Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
Современные представления о роли опиоидных пептидов в организме животных 8
Транскраниальная электростимуляция как новый метод воздействия на состояние организма животных 18
Анатомо-физиологическое состояние желудка и методы его изучения 30
Собственные исследования 37
Материал и методы исследований 37
Результаты исследований 40
1. Поведенческие реакции и общие клинические показатели у свиней при воздействии ТКЭС 40
2. Гематологические показатели у свиней в период проведения ТКЭС 45
3. Фистулирование желудка у свиней 51
4. Состояние секреторной деятельности желудка у свиней после воздействия ТКЭС 57
5. Гистоморфологические особенности различных отделов желудка у свиней при использовании ТКЭС 62
6. Влияние ТКЭС на моторику желудка у свиней 67
7. Способ восстановления функциональной активности желудка у животных 92
3. Обсуждение результатов исследований 96
4. Выводы 106
5. Практические предложения 108
6. Список используемой литературы 109
7. Приложения 128
- Современные представления о роли опиоидных пептидов в организме животных
- Анатомо-физиологическое состояние желудка и методы его изучения
- Поведенческие реакции и общие клинические показатели у свиней при воздействии ТКЭС
- Гистоморфологические особенности различных отделов желудка у свиней при использовании ТКЭС
Современные представления о роли опиоидных пептидов в организме животных
Опиоидные пептиды - большая группа физиологически активных пептидов с выраженным сродством к рецепторам опиоидного (морфинного) типа мю-, дельта-, каппа- и давшая основание к введению понятия "нейропептиды". Эти пептиды, обладающие чрезвычайно широким спектром регуляторной активности, обнаружены в различных тканях - как в мозге, так и на периферии. В группу опиоидных пептидов, помимо широко известных энкефалинов и эндорфинов, входят пептиды группы динорфина, казоморфина, а также дельторфины, дерморфины и др.
Большинство опиоидных пептидов образуется из общих белковых предшественников (проопиомеланокортин, продинорфин и др.), из которых в результате последовательного протеолитического гидролиза (процессинга) образуются физиологически активные молекулы. Регуляторное участие опиоидных пептидов в многообразных физиологических процессах (генерализованных и локальных реакциях организма) осуществляется, как правило, при участии других пептидов и низкомолекулярных субстанций.
Следует особо выделить роль опиоидных пептидов в физиологических процессах, связанных с высшей нервной деятельностью: многообразные поведенческие реакции, такие, как лекарственная зависимость, агрессивное поведение, мотивации удовлетворения, половое влечение, пищевое насыщение, стрессорные адаптивные процессы и т.д. - оказываются связанными с функцией этой большой группы пептидов (J. McDowell et al., 1987; G. Olson, 1993; A. Patel, 1993; T. Reisine, 1993; L. Terrenius, 1993; K. Yamada, 1995).
В последние годы интенсивно исследуется молекулярная биология опиоидных пептидов: выявлены к ДНК, кодирующие биогенез предшественников энкефалинов, ферментов их процессинга (карбоксипеп (карбоксипептидаза Н) и некоторых опиоидных рецепторов. Установлено
функциональное соответствие локализации и экспрессии структур, ответственных за образование пептидных (опиоидных) лигандов и их рецепторов в тканях. Выявлена локализация единиц гена каппа- и дельта- опиоидных рецепторов в структуре хромосомы человека и мыши (A. Mansour, 1993; М. Zagon, 1994; К. Yasuda, 1994; К. Befort, 1994).
Считается установленным существование пяти различных типов опо-идных рецепторов: мю, дельта, каппа, эпсилон и сигма (G.A. Olson, 1984). В последние годы установлено существование подтипов основных классов опиоидных рецепторов (С. Yan, 1 999). Так, доказано существование мю: и мк 2 - опиоидных рецепторов, дельтаї и дельтаг - рецепторов (JJ. Rady et al., 1997), каппаї и каппа2 (R. Miller, 1983). Интересно отметить, что опиоидные рецепторы разных тканей не отличаются друг от друга по физико-химической структуре и биохимическим свойствам. Опиоидные рецепторы -это липопротеидные комплексы с молекулярной массой 150000 дальтон, локализованные преимущественно на цитоплазматических мембранах клеток-мишеней (П.В. Сергеев, 1987). Связывающие потенции опиоидных рецепторов зависят от ионного состава среды (Н.В. Породенко, 1985), температуры (К. Catt, 1976), активности неопиоидных веществ (J. Roth, 1977).
Локализация опиоидных рецепторов чрезвычайно разнообразна. Наибольшая их плотность отмечается в структурах мозга, связанных с формированием болевого чувства и эмоций: околоводопроводное серое вещество, гипоталамус, медиальные ядра таламуса, лимбическая система (M.D. Sanchez et al., 2000; P. Callahan et al., 2000; La Motte, 1978; C. Pert, 1973; С Porcher, 1999), а также в других органах (кишечник, легкие, надпочечники, миокард) (В.М. Булаев, 1983; J. Roth, 1977; Y. Shavit et al., 1985).
Показано, что опиоидные рецепторы располагаются преимущественно на пресинаптических окончаниях и постсинаптических мембранах (К. Helle, 1984). Также установлено, что они находятся и внутриклеточно в микросо-мальной и митохондриальной фракциях мозга (СР. Мравян, 1993; К. Helle, 1984), на внутренней поверхности мембран аксонов (Т. Sudha, 1985), в субклеточных фракциях структур кишечной стенки (J. Glasel, 1984), причем очень часто внутриклеточные рецепторы имеют более высокую аффинность к опиоидным пептидам, чем расположенные на наружной мембране (J. Glasel, 1984).
Из всех эндогенных опиоидных пептидов наиболее изучены эндорфи-ны и энкефалины. Спектр действия эндорфинов, как правило, менее представителен, нежели для энкефалинов. Эндорфины образуются при расщеплении проопио-меланокортина (ПОМК), в молекуле которого одновременно с последовательностью р-липотропина, частью которого является [3-эндорфин, содержится в последовательности а-, Р- и у- меланоцитостимулирующий (МСГ) и адренокортикотропный (АКТТ) гормоны.
Энкефалины состоят из 5 аминокислот с последовательностью близкой к N-концу Р-эндорфина. Энкефалины различаются между собой только С-терминальным аминокислотным остатком, который включает метионин и лейцин (J. Hughes et al., 1975; N. Ling et al., 1976; S.J. Watsen et al, 1979; W.D. Yound et al., 1994). Одним из важнейших ферментов конечной стадии про-цессинга энкефалинов в мозге является карбоксипептидаза Н, участвующая в процессинге многих регуляторных пептидов (Ф.Н. Вернигора, 1992; А.Н. Вернигора, 1995).
Эндогенные опиоидные пептиды широко распространены в организме. Их находят в различных отделах головного и спинного мозга, в симпатических ганглиях, в надпочечнике, гипофизе и желудочно-кишечном тракте. Тем не менее в отдельных структурах преобладают пептиды либо одного, либо другого семейства: так, в "черной субстанции" много пептидов, происходящих от проэнкефалина Б, тогда как в надпочечнике - от проэнкеефалина А. В нейронах, чьи тела находятся в гипоталамусе, а нервные окончания - в гипофизе, пептиды, родственные динорфнну, обнаружены в вазопрессинсинтезирующих нейронах, тогда как мет-энкефалин - в окситоцин-синтезирующих клетках (В.К. Луценко, 1986).
Регионарное распределение р-эндорфинов более ограниченное. Клетки, содержащие Р-эндорфин, локализуются преимущественно в области аркуат-ного и вентромедиального ядер гипоталамуса (Э. Дикенсон, 1994; N. Ogawa et al., 1979). В остальных областях обнаруживаются только нервные волокна и терминалии эндорфинреактивных нейронов.
Продинорфин (проэнкефалин В) образует динорфин и а- неоэндорфин. Первый не обладает заметными анальгезирующими свойствами, хотя и локализуется в тех же участках, что и энкефалины. Динорфин имеет отношение к связыванию к-рецепторов, но его физиологическая функция не совсем ясна (М. Googman, 1993; С. Ventura, 1994).
Широкое распространение в нервной системе, а также локализация опиоидных пептидов в нервных окончаниях позволяют предположить их участие в передаче нервных импульсов в качестве нейромедиаторов или ней-ромодуляторов наряду с общеизвестными медиаторами. Это предположение основывается на изучении действия опиоидных пептидов на активность отдельных нейронов различных областей нервной системы, а критерием выбора исследуемой области является содержание данного пептида или рецептора к нему (А.А. Поленов, 1979; Г.А. Вартанян и др., 1984; И.Г. Акмаев, 1993; М. Denavit-Saubil М. et al., 1978).
Анатомо-физиологическое состояние желудка и методы его изучения
Изучение вопросов физиологии и пищеварения в желудке, несмотря на классические исследования И.П. Павлова и его знаменитой школы, а также достижения многих других крупнейших отечественных и зарубежных ученых, еще не может считаться исчерпанным во всех отношениях. В этом нетрудно убедиться, ознакомившись хотя бы с изданными в последние годы руководствами, монографиями и обзорами. До сих пор, в частности, остается
почти не изученной начальная картина процесса становления и организации деятельного состояния секреторного аппарата желудка. А она, по сложившимся представлениям, необычна. Для нее в отличие от всех иных возбудимых тканей весьма характерна чрезмерно длительная, измеряемая пятью -десятью минутами, величина латентного периода рефлекторного возбуждения желудочной секреции (И.А. Алешин и др., 1983).Однако в свою очередь экспериментальные исследования И.П. Павлова позволили разработать методики получения чистого желудочного сока, определения рН, концентрации, механизма секреции и ряда других показателей (В.А. Лукьяновский и др., 1988).
Желудок у свиней представлен в виде мешкообразной формы смешанного типа. В нем выделяют входную кардиальную часть с кардиальным отверстием пищевода и выходную пилорическую часть, переходящую в двенадцатиперстную кишку. Тело желудка изогнуто. Различают также большую кривизну желудка и малую кривизну. Отличается от других наличием выпячивания стенки в кардиальной части - дивертикула, а также отсутствием желез в слизистой оболочке кардиальной части (А.И. Акаевский и др., 1984; И.В. Хрусталева и др., 1994).
По мнению А.Н. Голикова и др. (1991), в желудке пища активно перемешивается, частично всасываются вода, соли, сахар. Здесь вырабатываются антианемический фактор и ряд биологически активных веществ, обеспечивающих интеграцию функций пищеварительного аппарата - гастрин, серото-нин, мотилин, гистамин и др. Через его стенку выводятся аммиак, мочевина и другие конечные продукты обмена. Одним из участников пищеварительного гидролиза в желудке, как известно, является соляная кислота. Она обеспечивает оптимум рН для ферментов желудка, влияет на степень ионизации фермент-субстратного комплекса, конформацию белковой молекулы фермента и другие факторы, определяющие скорость реакции.
Как считают А.А. Сысоев (1980), О.Б. Сеин и др. (1998), в составе секрета желудочных желез здоровых животных содержатся эндопептидазы -пепсин, ренин (химозин), хлористоводородная кислота (НС1), небольшое количество желудочной липазы. У свиней количество свободной хлористоводородной кислоты в составе желудочного содержимого - 10-30 титр. ед. Основные секреторные нервы - блуждающие, их перерезка при "мнимом кормлении" ведет к прекращению отделения желудочного сока. Механическая обработка - перемешивание пищи, а затем и передвижение ее в кишечник -осуществляется сокращениями мышц желудка, т.е. способностью стенок желудка обжимать содержимое перистальтикой гладких мышц и эвакуировать кормовые массы в двенадцатиперстную кишку. Регулируется двигательная функция нервно-рефлекторным путем посредством волокон блуждающего нерва, усиливающего перистальтику, и симпатическим, понижающим силу и ритмичность сокращений.
В работе Е.З. Ткачева (1981) указывается, что высокий уровень продуктивности свиней предусматривает использование в качестве основного корма зерна и высокопротеиновых продуктов. Эти кормовые продукты имеют целый ряд преимуществ: высокую концентрацию энергии и питательных веществ в единице их массы, удобство их хранения, транспортировки и скармливания свиньям. Лучшим кормом для свиней является ячмень. При этом перевариваемость органического вещества ячменя составляет около 86%. Также автором отмечено, что концентрированный тип кормления полностью обеспечивает животных определенным количеством энергии, белка и аминокислот, углеводов, липидов, жирных кислот, минеральных веществ (микро- и макроэлементов) и витаминов. Эти потребности определяются наследственными, половыми, возрастными и прочими особенностями животных и зависят прежде всего от живой массы, физиологического состояния, условий содержания (температура воздуха, влажность) и т.д. Признаками удовлетворения потребностей животных в питательных веществах являются нормальный рост и развитие, постоянная живая масса и упитанность, нормальное жизнеспособное потомство, отсутствие заболеваний.
Система процессов, обеспечивающих ассимиляцию пищи (A.M. У го-лев, 1985; М.З. Каган, 1990; Ю.Я. Лея, 1996), включает в себя три основных этапа: питание, пищеварение, всасывание. Определение кислотности в пробах желудочного содержимого дает объективную информацию о функционально-морфологическом состоянии гастродуоденального отдела желудочно-кишечного тракта, особенностях функционирования энтерального барьера и состоянии гомеостаза, так как в интересах правильной и эффективной патогенетической терапии необходимо проводить рН-метрическую диагностику кислотообразования желудка.
Одним из наиболее современных и преимущественных определений реакции желудочного содержимого, по мнению Я.С. Циммермана и др. (1998), является интрагастральная рН-метрия, усовершенствованная В.Г. Мышем (1982) с помощью модифицированных стеклянных электродов, позволяющих полностью погрузить шарик измерительного электрода в слизистую оболочку желудка. Это дает возможность измерения рН непосредственно в желудке, в естественных условиях сокоотделения, с непрерывной регистрацией изменений рН в разных отделах желудка под влиянием различных стимулирующих и ингибирующих факторов. В настоящее время применяются и используются такие приборы, как ацидогастрометрический автоматизированный комплекс АГМ-24МП, предназначенный для непрерывной регистрации значений рН в пищеводе, желудке и двенадцатиперстной кишке в течение 24 часов с интервалом считывания каждые 20 секунд, с последующей передачей массива данных для обработки на ПК (А.В. Яковенко, 1999).
Поведенческие реакции и общие клинические показатели у свиней при воздействии ТКЭС
В связи с отсутствием в доступной нам литературе сведений о применении ТКЭС у свиней, нами были проведены эксперименты, целью которых являлось изучение действия оптимального режима электростимуляции на общее состояние животных.
За основу был взят режим, который применялся А.Б. Сысоевым (1998). В данном случае этот режим стимуляции являлся оптимальным, так как, по мнению автора, он не оказывал отрицательного влияния на общее состояние и интерьерные показатели свиней.
При проведении ТКЭС у свиней с помощью прибора "Трансаир-2" (рис. 3) применялся следующий режим: на электроды с гидрофильными прокладками, закрепленными на области лобной и затылочной костях (рис. 4), сначала подавался постоянный ток, плавно нарастающий в течение 2 мин от 0 до 6,5 мА. Затем на электроды в той же полярности подавались прямоугольные импульсы с частотой 70-80 Гц длительностью 3-4 мс, амплитуду которых медленно увеличивали в течение 2 мин до 3 мА, что в соотношении с постоянным током составляло 2:1. Продолжительность электростимуляции составляла 30 мин.
При выборе данного временного показателя за точку отсчета принимали продолжительность ТКЭС, используемую в медицинской практике.
Во время ТКЭС у свиней проводили учет общих клинических показателей только после уравнительного периода, когда животные успокаивались, привыкали к фиксатору с электродами и общей обстановке эксперимента.
Поведение животных оценивали по комплексу поведенческих реакций, которые были объединены в четыре группы: "Ф" - фоновое поведение, состояние свинок до начала стимуляции; "С" - спокойное состояние, животное лежит, движения ограничены, сонливость; "В - С - В" - нестабильное состояние, спокойное состояние сменяется возбуждением и наоборот.
Исследования показали, что ТКЭС не оказывает отрицательного влияния на организм подопытных животных. При этом температура тела у свиней в период эксперимента находилась в пределах физиологической нормы и составляла 38,5-39,0 С. Во время электростимуляции у животных отмечалась умеренная тахикардия (102,5±10,5 уд./мин) и повышение частоты дыхания (32,6±2,5 дых./мин). Однако после сеанса данные показатели возвращались к исходным величинам 71,2±2,5 уд./мин и 17,1±1,5 дых./мин.
Наблюдения за поведенческими реакциями свиней в период ТКЭС показали, что в первые минуты стимуляции у всех животных наблюдалось кратковременное возбуждение, которое проявлялось преимущественно в виде повышенной двигательной активности. Свиньи становились беспокойными, постоянно делали перемежающие движения ногами, выгибали спину, мотали головой и пытались освободиться от фиксатора. Некоторые животные ложились на пол фиксационного станка, а затем резко вставали и делали попытки выпрыгнуть из него.
Через 5-10 минут свиньи успокаивались. У них наступало сонливое состояние, они ложились на пол, многие животные закрывали глаза, изредка издавали короткие и негромкие звуки в виде "похрюкивания" и "чавканья". При этом реакция на внешние раздражители (покалывания иглой, подталкивания) у всех животных была сохранена. Такое состояние наблюдалось в течение всего периода ТКЭС и последующие 10-15 мин после нее.
Затем после проведения сеанса электростимуляции и перевода в станок свиньи активизировались, при даче им корма они полностью его съедали.
Анализ этограмм показал, что поведение подопытных животных как в общем, так и в фиксационном станке было обычным. При этом количество перемещений по станку, разведывательных движений, число издаваемых звуковых сигналов, их характер и продолжительность до стимуляции и после стимуляции было практически одинаковым. Также не наблюдалось элементов агрессивности. Драки и преследования отсутствовали.
В то же время у свиньи №3 проявлялся неадекватный поведенческий характер. После перевода ее в общий станок у нее возникало повышенное беспокойство, которое сопровождалось постоянным перемещением, обнюхиванием пола и стенок, издаванием протяжных звуков и безразличием к другим животным. При даче корма она долго его обнюхивала, "рылась" носом и только после приступала к еде. Во время приема корма часто останавливалась, оглядывалась по сторонам, отходила от кормушки, вновь возвращалась и принималась за корм. Однако период адаптации у свиньи №3 продолжался не долго и через 40-50 мин ее поведение не отличалось от поведения других животных, находившихся в станке.
У свиньи №8 в течение всего периода наблюдалось возбужденное состояние. Она постоянно то ложилась, то "вскакивала", часто передвигала ногами, терлась боками и головой о стенки станка, пытался освободиться от фиксаторов, однако все эти признаки исчезали через 20 минут после окончания сеанса.
Гистоморфологические особенности различных отделов желудка у свиней при использовании ТКЭС
Фундаментальные работы И.П. Павлова, заложившие основу современных представлений о деятельности пищеварительных органов, явились толчком к бурному развитию исследований в этой области физиологии в нашей стране и за рубежом.
Помимо классических методов, к изучению пищеварительной системы были привлечены электрофизиологический, иммунологический методы, последние достижения морфологического и биохимического анализа, широко стали применяться инструментальные исследования желудочно-кишечного тракта и т.д. Все это существенно расширило знания о физиологии секреторных и мышечных клеток желудочно-кишечного тракта, составе и свойствах пищеварительных секретов и о характере их взаимодействия с пищевыми веществами, о пищеварительных гормонах и, наконец, об особенностях центральной и периферической нервной регуляции работы этой системы. Однако еще нельзя сказать, что достигнутый уровень знаний о сущности процессов пищеварения вполне раскрывает все его возможности, в частности остается еще много вопросов по физиологии желудка, регуляции его секреторной и сократительной функции.
Физиология желудка подразумевает наличие совершающихся одновременно многих процессов, в том числе регуляции тонуса, сокращения и расслабления гладких мышц, микроциркуляции с обеспечением транспорта кислорода, регуляторных веществ, компонентов, составляющих секрет многочисленных секреторных клеток, внутреннего фактора, гидролитических процессов в полости желудка.
Соподчинение и согласование функций желудка, двенадцатиперстной кишки, печени, поджелудочной железы обеспечивается рефлекторно с участием центральной и автономной нервной системы, а также специфическим набором биологически активных веществ нервной системы и специализированных клеток в стенке самого пищеварительного аппарата.
Многими исследователями в экспериментах установлено влияние ней-ротензина, гастрина, холецистокинина, энкефалинов, субстанции Р и других нейропептидов на секреторную и моторную функцию желудка и кишечника, их взаимное влияние на содержание исследованных пептидов в крови. Это, однако, относится к экспериментам, основанным на инфузии синтетических нейропептидов в общую циркуляцию или их инъекции в структуры головного мозга. Что касается экспериментов, направленных на использование эндогенных нейропептидов с целью регуляции функции желудка, в частности секреторной и моторной его активности, то таких работ в доступной нам литературе мы не обнаружили. По-нашему мнению, это связано с тем, что практически до 80-х годов прошлого столетия экспериментальная физиология не располагала средствами прямого воздействия на неиропептидные системы. И только с появлением новых методов электронейростимуляции, обладающих большим потенциалом возможностей по созданию на их основе биотехнических систем, наметилась тенденция к "привлечению" эндогенных нейропептидов к коррекции функционального состояния органов, систем и организма в целом.
Одной из разновидностей электронейростимуляции является транскраниальная электростимуляция (ТКЭС) - электрическое воздействие на головной мозг.
С точки зрения электрической характеристики, ТКЭС представляет собой сочетание постоянного тока в малых режимах (от 0,1 - до 7 мА) и импульсного тока в виде прямоугольных импульсов с частотой в пределах 70-80 Гц и длительностью от 3 до 4 мс. При этом соотношение импульсного тока с постоянным должно составлять 2:1. Именно поддержание такого режима оказывает оптимальное воздействие на центры головного мозга.
С точки зрения биологической оценки метод ТКЭС основан на подборе характеристик электрического сигнала, максимально нормализующего работу центров управления адаптационной системой организма, локализованных
в срединных структурах головного мозга. При ТКЭС преимущественное воздействие осуществляется на гипоталамо-гипофизарную и опиоидную системы, вырабатывающие спектр опиоидных пептидов, регулирующих деятельность органов и систем на клеточном уровне.
Вначале ТКЭС использовалась с целью центральной электроанальгезии. Для этого подбирался режим электровоздействия, который вызывал эффект электротранквилизации, позволяющий путем замедления проведения нервных импульсов в лобных областях коры обеспечивать стойкое ослабление коркового компонента эмоциональных реакций и их вегетативных проявлений. Метод электроанальгезии нашел широкое применение в медицинской и ветеринарной практике.
Значительно позже ТКЭС стали применять с целью коррекции органов и систем путем активизации опиоидных систем. Как уже отмечалось в обзоре литературы, опиоидные пептиды являются одним из классов неиропептидов включающих энкефалины (лей- и мет- ), эндорфины (а, р, у), динорфины, к ним также относятся гипоталамические либерины и статины, гормоны гипофиза, биоактивные пептиды желудочно-кишечного тракта, пептиды - регуляторы сна и некоторые другие. Образуются опиоидные пептиды не только в нервной системе, но и в пищеварительном тракте, надпочечниках, половых железах, иммунокомпетентных клетках. Воздействуют опиоиды на клетки-мишени по эндокринному, нейрокринному, паракрийному и медиаторному типу через опиоидные рецепторы. В функциональном отношении опиоидные пептиды являются регуляторами деятельности многих органов и тканей, в том числе и пищеварительной системы.
Учитывая возможности ТКЭС и биологическое значение опиоидных пептидов, мы решили провести серию экспериментов по выяснению морфо-функциональных особенностей желудка у свиней после воздействия ТКЭС.
