Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Строение и функционирование глутаматергических синапсов 10
1.1.1 Явление синаптической пластичности 14
1.1.2. Дендритные шипики 14
1.2. Классификация и молекулярно-структурная организация рецепторов глутамата 19
1.3. Апоптоз и некроз - два варианта клеточной гибели 28
1.3.1 Пути гибели клетки (морфологические различия) 29
1.3.2. Апоптоз 32
1.3.2.1. Индукторы и ингибиторы апоптоза 34
1.3.3. Молекулярные механизмы апоптоза 36
1.4 Нейротоксическое действие глутамата 42
Глава 2. Объект и методики 47
2.1. Получение животных с датированным сроком беременности...47
2.2. Приготовление первичной культуры 48
2.3. Идентификация нейронов 51
2.4. Получение иммуноцитохимического материала 53
2.5. Исследование неиродегенерации методом световой микроскопии 54
2.6. Исследование неиродегенерации методом люминесцентной и конфокальной микроскопии 55
2.7. Количественная оценка экспрессии синаптоподина 56
2.8. Оборудование и обработка данных 56
Глава 3. Результаты 59
3.1. Рецепторные механизмы неиродегенерации путем некроза при действии Глу и его агонистов при ТС тесте на нейронах 59
3.2. Пути апоптоза индуцируемые активацией различных подтипов рецепторов Глу 65
3.2.1. Выявление гибели по механизму некроза и апоптоза на живой культуре нейронов с использованием витального флуоресцентного кита 65
3.2.2. Анализ механизмов апоптоза методом иммуноцитохимии при активации различных типов Глу-Р 71
3.3. Исследование динамики экспресии синаптоподина при действии NMDA 75
Глава 4. Обсуждение 80
Выводы 90
Список литературы 91
- Строение и функционирование глутаматергических синапсов
- Классификация и молекулярно-структурная организация рецепторов глутамата
- Приготовление первичной культуры
- Рецепторные механизмы неиродегенерации путем некроза при действии Глу и его агонистов при ТС тесте на нейронах
Введение к работе
Актуальность проблемы.
В настоящее время сформировались представления о том, что глутамат (Глу) (анион глутаминовой кислоты), является основным возбуждающим медиатором в синапсах ЦНС млекопитающих (Ашмарин, Стукалов, 1996; Walkins, Evans, 1981; Fonnum 1984; Headley, Grillner, 1990; Collingridge, Singer, 1990; Nakanishi, 1992), а так же в нервно-мышечных синапсах членистоногих (Магазаник и др., 1984; Антонов, 1989; Lunt, Olsen, 1988). Вопреки нормальной функции, в условиях длительного действия Глу и чрезмерной активации его рецепторов могут развиваться патологические состояния, связанные с гибелью нейронов. Как нормальная медиаторная функция, так и запуск цепной реакции нейродегенеративных процессов осуществляется через активацию одних и тех же рецепторов глутамата. Знание этих процессов представляется важным как с точки зрения теоретической науки, так и практической медицины. Установлено, что гиперактивация глутаматных рецепторов, следствием которой является неиродегенерация, проявляется в таких острых патологических состояниях мозга, как инсульт и связанная с ним ишемия, аномальная активность возбуждающих связей (судорожные состояния и болезнь Паркинсона), при нарушении целостности клеток (черепно-мозговая травма), а также при хронических нейродегенеративных заболеваниях, например, болезнь Альцгеймера (Meldrum, 1993; Mitchell et al., 1994; Pollard et al., 1994; Pellegrini-Giampietro et al., 1997; Lipton, 1999; Yu et al., 1999).
Поскольку исследование механизмов патологических состояний на целом мозге, из-за его сложной структурной организации, затруднено, для анализа путей реализации токсического действия глутамата часто используют культуры нейронов. Проведение подобных исследований представляется весьма своевременным, современным, актуальным и
позволяет, наряду с внутриклеточными механизмами, изучать изменения межнейронных взаимодействий в нейронной сети.
Нейродегенерация является заключительным этапом комплексной дисфункции нервной ткани. В ходе её развития происходят значительные нарушения в системе биосинтеза нейромедиаторов, их аккумуляции в синаптических пузырьках, захвате в нервные терминали и глиальные клетки. Эти процессы имеют пресинаптическую локализацию, так как происходят в пресинаптических нейронах и глиальных клетках, являющихся источником глутамата в ЦНС. Их нарушения вызывают существенное повышение свободной концентрации глутамата в межклеточном пространстве (Khodorov, 2004). К постсинаптическим факторам нейродегенерации относятся: активация различных типов рецепторов глутамата и деполяризация нейронов, нарушение мембранных ионных градиентов и вход значительного количества кальция в клетки, который запускает летальные процессы внутриклеточной сигнализации, приводящие к активизации апоптотических путей гибели нейрона.
Хотя многие из перечисленных процессов изучались на изолированных клетках, остается открытым вопрос, каким образом происходит их взаимодействие на уровне системы клеток и нейронных сетей в экстремальных условиях длительных воздействий глутамата. Исследованию рецепторных механизмов токсического действия глутамата, некротического и апоптотического путей гибели нейронов и вовлеченности синаптической пластичности в нейротоксическое действие посвящена эта работа.
Целью работы было исследование нейротоксического действия глутамата на нейроны коры, зависимости динамики нейродегенерации от концентраций глутамата, а также подтипов рецепторов, синаптических и внутриклеточных механизмов, вовлеченных в процессы индукции нейронной гибели по механизму некроза и апоптоза.
Конкретные задачи исследования. Настоящая работа была направлена на решение нескольких связанных между собой задач:
В опытах на первичной культуре ткани нейронов коры большого мозга крыс исследовать динамику и концентрационную зависимость нейродегенерации, вызываемой глутаматом, с использованием витального красителя на некроз - трипанового синего;
С применением избирательных агонистов (NMDA, АМРА и КА) рецепторов глутамата и их антагонистов (АФ5 и CNQX) исследовать рецепторные механизмы индукции некротических процессов при токсическом действии различных концентраций глутамата;
Разработать витальный флуоресцентный кит для автоматического анализа клеточных популяций на соотношение живых, погибших по механизму некроза и апоптотических клеток для конфокальной микроскопии;
Провести количественную оценку апоптоза на живой ткани с использованием витального флуоресцентного кита и с применением иммуноцитохимического метода. Исследовать возможные различия путей развития апоптоза, при его индукции избирательной активацией NMDA и АМРА/КА рецепторов;
Применяя моноклональные антитела на синаптоподин -белок шипикового аппарата, исследовать возможное изменение уровня его экспрессии при нейротоксическом эффекте глутамата и его агонистов.
Научная новизна:
- Разработан новый витальный кит для идентификации некроза и апоптоза, а также их автоматической количественной оценки, заключающийся в последовательном прокрашивании флуорохромами
акридиновым оранжевым и бромистым этидием (АО/БЭ-кит) живых нейронов коры в культуре ткани. Поскольку, пути гибели клеток различной тканевой принадлежности сходны, этот кит может широко применяться для анализа клеточных популяций в условиях патологии и нормального развития в любых живых тканях.
Впервые продемонстрирована зависимость механизмов апоптоза от рецепторов глутамата: активация NMDA рецепторов вызывает апоптоз, развивающийся без участия каспаз, а АМРА/КА рецепторов - по каспазозависмому пути.
Показано, что на начальном этапе развития нейродегенерации происходит существенное увеличение зон экспрессии синаптоподина, что может говорить о существенном изменении функционального состояния дендритов.
Научно-практическая ценность.
Разработанный в процессе исследования кит может применяться для экспресс анализа клеточных состояний любых живых тканей.
Полученные данные расширяют представления о молекулярных
механизмах нейротоксического действия глутамата, вызываемого
комплексными нарушениями физико-химических условий
функционирования нейронов при участии разнообразных транспортных и рецепторных систем плазматических мембран, а также многих каскадов внутриклеточной сигнализации, и являющегося неизбежным этапом патогенеза большого числа заболеваний ЦНС. Результаты проведенных исследований существенно дополняют представления о влиянии глутамата и его агонистов на синаптогенез нейронов.
Данные о механизмах нейродегенерации при активации глутаматных рецепторов, а также автоматический анализ с помощью разработанного в процессе исследования АО/БЭ кита, для оценки различных механизмов гибели клеток, могут быть рекомендованы для внедрения в учебный процесс в курс нормальной и патологической
физиологии при рассмотрении вопросов гомеостаза, нарушений клеточной рецепции, механизмов апоптоза и некроза.
Положения выносимые на защиту.
На начальном этапе действия Глу гибель нейронов происходит по механизму некроза. Эффект пороговой концентрации Глу (1 мМ) реализуется через NMDA рецепторы. Повышение концентрации Глу (3 мМ) сопровождается вовлечением АМРА/КА рецепторов в индукцию некротических процессов.
При длительном воздействии (более 240 мин) Глу начинают проявляться апоптотические процессы. Причем, механизм развития апоптоза (каспазный и некаспазный) определяется типом активируемых рецепторов Глу.
На начальном этапе действия NMDA, происходит существенное увеличение экспресии белка шипикового аппарата - синаптоподина, что отражает значительное изменение функционального состояния дендритов.
Апробации работы.
Материалы диссертации доложены на Всероссийской конференции «Механизмы синаптической передачи» (Москва, 2004); I съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005); Всероссийской конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2005); XIII Международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006); V Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения» (Санкт-Петербург, 2006).
Публикации.
По материалам диссертации опубликованы 9 печатных работ.
Строение и функционирование глутаматергических синапсов
Первые сообщения о способе взаимодействия нервных клеток через специфические контакты или синапсы появились в 1893 году. Открытие синапсов связывают с именем испанского ученого Рамона-и-Кахала, который, используя методику импрегнации нейронов серебром, предложенную итальянским ученым Гольджи, обнаружил, что подавляющее большинство нейронов имеют два функционально разных отростка: дендрит и аксон. Им впервые была обоснована морфологическая самостоятельность нейронов и глиальных клеток, а так же показано, что в нервной системе отсутствуют синцитиальные отношения (Куффлер, Николе, 1979). Таким образом, первым большим вкладом Рамона-и-Кахала явилось представление о нервной системе как о совокупности отдельных, обособленных клеток, которые взаимодействуют друг с другом с помощью синапсов. Он показал, что нейроны получают информацию в районах их дендритов и тел, а распространяют исходящую информацию по аксонам, и назвал это «законом динамической поляризации». Вторым вкладом, пожалуй, еще более значительным было подтверждение данных о том, что невероятно сложные связи между нейронами не случайны, а высоко структурированы и специфичны. Он дал исчерпывающее описание архитектоники десятков различных структур мозга, и в каждом случае идентифицировал и классифицировал разные клетки, а иногда показывал, насколько позволяли его методы, как эти клетки связаны между собой. Эти значимые открытия были четко изложены благодаря работам многих экспериментаторов, включая эмбриологов, первого исследователя нейрональных культур Харрисона и многих отечественных гистологов таких, как Б.И.Лаврентьева и Н.Г.Колосова (Лаврентьев, 1939; Колосов, 1962; Harrison, 1907). Их публикации в крупнейших международных журналах привели в итоге дискуссии с рядом западных специалистов к победе нейронной теории строения нервной системы, которой отечественные нейрогистологи придерживались в союзе с Сантьяго Рамон и Кахалом и другими крупнейшими зарубежными и российскими специалистами (Лаврентьев, 1936; Долго-Сабуров, 1956). Сейчас эта теория незыблема, но существование синцитиальной межнейрональнай связи четко показано в нервной системе беспозвоночных и в вегетативной нервной системе на раннем этапе онтогенеза млекопитающих (Самосудова и др., 1994; Риттер и др, 1990; Bittner, 1973).
Прошло полвека после открытий Кахала, прежде чем физиологи утвердились в понимании того, что в основе поляризации лежит передача информации через химические синапсы, а ключевым компонентом такой передачи является существование в плазматической мембране нейрона синаптических рецепторов. Как источники химического сигнала -пресинаптические терминали, так и его «приемники» - постсинаптические рецепторы, сами по себе разнообразны и, кроме того, подвержены многочисленным модулирующим влияниям.
При изучении влияния различных веществ на электрическую активность нейронов изолированного спинного мозга Куртис и Ваткинс сформировали гипотезу о медиаторной роли дикарбоновых аминокислот (Curtis, Johnston, 1974; Cheah, Watkins, 1965). Наиболее сильный эффект в их экспериментах оказывали L-аспарагиновая, L-глутаминовая и L-цистеиновая аминокислоты. В результате дальнейших экспериментов было установлено, что основным возбуждающим медиатором в синапсах центральной нервной системы позвоночных животных является глутамат, и для него выполняются все основные требования, необходимые для признания вещества медиатором. Определяющим феноменологическим признаком медиаторной роли глутамата послужило открытие для него специфических рецепторов.
Глутаматергический синапс, как и другие химические синапсы, представляет собой сложное структурное образование, состоящее из пресинаптической мембраны (чаще всего это концевое разветвление аксона), постсинаптической мембраны (чаще всего это участок мембраны тела или дендрита другого нейрона), а так же синаптическои щели (рис. 1). Важным элементом синапса являются глиальные клетки, которые осуществляют локальный гомеостазис в синаптическои щели, для выполнения главной функции передачи синаптического сигнала.
Еще до того, как были выяснены многие существенные особенности процесса высвобождения медиатора, было установлено, что пресинаптические окончания могут изменять состояния спонтанной секреторной активности. Постоянно выделяемые небольшие порции медиатора вызывают в постсинаптической клетке так называемые спонтанные, миниатюрные постсинаптические потенциалы. Изучая работу нервно-мышечного синапса лягушки, английские ученые Фетт и Катц в 1950 году обнаружили, что без всякого действия на нерв в мышце в области постсинаптической мембраны сами по себе через случайные промежутки времени возникают небольшие колебания потенциала, амплитудой примерно в 0,5 мВ (Fatt, Katz, 1950). Открытие, не связанного с приходом нервного импульса, выделения медиатора помогло установить квантовый характер его высвобождения, то есть получилось, что в химическом синапсе медиатор выделяется и в покое, но изредка и небольшими порциями. Дискретность выражается в том, что медиатор выходит из окончания не диффузно, не в виде отдельных молекул, а в форме многомолекулярных порций (или квантов), в каждой из которых содержится несколько тысяч молекул (Зефиров, 2000).
Принцип работы химического синапса состоит в том, что пресинаптический ПД вызывает нейросекреторный процесс, выделение медиатора из везикул. Пресинаптическая мембрана содержит много кальциевых каналов. Потенциал действия деполяризует пресинаптическое окончание и, таким образом, изменяет состояние кальциевых каналов, вследствие чего они открываются. Так как концентрация кальция [Са ] во внеклеточной среде больше, чем внутри клетки, то через открытые каналы кальций проникает в клетку. Увеличение внутриклеточного содержания кальция, приводит к слиянию пузырьков с пресинаптической мембраной. Медиатор выходит из синаптических пузырьков в синаптическую щель. Синаптическая щель в химических синапсах составляет в среднем 20 нм. Здесь медиатор связывается с белками - рецепторами, которые встроены в постсинаптическую мембрану. Связывание медиатора с рецепторами начинает цепь явлений, приводящих к изменению состояния постсинаптической мембраны, а затем и всей постсинаптической клетки. После взаимодействия с молекулами медиатора рецепторы активируются, воротный механизм открывает канал, что приводит к возникновению ионного тока и изменению мембранного потенциала. Если мембранный потенциал сдвигается в сторону порога потенциала действия (происходит деполяризация), то говорят о возбуждающем действии медиатора. И наоборот, если мембранный потенциал становится более отрицательным, то есть происходит гиперполяризация, говорят о тормозном действии медиатора.
Классификация и молекулярно-структурная организация рецепторов глутамата
Глутаматергические механизмы представлены примерно в 40% нервных клеток, а оставшаяся часть выпадает на долю всех остальных медиаторов (серотонина, ацетилхолина, допамина и др.). С использованием методов электрофизиологии, молекулярной биологии, радиолигандного связывания, было установлено существование 4 типов глутаматных рецепторов. Среди 4 типов глутаматных рецепторов, 3 типа являются ионотропными (NMDA-рецепторы, каинатные рецепторы и АМРА-рецепторы - все они тетрамеры) и 1 - метаботропными. Ионотропные рецепторы являются управляемыми лигандом ионными каналами. Современная классификация ионотропных рецепторов основана на разной их чувствительности к действию ІУ-метил-Б-аспарагиновой (NMDA), 2-амино-3(3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-ил) пропионовой (AMPА), каината и квисквалатной кислоты. Однако необходимо помнить, что в живых организмах все эти типы рецепторов активируются глутаматом и, возможно, аспартатом (McBain, Mayer, 1994; Dingledine et al., 1999). У беспозвоночных глутаматные рецепторы могут формировать катионный или анионный канал и возможна регистрация как де-, так и гиперполяризующего действия при аппликации агонистов (Shinozaki, 1988).
Метаботропные глутаматные рецепторы принадлежат к суперсемейству рецепторов, связанных с G-белком. По чувствительности к агонистам метаботропные глутаматные рецепторы делятся на три группы (Brauner-Osborne et al., 2000). Первая группа обладает максимальным сродством к квисквалату и активирует, через соответствующий G-белок, фосфолипазу С. Вторая и третья группы наиболее чувствительны к t-ACPD и L-AP4 соответственно и уменьшают форсколинзависимое образование циклического AMP. Таким образом, метаботропные рецепторы влияют на ионную проводимость через активацию вторичных посредников. Ионотропные рецепторы глутамата очень разнообразны, как по составу входящих в них субъединиц, так и по свойствам формируемых ими ионных каналов. Субъединичный состав рецепторов определяет фармакологические и физиологические свойства ионных каналов (Bochet et al., 1994; Yamakura et al., 1999).
Клонирование позволило узнать аминокислотные последовательности рецепторных субъединиц, формирующих ионный канал и их топологию в мембране. АМРА рецепторы могут быть сформированы разными сочетаниями четырех видов субъединиц, каинатные рецепторы шестью и NMDA восьмью видами (Dingledine et al., 1999). Так количество клонированных на настоящий момент субъединиц -17. Для большинства субъединиц возможен альтернативный сплайсинг, редактирование, приводящее к изменению аминокислотной последовательности (Sobolevsky, 2003). Все это увеличивает число возможных подтипов глутаматных рецепторов и тем самым расширяет набор функциональных отличий, которыми они могут обладать (Dingledine et al., 1999). NMDA-чувствительные ионотропные глутаматные рецепторы формируют канал высокой проводимости для Na+, К+ и Са2+. Под влиянием полиаминов (спермина и спермидина) с обязательным участием ко-агониста глицина происходит модуляция NMDA-R. NMDA-канал блокируется Mg - его неконкурентным антагонистом и многими экзогенными агентами, эффективность этого блока зависит от мембранного потенциала (Choi, 1985; Carpenter, 2002). В силу этого NMDA-R способны пропускать ток только в результате деполяризации постсинаптической мембраны, которая в физиологических условиях следует за стимуляцией AMPA-R, приводящая к разблокированию NMDA канала. Эта уникальная особенность и высокая проницаемость для Са , позволяет NMDA-R играть важную роль в ЦНС, участвуя в таких функциональных процессах, как синаптическая пластичность, обучение, формирование памяти, развитие мозга при эмбриогенезе. Аналогично Mg , такие неконкурентные антагонисты NMDA-R, как кетамин, декстрометорфан, мемантин, фенциклидин и (+)-5 -метил-10,11-дигидро-5Н-дибензоциклогептен-5,10-имин мелеат (+)МК-801 блокируют NMDA-каналы в открытом состоянии, хотя блокирующая кинетика и зависимость от мембранного потенциала этого эффекта значительно варьируют. NMDA-R представляет собой цельный рецепторно-ионофорный комплекс, включающий несколько сайтов регуляции, сайт специфического связывания медиатора (L-глутаминовой кислоты), сайт специфического связывания коагониста (глицина) и аллостерические модуляторные сайты, расположенные как во внеклеточной области рецептора (полиаминовый и протонный), так и в ионном канале (сайты связывания фенциклидина, двухвалентных катионов и потенциалзависимыи М2+-связывающий участок). Показано, что NMDA рецептор является гетеромерной структурой и состоит из двух типов субъединиц (NMDAR1 и NMDAR2A, -2В, -2С и NMDAR2D). Таким образом, одна рецепторная молекула содержит две NMDAR1 и две NMDAR2. Субъединица NMDAR1 является обязательной для формирования рецептора, так как в ее отсутствие, рецептор неспособен активироваться. Функциональная гетерогенность NMDA рецепторов в различных нейрональных клетках определяется функциональными и структурными различиями субъединиц NMDAR2. Однако соотношение субъединиц, входящих в состав рецепторного комплекса, зависит не только от типа ткани, но и изменяется с возрастом, а также может изменяться в зависимости от степени активности синапсов.
Для любого типа субъединиц топология расположения в мембране одинакова. Каждая субъединица имеет три трансмембранных домена (Ml, МЗ и М4) и один внутримембранный домен М2 (рис. 2). N конец расположен внеклеточно, а С - конец внутриклеточно. В образовании канала участвуют М2 домены четырёх субъединиц. Сайт связывания глутамата находиться на двух (S1 и S2) доменах расположенных на N конце перед Ml доменом и на МЗ-М4 петле, соответственно, причем эти домены принадлежат NMDAR2 субъединицам. Те же самые места на субъединицах NMDAR1 типа служат местом связывания глицина. В зависимости от конкретного субъединичного состава NMDA рецепторы приобретают различные свойства. Так например, рецепторы содержащие NMDAR2A субъединицы десенситизируются быстрее, чем NMDAR2D (Partin et al., 1996). Десенситизация глутаматных рецепторов является основным молекулярным механизмом, ограничивающим длительность постсинаптического сигнала. Ионотропные глутаматные рецепторы различаются по кинетическим параметрам десенситизации.
Приготовление первичной культуры
Для того чтобы приготовить культуру нейронов определенного отдела головного мозга, необходима изоляция этой области на стадии эмбрионального развития, когда структура уже сформирована. Использование ранних стадий эмбрионального развития для приготовления культур нейронов приведет к тому, что культура не будет обладать структурной специфичностью, а также будет представлять собой неоднородную смесь нейронов различной химической специализации. К тому же головной мозг эмбрионов с небольшим сроком развития еще очень мал, что может создать методологические трудности для выделения необходимого участка мозга, и не обеспечит необходимого количества нейронов для проведения экспериментов. Именно поэтому, для получения первичной культуры нейронов коры головного мозга крыс использовали эмбрионы на 16 день пренатального развития. К этому сроку кора уже достаточно сформирована и может быть идентифицирована, однако нейроны находятся в процессе дифференцировки и обладают способностью выживать и дифференцироваться в искусственных условиях культивирования. Использование эмбрионов более поздних сроков или же новорожденных крысят сопряжено с дополнительными экспериментальными трудностями, а также с существенным понижением выживаемости клеток при их ферментативной диссоциации и культивировании.
С целью обеспечения стерильности во время приготовления нейрональных культур все манипуляции: препаровка эмбрионов, приготовление необходимых растворов, посев клеток и т.д. осуществлялись в стерильном вертикальном ламинарном шкафу (ВЛ-12, РФ).
На 16-е сутки беременных крыс помещали в специальную пластиковую камеру и усыпляли с использованием ССЬ ингаляции (Dichter, 1978; Li-Smerin, Johnson, 1996). Углекислый газ подавался в камеру в течение 1-2 минут. Констатация смерти производилась по отсутствию сердцебиения. После остановки сердца матери эмбрионы продолжают жить в течение нескольких минут, поэтому важно как можно быстрее извлечь эмбрионы и провести все необходимые операции по получению клеток коры головного мозга, иначе процент погибших нейронов среди выделенных клеток будет очень большим.
После извлечения эмбрионы очищали от всех оболочек и помещали в чашку Петри с раствором Хенкса. Отрезанный головной мозг очищали от оболочек, после этого мозг расправлялся, принимая характерную форму. Выделение коры головного мозга эмбрионов производили при низких температурах (на сухом льду) с использованием микроскопа МБС-9 (ЛОМО, РФ) при 10 - 50 - кратном увеличении. Необходимость использования льда, а также безтеплового источника света (использовались световоды) при выделении коры эмбрионов определяется тем, что низкая температура (около 0 С) при препаровке обеспечивает максимальную выживаемость нейронов мозга. При препаровке вначале удаляли мозжечок, затем одно полушарие отделялось от другого. После удаления мягкой оболочки головного мозга, когда область дифференцирующейся коры хорошо видна, её отделяли и использовали для культивирования.
Полученный материал подвергали ферментативной обработке с использованием трипсина (0.04 мг/мл; Sigma, США) в течение 45 мин. Для предотвращения ферментативного процесса и образования конгломератов клеток использовали ингибитор трипсина (0.4 мг/мл) и ДНК-азу (0.4 мг/мл; Sigma, США). Далее клетки подвергали центрифугированию в течение 5 мин со скоростью 1500 об/мин с использованием низкооборотной центрифуги (B3.ll, Jouan, Франция). Надосадочная жидкость, не содержащая клетки, удалялась. Затем клетки промывали чистым раствором Хенкса. Для полной остановки ферментативных процессов и отмывки применяемых препаратов эту операцию производили трижды. Подсчет клеток производился с использованием камеры Фукса-Розенталя. Количество живых клеток оценивали с помощью теста на трипановый синий (ТС) (Биолот, РФ). Раствор ТС, приготовленный на физиологическом растворе, добавляли в суспензию клеток в соотношении 1:1 для получения его конечной концентрации 0,2 %. Исходя из количества живых клеток, производили необходимый подсчет количества среды для получения требуемой плотности культуры.
Инструменты, используемые в опытах автоклавировали в настольном паровом стерилизаторе (ГК-10, РФ) при 120С в течение 30 мин. Все среды для культивирования нейронов приготавливали в стерильных условиях. Каждый компонент среды предварительно фильтровали с помощью специальных стерильных фильтров с диаметром поры 0,2 мкм (GyroDisc, Бельгия). Клетки культивировали в питательной среде (83% DMEM с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 5 % среды F12, 25 мМ Hepes; Биолот, РФ) в 35 мм чашках Петри в объёме 3 мл при начальной плотности посева 1.3x105 кл/мл. Посев клеток осуществляли на стекла (d = 15 мм), предварительно обработанные поли-О-лизином (Sigma, США) в концентрации 0,2 мг/мл. Для выращивания культур использовали СОг-инкубатор (IG150, Франция), поддерживающий постоянную температуру (37С) и содержание СОг (5 %). Через каждые два дня среду в чашках Петри с культурами нейронов заменяли на свежую.
Рецепторные механизмы неиродегенерации путем некроза при действии Глу и его агонистов при ТС тесте на нейронах
Общепринятым подходом для выявления некроза методом световой микроскопии является использование ТС, который способен проникать и окрашивать только клетки с деструктурированнои плазматической мембраной, что является характерной особенностью некроза.
Изучалась динамика и дозо-зависимость нейротоксического эффекта Глу на нейроны коры головного мозга крыс, находящиеся в культуре 7 дней. Поскольку в контроле, на протяжении всей длительности (360 мин) эксперимента число погибших нейронов в процентном соотношении было незначительно (рис. 8А), можно сделать вывод, что ТС не оказывает собственного нейротоксического действия. Добавление 3 мМ Глу приводило к гибели значительного числа нейронов через 120 мин воздействия (рис. 8Б), а более длительная экспозиция вызывала гибель около половины нейронов (рис. 9А). Количественное сопоставление данных при действии Глу в концентрациях 1 мМ, 3 мМ и 10 мМ показано на рис. 9А. Очевидно, что динамика нейротоксического эффекта зависела от концентрации, поскольку нейротоксический эффект Глу при разных концентрациях достигался за разное время. В частности, при действии 10 мМ Глу это происходило за 120 мин, при 3 мМ Глу за 180-240 мин, а при 1 мМ Глу эффект не достигал максимума на протяжении всей регистрации (360 мин).
Известно, что Глу является агонистом всех Глу-Р, при этом NMDA-R активируются значительно меньшими концентрациями Глу, чем другие типы Глу-Р (McBain, Mayer, 1994; Dingledine et al, 1999). Для выявления вовлеченности NMDA-R в индукцию нейродегенеративных процессов, вызванных различными концентрациями Глу, мы исследовали эффект коагониста NMDA-R - Гли (Johnson, Ascher, 1987) и конкурентного антагониста АФ5 (McBain, Mayer, 1994; Dingledine et al, 1999) и неконкурентного антагониста Mg (Mayer et al, 1984; Nowak et al, 1984; Antonov, Johnson, 1999), на эффекты 1 мМ и 3 мМ Глу. Полученные данные иллюстрируются гистограммой (рис. 9Б). С высокой степенью достоверности (см. подпись к рис. 9Б), можно утверждать, что к 300 мин воздействия нейротоксический эффект 1 мМ Глу потенцировался 30 цМ Гли и ингибировался 50 иМ АФ5. Эффект также достоверно ослаблялся 2 мМ Mg2+ в наружном растворе.
Влияния этих веществ на эффект 3 мМ Глу не наблюдалось (рис. 9Б), но он почти полностью предотвращался конкурентным антагонистом AMPA/KA-R - CNQX. Действительно, в присутствии 30 цМ CNQX % погибших нейронов был близок к контролю и достоверно меньше, чем при действии 3 мМ Глу (подпись к рис. 9Б), что указывает на вовлеченность AMPA/KA-R в действие этой концентрации Глу. Обнаруженное расхождение фармакологических характеристик действия различных концентраций Глу по отношению к веществам, специфически влияющим на NMDA-R, может объясняться тем, что при «низких» концентрациях Глу NMDA-R являются доминирующими в реализации нейротоксического эффекта.
Напротив, при «высоких» концентрациях Глу определяющий вклад в нейротоксичность обеспечивается другими типами Глу-Р, индифферентными к воздействию Гли, АФ5 и наружного Mg . С целью проверки этой гипотезы были проведены эксперименты с избирательными агонистами и антагонистами разных подтипов Глу-Р. В нескольких экспериментальных сериях исследовался нейротоксический эффект NMDA, в концентрациях 3 цМ и 30 дМ. Все эксперименты с NMDA производились в присутствии насыщающей концентрации Гли (30 цМ).
NMDA обладал нейротоксическим действием (рис. 10А). В отличие от Глу действие NMDA не было концентрационно зависимым. Динамика эффектов была сходной для обеих концентраций, поскольку при каждом времени регистрации количество погибших нейронов в присутствии 3 цМ и 30 цМ NMDA достоверно не отличалось (рис. 10А, Б).
Фармакология нейротоксического эффекта NMDA совпадала с фармакологическими свойствами NMDA-R. Этот эффект предотвращался АФ5, а также существенно ослаблялся в присутствии 2 мМ Mg в наружном растворе (рис. 10Б). Эффекты Mg и АФ5 были высоко достоверны (подпись к рис. 1 ОБ). Полученные данные подтверждают, что избирательная активация NMDA-R может вызывать гибель нейронов, и, следовательно, нейротоксический эффект низких концентраций Глу может опосредоваться именно их активностью.
Для выявления вовлеченности AMPA-R и KA-R в реализацию эффектов «высоких» концентраций Глу исследовались эффекты АМРА и КА на соответствие фармакологическим свойствам этих типов рецепторов. КА в концентрациях 30 juM и 300 цМ обладал нейротоксическим действием, которое прогрессировало во времени (рис. ПА). Динамика эффекта не зависела от концентрации КА, так как для каждой из регистрации количество погибших нейронов в присутствии 30 цЫ и 300 цМ КА достоверно не отличалось (рис. 11 А, Б).
В конце экспериментов число погибших нейронов достигало 60%. В отличие от КА, 10 цМ АМРА вызывала гибель не более 20% нейронов. Тем не менее, в присутствии конкурентного антагониста AMPA-R и KA-R - CNQX (Dingledine et al, 1999) нейротоксического влияния АМРА не наблюдалось. Поскольку разница между действием 10 нМ АМРА и 10 цМ АМРА + 30 цМ CNQX является достоверной (подпись к рис. 11Б), можно сделать вывод о достоверности эффектов АМРА. Слабый эффект АМРА, по-видимому, может быть объяснен более низкой чувствительностью рецепторов при активации этим агонистом по сравнению с КА.
