Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 17
1.1. Нейробиологические процессы, определяющие особенность поведения как отражения адаптационных реакций организма на разных этапах онтогенеза
1.2. Роль функциональной межполушарной асимметрии в адаптационных реакциях организма
1.3. Методы изучения поведения и связанные с ним нейрохимические процессы. Нейропластичность
1.4. Роль пептидов и нейромедиаторов в регуляции функций мозга 52
ГЛАВА 2. Методы исследования 59
2.1. Работа с животными 59
2.2. Физиологические методы исследования 62
2.2.1. Модели ишемии мозга 62
2.2.2. Моделирование гемической и гипобарической гипоксической гипоксии 64
2.2.3. Водный лабиринт Морриса 64
2.2.4. Метод «Открытого поля» 65
2.2.5. Метод определения латерального профиля крыс 66
2.2.6. Метод выработки условной реакции активного избегания 67
2.2.7. Методы оценки неврологических нарушений у крыс 68
2.2.8. Оценка объема зоны инфаркта 69
2.3. Биохимические методы исследования 69
2.3.1. Определение содержания моноаминов и активности моноаминооксидазы-А в мозге крыс 69
2.3.2. Определение активности и содержания каспазы-3 72
2.3.3. Определение продуктов свободнорадикального окисления 73
2.3.4. Метод определения концентрации IL-6 и TNF- в сыворотке крови 73
2.4. Статистическая обработка результатов исследования 74
ГЛАВА 3. Влияние разных факторов на устойчивость организма к ишемии/гипоксии мозга 75
3.1. Влияние разных видов ишемии гипоксии мозга (пренатального стресса, ОСА и ОГГ) на показатели устойчивости организма 75
3.1.1. Влияние пренатальной гипоксии на поведение, латентное обучение и нейрохимические показатели крыс 75
3.2. Влияние окклюзии сонных артерий и острой гипоксической гипоксии на выживаемость, поведение и нейрохимические показатели крыс 3-4- и 18-месячного возраста 89
3.2.1. Влияние окклюзии сонных артерий и острой гипоксической гипоксии на выживаемость крыс 3-4- и 18-месячного возраста 89
3.2.2. Влияние острой гипоксической гипоксии на латентное обучение,
активность и содержание активной каспазы-3 в мозге 3-4-месячных крыс 91
3.2.3. Свободнорадикальные процессы и нейромедиаторный баланс при окклюзии сонных артерий у 3-4-месячных крыс 91
3.2.4. Влияние окклюзии сонных артерий и острой гипоксической гипоксии на показатели поведения, обучения и нейрохимический статус крыс 18-месячного возраста 97 3.3. Роль функциональной межполушарной асимметрии мозга в устойчивости организма к ишемическим/гипоксическим воздействиям 107
3.3.1. Влияние окклюзии соредней мозговой артерии на выживаемость, объем инфаркта и неврологический статус крыс с разным латеральным профилем 107
3.3.2. Влияние окклюзии сонных артерий на условно-рефлекторную реакцию активного избегания крыс с разным латеральным профилем 118
3.3.3. Влияние окклюзии сонных артерий на нейрохимические показатели крыс с разным латеральным профилем, которым вырабатывали условную реакцию активного избегания 123
3.3.4. Изменение нейромедиаторного баланса в мозге 3-4-месячных
крыс с разным латеральным профилем при окклюзии сонных артерий 133
ГЛАВА 4. Влияние пептидных препаратов на обучение, поведение и нейрохимические показатели в разных моделях ишемии/гипоксии мозга 145
4.1. Влияние пептидных препаратов на показатели устойчивости к пренатальному стрессу 145
4.2. Влияние пептидных препаратов на показатели устойчивости к ишемии/гипоксии мозга крыс 3-4 месяцев 163
4.2.1. Влияние пептидных препаратов на свободнорадикальные процессы в мозге крыс в модели окклюзии сонных артерий 163
4.2.2. Влияние пептидных препаратов на латентное обучение 3-4 месячных крыс в модели острой гипоксической гипоксии 168
4.2.3. Влияние пептидных препаратов на активность каспазы-3 у 3-4-месячных крыс в модели острой гипоксической гипоксии 170
4.2.4. Влияние пептидных препаратов на поведение 3-4месячных крыс в модели острой гипоксической гипоксии 173
4.2.5. Влияние пептидных препаратов на медиаторный баланс в мозге 3-4 месячных крыс при острой гипоксической гипоксии 181
4.3. Влияние пептидных препаратов на показатели устойчивости к ишемии/гипоксии мозга крыс 18 месяцев 186
4.3.1. Влияние кортексина и пинеалона на выживаемость и поведение старых крыс, подвергнутых окклюзии сонных артерий 186
4.3.2. Влияние пептидных препаратов и острой гипоксической гипоксии на латентное обучение 18-месячных крыс 196
4.3.3. Влияние кортексина и пинеалона на содержание моноаминов в структурах мозга 18-месячных крыс при подвергнутых окклюзии сонных артерий 198
4.3.4. Влияние пептидных препаратов на активность каспазы-3 в мозге и содержание интерлейкинов в сыворотке крови 18-месячных крыс в модели острой гипоксической гипоксии 209
4.4. Результаты дисперсионного анализа сравнения исследованных показателей 214
Заключение 222
Выводы 252
Список литературы 2
- Роль функциональной межполушарной асимметрии в адаптационных реакциях организма
- Моделирование гемической и гипобарической гипоксической гипоксии
- Влияние окклюзии сонных артерий и острой гипоксической гипоксии на выживаемость, поведение и нейрохимические показатели крыс 3-4- и 18-месячного возраста
- Влияние пептидных препаратов на свободнорадикальные процессы в мозге крыс в модели окклюзии сонных артерий
Введение к работе
Актуальность исследования
Зрительная система человека и животных способна эффективно фиксировать паттерн интенсивности света, отражённого от различных объектов (предметов, живых существ и пр.) и извлекать из него биологически значимую информацию. В результате дальнейшей обработки этой информации происходит формирование внутреннего представления объектов внешнего мира в мозге, на основании которого формируется адекватное поведение. В основе первичных этапов обработки информации лежит принцип детекции значимых признаков изображения, которые впоследствии кодируются активностью одиночных нейронов-детекторов зрительной коры и их функциональными ансамблями.
По преобладающим в современной науке представлениям пространственно-позиционное кодирование, при котором реакция нейронов оценивается количеством импульсов на появление стимула в определенной области поля зрения, считается основным принципом представления информации о признаках изображения в зрительной коре (Hubel & Wiesel, 1962). Кроме того, активно обсуждается возможность частотного кодирования (Perkel & Bullock, 1969), что косвенно подтверждается данными о кодировании информации об изменениях стимула в паттерне импульсного разряда (Richmond & Optican, 1990). Дополнительно частотное кодирование может быть связано с полученными ранее экспериментальными данными о динамике рецептивных полей (РП) нейронов зрительной коры, вызванной предъявлением зрительных стимулов разной степени сложности (Шевелев, 1984; Das & Gilbert, 1995; DeAngelis et al., 1993a; Malone et al.; 2007; Ringach, 2004).
Предшествующие исследования показали, что настройка детектирующих определенные характеристики сенсорного сигнала нейронов может изменяться. Такие изменения могут длиться от десятков до сотен миллисекунд после предъявления стимула, и они были обнаружены как в первичных областях зрительной коры (Шевелев, 1984; Hedge, van Essen, 2004), так и в первичной слуховой коре (Gaucher et. al., 2013). В области V1 были описаны быстрые изменения ширины ориентационной настройки нейронов (Шевелев, 1984; Xing et al., 2005), а также динамика предпочитаемой ориентации за время генерации ответов на полоску (Shevelev et al., 1993) и крестообразную фигуру (Лазарева и др., 2003). По данным (Mulas et. al., 2013) паттерн нейронного разряда меняется в зависимости от ориентации стимула. Все перечисленные исследования указывают на возможность частотного кодирования информации о признаках изображения. Было высказано предположение, что перевод пространственно-временного кода в позиционный и
4 передача информации о зрительном стимуле из области V1 в другие отделы зрительной коры может осуществляться волновыми процессами (Шевелев, 2010). Для проверки данной гипотезы необходимо провести анализ частотных составляющих динамики РП и ориентационной настройки нейронов, которые происходят в последовательные промежутки времени после предъявления стимула. Для данной цели в представленной диссертационной работе был использован метод оценки динамических характеристик нейронного разряда с помощью временных срезов, что позволяет отследить изменения в структуре как рецептивных полей нейронов, так и их ориентационных предпочтениях по мере развития ответа. Были выявлены основные частотные компоненты указанных изменений, совпадающие по частоте с основными физиологическими ритмами мозга. Полученные данные дополняют полученные ранее сведения о том, что альфа-активность способна модулировать частоту спонтанной и вызванной активности нейронов в различных отделах зрительного анализатора (см. обзоры: Базанова, 2009; Steriade et al., 1990).
Ранее исследовательский коллектив под руководством академика И.А.Шевелева обнаружил в первичной зрительной коре кошки две функциональные группы нейронов, названные «сканерами» и «таймерами». К сканерам были отнесены клетки, у которых после предъявления стимула предпочитаемая ориентация последовательно смещалась в определенном диапазоне. В группу таймеров вошли нейроны со стабильной настройкой за время генерации ответа, которые своим разрядом могли задавать «реперную точку», от которой ведется отсчет времени для частотного кодирования зрительной информации (Шевелев и Шараев, 1985; Shevelev et al., 1993). Однако оставался открытым вопрос о локализации данных функциональных групп нейронов в рабочих модулях коры. Известно, что основной функциональной единицей первичной зрительной коры является ориентационная колонка (Hubel & Wiesel, 1962). По данным оптического картирования мозга по внутреннему сигналу у кошек и обезьян эти функциональные модули с полным набором ориентаций сходятся в одном центре, образуя ориентационную гиперколонку (Bartfeld & Grinvald, 1992). Современное оптическое картирование позволяет объединить этот метод исследования с классическими регистрациями экстраклеточной активности в первичной зрительной коре и ответить на вопрос о локализации нейронов «сканеров» и «таймеров» в рабочих модулях коры. Анализ полученных в ходе выполнения работы экспериментальных данных подтвердил гипотезу о предпочтительной локализации нейронов «таймеров» в центрах ориентационных гиперколонок.
Цель исследования
На основе анализа динамических изменений характеристик рецептивных полей и
5 ориентационной настройки нейронов первичной зрительной коры за время развития ответа выявить возможные механизмы, обеспечивающие организацию частотного кодирования зрительной информации.
Задачи исследования
1. Разработать математический аппарат для изучения частотных составляющих
динамики РП и ориентационной настройки нейронов первичной зрительной коры.
2. Провести анализ динамических изменений характеристик РП нейронов области V1 и
определить их спектральный состав.
-
Сравнить динамику предпочитаемой ориентации у нейронов, расположенных в ориентационных колонках и центрах ориентационных гиперколонок (ЦОГ) области V1.
-
Исследовать ритмические и неритмические составляющие нейронного ответа на ориентацию полоски и их взаимосвязь с детекторными свойствами нейрона.
Научная новизна работы
Методическая новизна данной работы состоит в сочетании функционального картирования мозга с классическими исследованиями клеточной активности с помощью микроэлектродной регистрации. Дополнительно был разработан адекватный математический аппарат для анализа спектрального состава изменений частоты появления спайков для короткого промежутка времени (около 100-300 мс). Для данной цели был применен метод непрерывного Фурье-анализа (для исследования динамики площади и веса РП) и серии полосовых цифровых фильтров, настроенных на заранее определённые диапазоны (для исследования функции плотности спайков). Использование Фурье-анализа позволило обнаружить, что динамика характеристик РП нейронов V1 содержит в своём составе высокочастотные колебания в диапазоне альфа- и бета-ритмов ЭЭГ и низкочастотную составляющую. Подобный многокомпонентный состав динамики РП описан впервые.
В работе впервые было установлено, что ответы нейронов V1 на ориентацию полоски содержат в своём составе суперпозицию нескольких компонент, обладающих следующими свойствами: 1) каждая из этих компонент имеет свою, уникальную форму; 2) они формируются независимо друг от друга; 3) различные компоненты вносят максимальный вклад в нейронный ответ при разных ориентациях стимулов. За время развития ответа может происходить смена преобладания одной составляющей на другую, и это соответствует динамическим изменениям предпочитаемой ориентации.
Удалось также выяснить, что в основе этих составляющих лежат колебательные процессы, проходящие на частотах, соответствующих альфа-, бета- и тета-ритмам ЭЭГ, а
6 также непериодические компоненты: фазические длительностью несколько десятков миллисекунд, и тонические длительностью несколько сотен миллисекунд. Это позволило сделать предположение, что формирование такого ответа может происходить за счёт вертикальных связей (Louis & David, 2011), а также модулирующего влияния ритмической активности зрительной коры и локальных внутрикорковых связей (Volgushev et. al., 2000; Xing et. al., 2005), а распространяться по всей коре они могут посредством автоволновых процессов (Prechtl et. al., 2000; Shevelev, 1998b). В свою очередь, показанное впервые в настоящей работе соответствие между свойствами нейронного ответа и наличием динамики предпочитаемой ориентации (ПО) позволяет предположить, что вышеуказанные механизмы также участвуют и в формировании динамических изменений предпочитаемой ориентации.
Благодаря одновременному использованию оптического картирования и микроэлектродной регистрации, в центрах ориентационных гиперколонок впервые были обнаружены нейроны со стабильной ориентационной настройкой, которые обладают наиболее коротким латентным периодом и наиболее сильной реакцией на оптимальную ориентацию стимула среди всех исследованных клеток. Это на наш взгляд дополнительно подтверждает гипотезу о наличии в первичной зрительной коре нейронов-таймеров, играющих важную роль в формировании динамики ПО в V1.
Практическая значимость работы
Основная ценность данной работы лежит в плоскости фундаментальных исследований, поскольку накопленные в работе данные дополняют известные в нейрофизиологии зрительного восприятия сведения о механизмах опознания элементарных признаков изображения, осуществляемых первичной зрительной областью. Однако полученный результат может быть использован для конструирования искусственных детекторов признаков изображения, в основе работы которых будут заложены наблюдаемые в естественных нейронных сетях принципы. Кроме того, выявленные функциональные типы нейронов могут быть внедрены в искусственные нейронные сети, задействованные в анализе сложных изображений. Понимание принципов частотного кодирования в области V1 может быть важным при конструировании зрительных нейропротезов. Разработан математический аппарат, который может быть применен для анализа компонент (составляющих) любых видов динамики нейронных ответов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Ритмические процессы в зрительной коре головного мозга оказывают модулирующее воздействие на динамику рецептивных полей и ориентационной настройки нейронов в V1 и
7 способствуют распространению информации между функциональными модулями коры.
2. Изменение частоты импульсного разряда нейронов V1 в ответ на зрительную
стимуляцию обусловлено несколькими независимыми динамическими компонентами,
каждый из которых принимает участие в формировании динамики ориентационной
настройки клеток коры.
3. В центрах ориентационных гиперколонок локализованы нейроны со специфическими
свойствами разряда, обеспечивающими генерирование «реперного» сигнала, необходимого
для кодирования информации о признаках изображения.
Апробация работы
Основные материалы диссертационной работы докладывались на международных конференциях: Neuroscience в 2013 г. (г. Сан Диего, США), 8th FENS Forum of European neuroscience в 2012 г. (г. Барселона, Испания), 7th FENS Forum of European Neuroscience в 2010 г. (г. Амстердам, Нидерланды), 8th IBRO World Congress в 2011 г. (г. Флоренция, Италия), XXII Съезд физиологического общества им И.П. Павлова в 2013 г. (г. Волгоград, Россия), XVI Международной конференции по нейрокибернетике в 2012 г. (г. Ростов-на-Дону, Россия), а также на Выездной сессии ОФФМ РАН «От детектора признака к единому зрительному образу», посвящённой 80-летию со дня рождения академика И.А. Шевелёва. Кроме того, полученные результаты также были доложены на Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» в 2009 и 2010 годах, всероссийских научных конференциях «Актуальные проблемы фундаментальных и прикладных наук в современном информационном обществе» в 2008 и 2009 годах, конференциях молодых учёных в Учреждении российской академии наук ИВНД и НФ РАН в 2008 и 2009 годах.
Апробация диссертации была проведена 16 декабря 2013 года на совместном заседании лаборатории физиологии сенсорных систем (зав. – д. б. н. Бондарь Игорь Вячеславович) и лаборатории условных рефлексов и физиологии эмоций (зав. – д. б. н. Мержанова Галина Христофоровна) Института ВНД и НФ РАН.
По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объём диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 161 странице, иллюстрирована 39 рисунками и 1 таблицей, содержит в себе 9 формул. Список
8 литературы включает в себя 162 источника, из них 19 – на русском языке и 146 – на иностранных языках.
Объект исследования
Все эксперименты были проведены на 180 нейронах первичной зрительной коры (V1), зарегистрированных у 39 анестезированных кошек (Felis domesticus) весом 2.5-3.5 кг. В исследование были включены только те ответы, амплитуда которых превышала уровень фоновой активности более чем на два стандартных отклонения.
Эксперименты были проведены в соответствии с протоколом, утверждённым Комиссией по обращению с животными Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН в соответствии с общепринятыми международными правилами (публикация № 86-23 Национального института здоровья США «Руководство по уходу и использованию лабораторных животных») и национальным законодательством.
Общая схема исследования
Для выполнения целей и задач диссертационной работы были поставлены три серии опытов.
Первая серия опытов (47 нейронов) проведена с целью качественно и количественно описать изменения возбудительных зон on- и/или off-рецептивных полей (РП) нейронов за время развития ответа на вспыхивающий стимул при классическом и сочетанном картировании (см. ниже).
Вторая серия опытов (84 нейрона, 152 on- и/или off-ответа) проводилась с целью исследования динамики предпочитаемой ориентации (ПО) нейрона и её зависимости от локализации клетки в функциональных модулях V1: ориентационных колонках и центрах ориентационных гиперколонок (ЦОГ).
В третьей серии опытов (49 нейронов) исследовали взаимодействие между двумя нейронами, находящимися в разных функциональных модулях V1, и его взаимосвязь с динамикой ПО (47 пар нейронов). На основе данных, полученных в третьей серии, проведён анализ частотных компонент нейронных ответов и их взаимосвязь со свойствами динамики ориентационной настройки.
Операция
В первой серии опытов животных анестезировали смесью золетила и рометара (10 мг/кг,
9 внутримышечно), а во второй и третьей – смесью гидрохлорида золетила (10-15 мг/кг) и вентраквила (30-40 мг/кг). После того, как достигалась хирургическая стадия наркоза, животные были иммобилизованы ардуаном (200-400 мкг/кг, 10%-ный раствор, внутримышечно) и переведены на искусственное дыхание. Череп трепанировали над полем 17 зрительной коры со стороны, контралатеральной стимулируемому глазу (P=0.5-3 мм, L=0.5-2 мм).
Во время эксперимента в качестве основного анестетика применяли пропофол, который в течение всего эксперимента непрерывно вводили внутривенно со скоростью 2-4 мг/кг/ч, что обеспечивало постоянный и контролируемый уровень анестезии. Каждые 6 ч дополнительно делали подкожную инъекцию анальгетика общего действия бутомидора (2-4 мг/кг), а также каждые 12 ч – противовоспалительного препарата дексаметазона (2-4 мг/кг). Каждые 1.5-2 ч внутривенно инъецировали ардуан (200 – 400 мкг/кг) для дополнительной релаксации животного. Функциональное состояние контролировали по содержанию CO2 в выдыхаемом воздухе (3.8-4.0%), уровню насыщения крови кислородом (99.0%), частоте сердечных сокращений (110-140 уд/мин) и температуре тела (38.5 С). Размер зрачка стабилизировали атропином (1%). Сокращения мигательной перепонки глаза добивались с помощью неосинефрина (10%), а веки дополнительно раскрывали. Роговицу глаз предохраняли от высыхания жесткой контактной линзой, один глаз закрывали непрозрачной перегородкой.
Оптическое картирование по внутреннему сигналу
Оптическое картирование проводили во второй и третьей сериях опытов сразу же после операции. Оно позволяло построить функциональные карты V1, по которым определялось положение различных функциональных модулей.
В основе этого метода лежат метаболические процессы, связанные с увеличением потребления энергии активированными нейронами. Такие процессы приводят к увеличению концентрации дезоксигемоглобина в локальном кровотоке, а значит и изменению цвета активированного участка коры, его отражающей способности. Последнюю регистрируют, подсвечивая кору светом определённого спектрального состава и регистрируя в режиме реального времени изменение пространственного распределения интенсивности отражённого света.
В работе использовался подход к оптическому картированию, предложенный В. Калацким (Бондарь и др., 2011; Kalatsky et. al., 2003). В основе этого метода лежит непрерывная стимуляция коры, сочетаемая с длительной синхронизованной записью изменений пространственного распределения интенсивности отражённого света.
10 Получаемые в результате такой стимуляции большие массивы данных обрабатываются с помощью анализа Фурье, который позволяет выделить периодический картирующий сигнал в каждой точке коры и связать его с определенной фазой цикла стимуляции. В конечном итоге становится возможным построение двух типов функциональных карт коры: фазовых и амплитудных. На фазовых картах отображается, какая ориентация приводит в том или ином пикселе к максимальному ответу, а на амплитудных — реакцию нейронов на решётку оптимальной ориентации.
При использовании стимула в виде периодически меняющих ориентацию решеток на фазовых картах становится возможным выявление ориентационных колонок и ЦОГ. Особенно хорошо ЦОГ выявляются на амплитудных картах, где они выглядят как темные области. Полученные функциональные карты можно совмещать с картой сосудов коры и использовать их для погружения микроэлетрода в определённый функциональный модуль.
Отведение экстраклеточной активности отдельных нейронов
Экстраклеточную активность нейронов V1 в первой и второй сериях опытов отводили с помощью микроэлектрода сопротивлением 3-5 МОм, а в третьей серии опытов – с помощью двух таких же микроэлектродов. Сигнал от микроэлектрода поступал на предусилитель с малым усилением (10-100), входное сопротивление которого было много больше сопротивления микроэлектрода. После прохождения через предусилитель сигнал направлялся на основной усилитель, где он увеличивался в 1000-2000 раз, что позволяло на выходе регистрировать потенциалы действия с амплитудой 100-200 мВ. Дополнительно сигнал проходил через фильтр с полосой пропускания 500 Гц — 20 кГц. В некоторых случаях для большего уменьшения влияния сетевой наводки частотой 50 Гц после основного фильтра сигнал дополнительно пропускался через режекторный фильтр с полосой заграждения 49-51 Гц. После этих стадий обработки сигнал отображался на осциллографе и подавался на динамики для качественного анализа, а также на аналоговый вход устройства Spike2 (Cambridge Electronic Devices, Великобритания) для количественного анализа и последующей записи на жёсткий диск. При этом с одного и того же микроэлектрода регистрировалась активность 2-4 нейронов одновременно.
Стимуляция. Световые стимулы яркостью 57.3 кд/м2 и длительностью 400 мс вспыхивали на экране монитора, расположенного на расстоянии 57 см от глаза животного. При таком расстоянии 1 град. соответствовал 1 см на экране. Они предъявлялись с интервалом 2000 мс, а их форма и порядок предъявления зрительных стимулов зависели от конкретной серии опытов. Фоновая освещённость поддерживалась на уровне 0.84 кд/м2.
Для всех трёх серий опытов вначале проводили классическое картирование, при
11 котором РП тестировали световыми пятнами диаметром 0.5-0.75 град., предъявляемыми в случайном порядке в точках матрицы 10x10.
После этого во всех трёх сериях опытов определяли ориентационную настройку нейрона, для чего производили тестирование нейрона полосками различных ориентаций, вспыхивающих строго в центре РП нейрона. Их размеры составляли (68)x(0.20.3) град, а ориентацию меняли случайно в пределах от 0 до 157.5 с шагом в 22.5. Полоску одной и той же ориентации предъявляли 20-30 раз.
В первой серии опытов после этого дополнительно проводили сочетанное картирование, при котором РП тестировали таким же образом, что и при классическом картировании, но разрядный центр нейрона дополнительно раздражали небольшой полоской оптимальной ориентации размером (24)x0.4 град., двигающейся в центре РП асинхронно относительно тестирующего стимула. Это делали для получения карт РП при более высокой степени активации нейрона. Во второй и третьей сериях опытов сочетанного картирования не проводили.
Анализ экспериментальных данных
Вначале все последовательности потенциалов действия, зарегистрированные при помощи одного микроэлектрода, отделяли друг от друга. Для этого вначале определяли три параметра, однозначно характеризующие форму нервного импульса (три главные компоненты), после чего по критерию этих параметров проводили кластерный анализ, выделяя 2-4 группы спайков. И, наконец, каждой группе ставили в соответствие определённый нейрон.
В первой серии опытов методом временных срезов исследовали характер изменений возбудительных зон РП, проходящих за время развития ответа (динамики РП). Для каждого среза получали карты РП, по которым оценивали площадь возбудительной зоны (количество всех активированных локусов карты), её вес (сумма ответов от всех активированных локусов карты) и строили график зависимости этих характеристик от времени после предъявления стимула. Медленные апериодические изменения динамики характеристик РП выделяли из этих временных зависимостей при помощи низкочастотной цифровой фильтрации (FIR-фильтр порядка 20-40, полоса пропускания для каждого случая выбиралась индивидуально). После этого определяли параметры периодических компонент. Для этого сначала проводили дифференцирование исходных динамических зависимостей, а после чего определяли частоту получившихся производных путём подбора такой синусоиды, форма которой в наибольшей степени совпадала с формой указанных колебаний.
Во второй серии опытов при помощи метода временных срезов проводили построение
12 изменений предпочитаемой ориентации (ПО), проходящих за время развития ответа. Дополнительно определяли интегральные характеристики ответа, такие, как: 1) латентный период реакции нейрона на предъявление полоски каждой ориентации; 2) общее число импульсов и максимальную частоту импульсации в ответе на предпочитаемую ориентацию; 3) ширину ориентационной настройки, селективность и глубину селективности.
В третьей серии опытов проводили анализ динамики ПО нейронов в ориентационных колонках и ЦОГ. Кроме этого, изучали:
а) взаимодействие между нейронами при помощи построения спайковых
кросскоррелограмм для пар нейронов, где один нейрон располагался в центре
ориентационной гиперколонки, а другой – в ориентационной колонке. Спайковые
кросскоррелограммы строили в виде графиков, показывающих, с какой вероятностью после
генерации спайка одним нейроном формируется потенциал действия на другом нейроне. При
построении кросскоррелограммы учитывались только те спайки, которые были обусловлены
синаптическим взаимодействием между нейронами;
б) выделение и анализ различных составляющих нейронного ответа. Вначале для
ответов на каждый стимул строили функцию плотности спайков (spike density function, SDF),
после этого использовали метод главных компонент (Principal Component Analysis, PCA),
суть которого заключалась в том, что ответ нейрона на любой стимул представляли как
взвешенную сумму нескольких временных зависимостей, которые назывались главными
компонентами. Для каждой компоненты определяли спектральный состав, последовательно
применяя к ней фильтры Баттерворта четвёртого порядка со следующими полосами
пропускания: 0-4 Гц, 4-8 Гц, 8-13 Гц, 13-30 Гц, 30-80 Гц.
Роль функциональной межполушарной асимметрии в адаптационных реакциях организма
В результате проведенной работы показаны различия в устойчивости организма к ишемии/гипоксии разной интенсивности и влиянию пептидных препаратов на физиологические механизмы регуляции поведения крыс разного возраста. Установлено, что обучаемость животных зависит от влияния разных факторов (возраста, характера стрессового воздействия и/или введения пептидных препаратов) на систему каспазы-3 в структурах мозга. Эти данные могут быть использованы для определения стратегии применения пептидных препаратов в неврологической практике у пациентов разных возрастных групп.
Полученные результаты о влиянии ишемии/гипоксии мозга и введения пептидных препаратов на свободнорадикальные процессы, медиаторный баланс в мозге и содержание интерлейкинов в сыворотке крови могут служить теоретическим обоснованием разработки новых подходов к терапии заболеваний, связанных с гипоксией/ишемией мозга.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Способность к обучению крыс на разных этапах онтогенеза сопоставима с возрастными изменениями активности каспазы-3 в мозге: между активностью каспазы-3 в мозге и степенью обучаемости существует колоколообразная зависимость.
2. Онтогенетические изменения в содержании моноаминергических медиаторов являются одним из факторов, определяющих возрастные особенности структуры поведения животных.
3. Нарушение поведения у животных разного возраста в моделях ишемии/гипоксии мозга коррелирует с уменьшением содержания норадреналина в мозге, а также со снижением нейрохимической и моторной асимметрии.
4. Введение пептидных препаратов животным разного возраста в моделях ишемии/гипоксии мозга способствует улучшению мнестических функций, способствует снижению влияния стресса на структуру поведения. Апробация работы. Основные результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на Европейском форуме по нейронаукам (Брайтон, Великобритания, 2000), XXX совещании по проблемам высшей нервной деятельности (Санкт-Петербург, 2000), Международной конференции «Свободные радикалы и антиоксиданты в развитии и функциях центральной нервной системы: от рождения до старости» (Санкт-Петербург, 2001), XVIII съезде физиологов России (Казань, 2001), II Всероссийской научно-практической конференции «Социальные, медико-биологические и гигиенические аспекты здоровья» (Пенза, 2004), научной конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), 4-й национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2005), VII Всероссийской конференции «Нейроэндокринология» (Санкт-Петербург, 2005), IV межвузовской международной конференции «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2005), I съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), VIII Мировом конгрессе «International society for adaptive medicine (ISAM)» (Москва, 2006), IV Международной научно-практической конференции «Новые медицинские технологии в охране здоровья здоровых, в диагностике, лечении и реабилитации больных (МК-13-46)» (Пенза, 2006), XIII Международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), Международной конференции «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2006), V съезде кардиологов Южного федерального округа (Кисловодск, 2006), Всероссийской конференции с международным участием «Структурно-функциональные, нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 2007), I Международной научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2007), II научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы науки и образования» (Варадеро, Куба, 2007), Европейском конгрессе интернациональной ассоциации геронтологов (Санкт-Петербург, 2007), II научной конференции с международным участием «Фундаментальные исследования» (Доминиканская Республика, 2007), IV научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Тайланд, 2007), IV научной международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (Гоа, Индия, 2007), XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга – Москва, 2010), Всероссийской научной конференции «Модернизация науки и образования» (Махачкала, 2011), Научно-практической конференции с международным участием «Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга» (Ростов-на-Дону, 2011), VIII международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2012), V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2013), XXII съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Волгоград – Москва, 2013). Публикации. По теме диссертации опубликовано 57 научных работ, в том числе 15 статей в журналах по списку ВАК РФ, 1 монография.
Структура работы. Диссертация изложена на 308 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, двух глав, содержащих изложение результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы содержит 517 источников, из них 248 отечественных и 267 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 66 таблицами и 52 рисунками.
Моделирование гемической и гипобарической гипоксической гипоксии
В условиях гипоксии накапливаются активные формы кислорода (АФК), в частности супероксид-анион, который в присутствии супероксиддисмутазы (СОД) диспропорционирует на кислород и перекись водорода. В свою очередь, перекись водорода вступает в реакцию со свободными ионами железа и меди, что сопровождается образованием высокотоксичных гидроксильных радикалов, мишенями для которых являются полиненасыщенные жирные кислоты клеточных мембран и молекула ДНК. Повреждение последней приводит к клеточной гибели, индукторами которой служат ряд ферментов, в том числе семейство каспаз (Cкулачев, 2001).
Молекулярные процессы апоптоза запускаются в цитозоле или мембранных органеллах клетки, но реализуются исключительно в ядре через репрессию генов и необратимый процесс межнуклеосомной фрагментации ДНК. В большинстве клеток такую фрагментацию ДНК катализируют Са2+/Mg2+-зависимые эндонуклеазы, которые работают на линкерных участках макромолекулы (Rich et al., 2000), поэтому хроматин не подвергается полному лизису, а лишь фрагментируется. Расщепление ДНК происходит в несколько этапов с формированием все более мелких фрагментов. Сначала образуются фрагменты, включающие 700, 200–250, 50– 70 тыс. пар оснований. Микроскопически этот этап определяется как конденсация хроматина с выпячиванием ядерной оболочки (Ярилин, 2001). Затем – фрагменты, содержащие 30–50 тыс. пар оснований (Steller, 1995). На этой стадии происходит инвагинация ядерной мембраны. На последнем этапе происходит расщепление ДНК в участках сцепления нуклеосом и образование фрагментов из 180–190 пар нуклеотидов (Сладкова и др., 2000; Yan, Shi, 2005).
Факторы, инициирующие апоптоз, чрезвычайно многообразны: гипоксия, высокая температура, ионизирующая радиация, ультрафиолетовое излучение и др. При этом существует несколько механизмов индукции апоптоза: мембранные, митохондриальные и ядерные (Владимирская, 2002). Мембранные, или рецептор-опосредованные факторы включают реализацию апоптогенного сигнала через специальные рецепторы, С-концевой внутриклеточный домен которых (death domen, DD) способен инициировать дальнейшие этапы развития апоптоза. Рецепторы гибели расположены на поверхности клетки и служат сенсорами внеклеточных сигналов к апоптозу. Эти сигналы подаются рецептор-специфическими лигандами, которые могут быть сцеплены с мембраной или находиться в растворимой форме. Взаимодействие «лиганд – рецептор» мгновенно привлекает к зоне интереса молекулы, преобразующие сигнал к апоптозу. Наиболее изученными и имеющими, вероятно, наибольшее биологическое значение являются специфические рецепторы Fas (APO-1/CD95) (Петухов, 2000), образованные комплексом трансмембранных протеинов, входящие в суперсемейство цитокинов (Полосухина и др., 2000; Israels, Israels, 1999). Взаимодействие рецептора Fas и соответствующего лиганда (Fas-лиганда) приводит к образованию кластеров рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с адаптером FADD (Fas-associated death domain). Взаимодействие адаптера с рецептором осуществляется через гомофильные белок-белковые взаимодействия небольших доменов: DD (death domain – домен смерти), DED (death-effector-domain – домен эффектора смерти), CARD (caspase activation and recruitment domain – домен активации и рекрутирования каспазы) (Мойбенко и др., 2005). TNF- представляет собой растворимый цитокин, синтезируемый активированными Т-лимфоцитами и макрофагами. После его связывания с TNF-рецепторами (TNF-R1) происходит мобилизация белка TRADD (TNF receptor-associated death domain). Это, в свою очередь, приводит к усилению продукции ядерного фактора транскрипции (NF-kB) и активатора плазминогена-1 (АР-1) (Hsu et al., 1995).
Таким образом, адаптерные белки FADD и TRADD взаимодействуют с цитоплазматическими протеинами, которые содержат домен смерти и ведут к апоптозу через активацию каспазы-8 и последующего каскада каспаз. Однако при повреждении ДНК, радиации, действии токсических агентов, действии глюкокортикоидов, прекращении цитокиновой регуляции возможна и первоначальная активация каспазы-9 (Владимирская, 2002). Помимо наиболее изученных Fas- и TNF-рецепторов в настоящее время обнаружен ряд других рецепторов гибели клеток: DR3 (death receptor 3), DR4, 5 и 6 (Мойбенко и др., 2005). Известно, что митохондрии являются своеобразными сенсорами кислородного обеспечения клеток, поэтому при различных гипоксических состояниях, оксидативном стрессе, нарушении окислительного фосфорилирования и энергообеспечения клетки в целом включаются митохондриальные механизмы апоптоза (Bratton, Cohen, 2001; Feuerstein, Young, 2000). Внутри митохондрий содержится ряд белков (цитохром с, Smac/DIABLO, HtrA2/Omi, эндонуклеаза G и др.), попадание которых в цитоплазму приводит к запуску апоптоза (Li et al., 2001). Так, высвобождаемый из митохондрий цитохром С способствует олигомеризации цитозольного белка – апоптозоактивирующего фактора (Apaf), на котором происходит протеолитический процессинг каспазы-9 (Мойбенко и др., 2005). Ядерные механизмы апоптоза включаются в результате повреждения генетического материала. Огромное значение в реализации апоптотического сигнала в данном случае играет белок p53. При повреждении ДНК наступает экспрессия wt p53, вызывающая ингибицию генов, способствующих росту, и экспрессию генов проапоптотических факторов (bax), рецепторов семейства TNF и целого ряда генов-онкосупрессоров, протеины которых являются ингибиторами циклин-зависимых киназ (Cdks) – ключевых ферментов деления клеток (Райхлин, Райхлин, 2002).
Влияние окклюзии сонных артерий и острой гипоксической гипоксии на выживаемость, поведение и нейрохимические показатели крыс 3-4- и 18-месячного возраста
При изучении эффектов гипоксической гипоксии на латентное обучение 3-4-мес. крыс установлено снижение времени поиска скрытой платформы к 3-м суткам тестирования. Однако по сравнению с контрольной группой обучение крыс было менее эффективно: в течение всего тестирования показано повышение времени поиска скрытой платформы у животных, которым моделировали острую гипоксическую гипоксию относительно контроля (табл. 10).
Также следует отметить, что у 3-4-месячных крыс время поиска скрытой платформы было ниже, чем у 21-дневных крыс, подвергнутых пренатальной как гемической, так и гипоксической гипоксии разной продолжительности. Таблица 10 Результаты исследования когнитивной функции 3-4-месячных крыс в водном лабиринте Морриса в модели острой гипоксической гипоксии и введении коротких пептидов (с, М±m Сумма четырех попыток Первый день тестирования Второй день тестирования Третий день тестирования 28,53±1,09Острая г 37,52±1,49 Контроль11,63±0,27 (п = 72) 8,49±0,31 ипоксическая гипоксия 24,54±0,10 (п = 28) 17,83±0,65 Примечание: - достоверное (р 0,05) изменение относительно контроля.
В модели двусторонней окклюзии сонных артерий в мозге крыс происходило накопление вторичных продуктов свободнорадикального окисления (ТБК-РП). Особенно выраженные изменения установлены в левой половине мозга. В тоже время суммарная пероксидазная активность в большей степени возрастала в правой коре больших полушарий и правых стволовых структурах (табл. 12). Это может свидетельствовать о разных путях метаболического ответа в структурах мозга: в правой половине мозга, со стороны которой моделировали 3-минутную окклюзию с последующей 24-часовой реоксигенацией, в большей степени активируются пероксидазы, которые принадлежат к группе гемопротеиновых ферментов, активирующих перекись водорода и осуществляющих сгорание трудноокисляемых компонентов клетки. В левой половине мозга (со стороны 24-часовой окклюзии) больше выражены процессы, направленные на накопление продуктов свободнорадикального окисления.
Полученные результаты подтверждают данные исследования показателей хемилюминесценции у экспериментальных животных. В правой коре больших полушарий высота быстрой вспышки не изменилась, но возрос показатель светосуммы относительно контроля. Во всех остальных структурах мозга на фоне повышения светосуммы отмечали и увеличение высоты быстрой вспышки по сравнению с контролем (табл. 13). Следовательно, в правой коре больших полушарий процессы окисляемости тканевых липидов и концентрация металлов переменной валентности была ниже, тогда как уровень антиоксидантов - выше относительно остальных исследованных структур мозга. Однако скорость расходования свободных радикалов липидной природы, вследствие их взаимодействия с антиоксидантами и обусловленная в первую очередь уровнем прооксидантов в системе, одинаково высока была во всех структурах мозга.
Также показано, что в условиях 3-минутной окклюзии правой сонной артерии и 24-часовой окклюзии левой сонной артерии в правой коре больших полушарий происходит значительное истощение содержания всех исследованных медиаторов, за исключением гистамина относительно контроля (табл. 14). Выявлено снижение уровней норадреналина, дофамина, серотонина, а также 5-ОИУК. Соотношения НА/ДА и НА/серотонин были ниже контрольных величин (табл. 29), тогда как соотношение серотонин/5-ОИУК возросло.
В правых стволовых структурах снижение уровней норадреналина, дофамина обнаружено одновременно с повышением содержания серотонина (табл. 14). Возрастание уровня серотонина можно объяснить компенсаторным уменьшением его метаболизма (содержание 5-ОИУК понижалось). При этом происходило значительное снижение соотношений НА/ДА и НА/серотонин (табл. 15), что свидетельствует о преобладании активности серотонинергической системы над адренергической в данных структурах при 3-минутной окклюзии правой сонной артерии и 24-часовой окклюзии левой сонной артерии.
В левой коре больших полушарий (табл. 14) произошло снижение содержания норадреналина, дофамина и 5-ОИУК. Одновременно обнаружено повышение уровня серотонина. В результате понизились соотношения НА/ДА на -69% (р 0,05) и НА/серотонин и увеличилось значение соотношения серотонин/5-ОИУК (табл. 15). Из вышесказанного следует, что левая половина коры более чувствительна к нарушению кровоснабжения по сравнению с правой гемисферой в связи с более длительным окклюзирующим воздействием.
В левых стволовых структурах было отмечено значительное снижение уровней как серотонина, так и его метаболита (табл. 14). Такое изменение уровней моноаминов отразилось на росте показателей НА/ДА и НА/серотонин, тогда как соотношение серотонин/5-ОИУК было ниже контроля (табл. 15).
Влияние пептидных препаратов на свободнорадикальные процессы в мозге крыс в модели окклюзии сонных артерий
Таким образом, установлено, что чем выше была эффективность препарата на латентное обучение крыс, тем более высокий уровень каспазы-3 относительно контроля выявлен в структурах мозга этих животных.
Повышение активности каспазы-3 в мозге у животных, не подвергнутых стрессовому воздействию, связывают с обучением, в основе которого лежат пластические перестройки в структурах мозга (Chan, Mattson, 1999). В нашем исследовании была установлена взаимосвязь между уровнем обученности и показателями содержания и активности каспазы-3 в мозге крыс в модели пренатального стресса. Например, при введении кортексина коэффициент 151 корреляции (rКортексин) между временем поиска скрытой платформы (на 3-й день эксперимента) и активностью каспазы-3 в коре больших полушарий составил 0,57 (р 0,05), при введении пинеалона (rПинеалон) – +0,86 (р 0,05), при введении дельтарана (rДельтаран) – +0,91 (р 0,05); в стволовых структурах, соответственно, rКортексин=0,47; rПинеалон=0,75 (р 0,05); rДельтаран=0,84 (р 0,05). Также установлены корреляционные зависимости между показателем латентного обучения и экспрессией каспазы-3 в мозге животных, которым вводили пептидные препараты: в коре больших полушарий rКортексин=0,52 (р 0,05); rПинеалон=0,77 (р 0,05); rДельтаран=0,88 (р 0,05), в стволовых структурах rКортексин=0,42 (р 0,05); rПинеалон=0,81 (р 0,05); rДельтаран=0,92 (р 0,05). Таким образом, повышение показателей активности и содержания каспазы-3 в структурах мозга животных, которым вводили пептидные препараты, соответствующее возрастанию эффективности на латентное обучение: кортексин – пинеалон – дельтаран.
Такую взаимосвязь активности/содержания активной каспазы-3 и латентного обучения при введении данных пептидов и степени их эффективности на процесс обучения можно объяснить следующим. Согласно данным литературы (Сторожева и др., 2010) начальный этап формирования долговременной памяти инициирует значимое возрастание активности апоптоза в гиппокампе. Упрочение долговременной пространственной памяти ассоциировано с достоверными изменениями показателей дифференцировки и программированной гибели вновь образованных клеток в префронтальной коре. Также показано, что введение ингибитора каспазы-3 в мозг крысят в период ее естественной активации в гиппокампе (18-й день) приводит к отдаленным нарушениям обучения реакции активного избегания. Нарушения развития поведения могут быть связаны с изменениями синаптической пластичности в раннем онтогенезе в результате временного блокирования активности фермента.
С другой стороны известно, что церебральная ишемия стимулирует процессы нейрогенеза. Однако репаративный нейрогенез в патологических 152 условиях обычно не достаточен для морфофункциональной регенерации и нуждается в стимуляции (Ярыгин и др., 2012). Вероятно, в уже названном ряду пептидов дельтаран наиболее эффективен в плане морфофункциональной регенерации.
Далее представлены результаты исследования влияния пренатальной гипоксии и введения пептидных препаратов на поведение крыс в тесте «открытое поле» (табл. 42). Согласно полученным результатам в модели пренатального введения кортексина у 21-дневных крыс установлено снижение времени поведенческого сна, а также вертикальной и горизонтальной локомоторной активности, что, вероятно, происходило за счет снижения представленности горизонтальной локомоции (количество горизонтальных локомоций было снижено относительно контроля), тогда как вертикальных, - напротив, - увеличено. Также показано повышение времени пищевого поведения и груминга по сравнению с контрольной группой. Введение кортексина оказало влияние на питьевое поведение (рис. 24).
В модели введения кортексина и пренатальной гипоксической гипоксии также наблюдали снижение горизонтальной и вертикальной локомоторной активности и повышения доли пищевого поведения. Однако в отличие от крыс в модели введения кортексина установлено увеличение времени поведенческого сна, релаксированного бодрствования, а также снижение мелкой двигательной активности (рис. 25).
Таким образом, в норме и в условиях пренатального стресса введение кортексина одинаково влияет на вертикальную и горизонтальную локомоторную активность и пищевое поведение, но по-разному на остальные формы поведения: после перенесенного стресса введение кортексина способствует снижению времени всех форм двигательной активности и увеличивает представленность поведенческого сна и релаксированного бодрствования.
