный стресс (Cryan, Mombereau, 2004) и другие воздействия (Арушанян, Бейер, 2004; Шаляпина и др., 2006), анализировались меньше.
Генетически детерминированные модели депрессии подробно анализировались в ряде обзоров (Yoshikawa et al., 2002; Cryan, Mombereau, 2004; Crowley, Lucki, 2005; Cryan, Slattery, 2007; El Yacoubi, Vaugeois, 2007; Jacobson, Cryan, 2007; Rattray et al., 2009). Это направление развивается особенно интенсивно в последние годы, так как генетические факторы составляют 40 - 70% риска появления психопатологий. Такие модели особенно важны для обоснования молекулярных теорий депрессии. В настоящее время известно множество разных линий генетически модифицированных мышей, чей фенотип соответствует отдельным симптомам депрессивного состояния. Например, селекция мышей Swiss CD1 по беспомощности в тесте подвешивания за хвост (tail suspension test) с подробным анализом поведенческих характеристик явилась основой создания генетически детерминированной модели депрессии (Е1 Yacoubi, Vaugeois, 2007). Выраженные признаки депрессивноподобного состояния отмечались у мышей, полученных при скрещивании особей C57BL/6J и СЗН/Не (Yoshikawa et al., 2002) и селекционированных на высокую предрасположенность к каталепсии (Базовкина и др., 2005).
Известны линии крыс с выраженными проявлениями депрессивного поведения - крысы Roman Low Avoidance, Maudsley Reactive, Flinders Sensitive Line (Overstreet et al., 2005; Ramos et al., 2008), Wistar-Kyoto (Overstreet et al., 2005), WAG/Rij (Базян и др., 2001; Саркисова и др., 2002) и другие (Барыкина и др., 2002; Crowley, Lucki, 2005). 2.2. Поведенческие проявления аффективных состояний
Снижение двигательной и исследовательской активности, пассивность реакций на окружающие стимулы - наиболее характерные проявления депрессивноподобного поведения, которые проанализированы во множестве работ (Koolhaas et al., 1997; Кудрявцева, 1999; Yadid et al., 2000; Саркисова и др., 2002; Шаляпина и др., 2005; Anisman, Matheson, 2005; Willner, 2005; Jacobson, Cryan, 2007). Более подробно мы остановимся на других проявлешіях депрессивноподобного поведения.
Тревожность - это эмоциональное предчувствие аверсивной ситуации, которую трудно предугадать и контролировать. Тревожность представляет собой состояние, которое в зависимости от ситуации может быть естественной защитной реакцией организма или серьезной патологией (Rodgers, 1997; Августинович и др., 1998; Калуев, 1999; Belzung, Griebel, 2001; Ennaceur et al., 2006; Bourin et al., 2007; Bouwknecht et al., 2007; Clement et al., 2007; Ramos ct al, 2008). В настоящее время принято рассматривать ситуативную (state) и личностную (trail) тревожность. Ситуативная тревожность испытывается субъектом в определенный момент времени под влиянием стрессирующих, анксиогенных воздействий и оценивается преимущественно в тестах ПКЛ, открытое поле, светло/темная камера, при социальных взаимодействиях. Личностная тревожность является постоянной во времени и в ее проявления большой вклад вносит генетический компонент. Оценивается она в тестах "кубик", "перегородка" и парадигме свободного обследования.
По поводу существования связей между тревожностью и депрессией существует несколько гипотез (Ducottet, Belzung, 2005; Tronson et al., 2008). Первая - тревожность и депрессия рассматриваются как разные болезни и могут сосуществовать. Вторая - высокая тревожность является фактором риска для появления депрессии. Третья — концепция смешанной болезни тревожность/депрессия. Повышенный уровень тревожности отмечался на грызунах в разных моделях депрессивноподобного состояния (Кудрявцева, 1999; Alcaro et al., 2002; Holmes, 2003; Cryan, Holmes, 2005; Ducottet, Belzung, 2005). В то же время параллельный анализ тревожности и депрессивных реакций подтверждают точку зрения, что развитие депрессивноподобного состояния может происходить без генерализации тревожного поведения (Крупина и др., 2001; Mineur et al., 2006).
Особенности угашения условной реакции пассивного избегания мышей с разным уровнем тревожности
Для формирования и закрепления агрессивного и подчиненного типов поведения применяли модель сенсорного контакта (Кудрявцева и др., 1989). Животные рассаживались в экспериментальные клетки, разделенные на два отсека прозрачной перегородкой с отверстиями, исключающей физический контакт, но позволяющей особям видеть и воспринимать запахи друг друга. После двухдневного дистантного контакта самцов начинали ежедневное тестирование конфронтации, когда перегородку убирали, что приводило к агонистическому взаимодействию между ними. Столкновения проводили один раз в день по 10 мин. После трех дней агонистического взаимодействия животных с агрессивными реакциями оставляли в своем отсеке и для преду- преждения затухания агрессии производили смену субмиссивного партнера. Закрепление опыта побед и поражений осуществлялось при повторных столкновениях в течение 20 дней. В результате 20 конфронтации были сформированы две группы мышей - с субмиссивным и агрессивным стереотипами поведения.
Модель депрессивноподобного состояния - "поведенческое отчаяние" (Urani et al., 2001; Alcaro et al., 2002). Реакция «поведенческого отчаяния» формировалась как результат принудительного плавания в водном бассейне (3 дня по 5 мин, температура воды 20-22 С). Следует отметить, что однократное применение принудительного плавания используется как тест на депрессивноподобное состояние, а многократное — как модель депрессии (Masuda et al., 2001; Ducottet, Belzung, 2005). При выработке реакции «поведенческого отчаяния» отмечалось повышение времени неподвижности, которое сохранялось и при тестировании через 7, 15 и 20 дней.
Стрессовое воздействие. В качестве стрессового стимула применялось принудительное плавание в воде при температуре 23 - 25 в течение 3 минут, которое проводилось однократно за 1 час до обучения или непосредственно после него. Тест приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) использовался для определения исходного уровня тревожности. Лабиринт состоял из двух закрытых и двух открытых рукавов, расположенных крестообразно. Мышь помещалась в центр лабиринта носом к закрытому рукаву. Анализировали следующие показатели: время нахождения на открытых рукавах и в центре, число выходов на открытые рукава и свешиваний с них, количество выглядываний из закрытых рукавов, переходов из одного закрытого рукава в другой и вертикальных стоек, а также уровень дефекаций в течение 5 мин теста. Тест свет/темнота для оценки тревожности и реакции на новизну обстановки проводили при ознакомлении мышей с экспериментальной камерой для выработки рефлекса пассивного избегания. Регистрировали латентный период (ЛП) первого перехода в темный отсек, время пребывания в светлом отсеке, число переходов из отсека в отсек, вертикальных стоек, заглядываний в темный отсек, выглядываний из него и уровень дефекаций в течение 180 с. Мыши, не вошедшие в темный отсек в течение 180 с, выбраковывались из опыта. . Условная реакция пассивного избегания (УРПИ) является основным тестом при анализе процессов обучения и памяти. Популярность использования такой реакции обусловлена такими достоинствами, как быстрая, при однократном сочетании условного стимула с безусловным подкреплением, выработка условного навыка, стабильность памяти в течение длительного времени, высокая валидность метода (Gold, 1986). УРПИ использовалась нами в качестве экспериментальной парадигмы при анализе процессов обучения и угашения памяти о страхе. Выработка УРПИ в одном сочетании проводилась по общепринятой методике (Jarvik, Корр, 1967). Экспериментальная камера трапецевидной формы состояла из двух отделений. Светлый отсек (15 см длиной) освещался лампой 60 ватт, находящейся на уровне 50 см от верхнего края установки, темный (20 см длиной) — закрывался сверху светонепроницаемой крышкой. Пол камеры (3 см шириной) выполнен из двух металлических пластин, на которые в темном отделении подавался электрический ток. В перегородке между отсеками на уровне пола размещалось отверстие диаметром 3 см, закрываемое дверью. Каждую мышь помещали в светлый отсек хвостом к отверстию. В день выработки рефлекса, когда мышь разворачивалась и входила в темный отсек четырьмя лапами, отверстие закрывалось, и она получала электрокожное раздражение от стабилизированного по току сетевого источника интенсивностью 0,5мА и длительностью 1 с. Через 1 с дверь открывалась, мышь извлекалась из светлой половины камеры и переносилась в домашнюю клетку. Для проверки обучения УРПИ мышь через 24 часа после выработки помещалась в светлое отделение камеры хвостом к отверстию. Основным показателем выработки условного рефлекса служил ЛП перехода в темное отделение. Критерием хорошей выработки считался ЛП перехода, превышавший 80 с. Поведенческие проявления после выработки УР оценивали по показателям числа переходов из отсека в отсек, вертикальных стоек, заглядываний в темный отсек и выглядываний из него и уровню дефекаций. Максимальное время наблюдения за животным - 180 с. Угашение УРПИ представляло поведенческую процедуру, которая включала повторное многократное предъявление контекста экспериментальной установки без болевого стимула, то есть не сигнализирующего о страхе наказания в темном отсеке. При многократном тестировании в установке без наказания происходило снижение уровня воспроизведения выработанного навыка пассивного избегания. В настоящее время угашение рассматривается как процесс нового «тормозного» обучения, которое интерферируют с экспрессией ранее приобретенного активационного рефлекса (Bouton, 2004; Davis et al., 2006; Cain et al., 2007; Quirk, Mueller, 2008). В ситуации УРПИ мыши обучаются игнорированию темного отсека установки как «опасного». Процедура угашения длилась 13-25 дней после однократной выработки условного рефлекса. Для изучения пространственного и непространственного обучения самым распространенным является лабиринт Морриса (Morris, 1984). В пространственной версии от мыши или крысы требуется локализовать скрытую платформу в водном бассейне, используя внешние маркеры (вне бассейна), в непространственной версии - тест с видимой платформой (D Hooge, De Deyn, 2001; Stavnezer et al., 2002). В своих исследованиях мы использовали модифицированный лабиринт Морриса, представляющий прямоугольный бассейн длиной 60 см, шириной 30 см и высотой 45 см, заполненный водой до 22 см [Бобкова и др.. 2002]. Площадь бассейна условно делили на три равных сектора. Спасательная платформа была диаметром 5 см. Температура воды в бассейне составляла 22 — 24 С.
Обучение и угашение реакции пассивного избегания мышей с высокой предрасположенностью к каталепсии
Ранее на основе повышенной неподвижности в тестах Порсолта и tail suspension было высказано предположение о том, что мышей линии AS С можно рассматривать в качестве генетической модели депрессии (Базовкина и др., 2005). Результаты настоящего исследования и данные литературы являются вескими аргументами в пользу такого предположения. Подтверждением служат и данные о генетически модифицированных мышах с признаками де-прессивноподобного состояния. В частности, селекция мышей Swiss CD1 по беспомощности в тесте tail suspension (El Yacoubi, Vaugeois, 2007), полученные при скрещивании мышей линий C57BL/6J и СЗН/Не (Yoshikawa et al., 2002), а также при использовании других методик формирования депрессивного фенотипа грызунов (Crowley, Lucki, 2005; McArthur, Borsini, 2006; Jacobson, Cryan, 2007). Следует отметить, что когнитивный аспект развития депрессив-ноподобного поведения, в том числе угашение памяти о страхе, в этих работах не рассматривался.
Поскольку угашение является активным процессом нового обучения (Kamprath, Wotjak, 2004; Bouton et al., 2006; Bruchey et al., 2007; Myers, Davis, 2007), то нарушение его у мышей ASC указывает на дефект переучивания, который отражается в стойком сохранении страха перед темным отсеком, ставшим безопасным при длительном тестировании без наказания. Противоположная динамика протекания угашения мышей AS С, СВА и AKR, вероятно, связана с различной перестройкой эмоциональной реактивности на аверсивность окружающих стимулов после обучения при исчезновении угрозы. Причинами пролонгированности угашения памяти о страхе мышей линии ASC могут быть негативная оценка обстановки, изменение тревожносіи, свойственные особям с депрессивноподобным состоянием (Августинович и др., 2004; Masuda et al., 2001; Alcaro et al., 2002; Anisman, Matheson, 2005; Urani et al, 2005; Willner, 2005; Mineur et al., 2006). Хотя исследователями оценивалась лишь базовая тревожность, то есть тревожность перед началом выработки УР. В наших же опытах на повышенную тревожность в период угашения указывает высокий уровень дефекации мышей «депрессивной» линии AS С.
Относительно взаимоотношений тревожности и депрессии, тревожности и угашения памяти о страхе в литературе нет единого мнения (Willner, 2005; Delgado et al., 2006; Jacobson, Cryan, 2007; Ponder et al., 2007). Рассматриваются представления, что тревожность и депрессия - это разные болезни и что высокая тревожность является фактором риска для появления депрессии. Например, повышенный уровень тревожности отмечался на грызунах с реакцией «поведенческого отчаяния» (Alcaro et al., 2002; Holmes, 2003), в то время как непредсказуемый стресс вызывал депрессивноподобное состояние без генерализации тревожного поведения (Strekalova et al., 2005; Mineur et al., 2006). Ранее мы показали, что у мышей C57BL/6J, классифицированных в тесте «приподнятого крестообразного лабиринта» как высокотревожные, отсутствует угашение УРПИ. В то же время, при анализе исходного тревожного поведения в тестах ПКЛ, светло/темной камеры и открытого поля мыши ASC не отличались от мышей линии AKR (Базовкина и др.. 2005; Кондаурова и др., 2007). Хотя в настоящей работе показано меньшее число выглядываний из темного отсека (как индекс повышенной тревожности) при ознакомлении с экспериментальной светло/темной камерой. Представленные данные позволяют предположить, что исходный уровень тревожности не является достаточным критерием последующего развития угашения памяти о страхе, а повышенная тревожность во время угашения, скорее всего, способствует негативной оценке эмоциональной значимости контекстуальных стимулов камеры после аверсивного обучения. Не исключено, что нарушение угашения памяти о страхе у мышей ASC и быстрое переучивание у AKR связаны с выявленными высокими показателями амплитуды рефлекса вздрагивания у первых (Базовкина и др.. 2005; Кондаурова и др., 2007), если ее усиление считать мерой страха (Ponder et al., 2007).
При анализе проявлений депрессивноподобного состояния при использовании разных моделей (Willner, 2005), в том числе и у генетически детерминированной линии «депрессивных» мышей ASC (Кондаурова и др., 2007) отмечалось снижение агрессивного поведения. Возникает вопрос, не является ли этот эффект ответственным за нарушение угашения? Но как показывают наши результаты о задержке угашения мышей с импульсивной агрессией (мыши Tg8 с нокаутом гена моноаминоксидазы А) и сформированной при агонистических столкновениях (Дубровина, 2001; 2002; Дубровина и др., 2005; Popova et al., 2005), такое объяснение вряд ли правомочно.
Наблюдаемый стабильно высокий уровень воспроизведения ассоциаций между контекстуальными стимулами экспериментальной установки и болевым наказанием в темном отсеке у мышей ASC может обеспечиваться низкой активностью подкрепляющих систем "награды-удовольствия", что отмечалось для особей депрессивного фенотипа (Anisman, Matheson, 2002; Strekalova et al., 2005; Onaivi et al., 2006; Bruchey et al., 2007). Однако это требует дополнительного исследования.
Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о дифференцировашюсти развития угашения следа памяти о страхе мышей линий ASC, СВА и AKR. У мышей ASC, селекционированных на высокую предрасположенностью к каталепсии, нарушен процесс угашения выработанной УРПИ, что подтверждает предположение о рассмотрении их в качестве генетической модели депрессии. Задержка угашения выявлена у мышей каталептической линии СВА, а мыши AKR быстро переучивались оценке «опасного» темного отсека установки как безопасного при тестировании без наказания.
Как следует из обзора литературы, исследования значимости генетически детерминированных стратегий поведения при анализе тревожности, страха, эмоциональной реактивности с использованием разных тестов показали достаточно противоречивую картину (Августино-вич и др., 1998; Brooks et al., 2004; Ducottet, Belzung, 2005; Millstein, Holmes, 2007; Moy et al., 2007; Yee et al., 2009). Также очевидно, что память о страхе имеет существенный генетический компонент. В мире есть лишь несколько попыток исследования процесса угашения у мышей разных линий (Adams et al., 2002; Balogh, Wehner, 2003; Waddell et al., 2004).
Поэтому мы провели сравнительный анализ динамики угашения УРПИ у мышей C57BL/6J (n = 15), BALB/c (n = 10), CBA/Lac (п = 10), AKR/J (п - 12), DBA/2J (n = 10) и СЗН/HeJ (n = 10). При ознакомлении с экспериментальной установкой получены следующие характеристики реакции на новизну (рис. 11).
