Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Функции и маркеры Т-лимфоцитов 13
1.1.1. Иммунологическая толерантность к аутологичным антигенам 13
1.1.2. а/р CD2+Т-лимфоциты в иммунобиологическом надзоре организма 15
1.1.3. y/8CD2+ Т-клетки и их роль в иммунобиологическом надзоре 25
1.1.4. Уникальная субпопуляция у/8 WC1 CD2 Т-лимфоцитов крупного рогатого скота 29
1.2. Иммунные факторы в этиологии и патогенезе хронических эндометритов у крупного рогатого скота 31
1.2.1. Иммунодепрессия в возникновении и развитии эндометрита у коров 31
1.2.2. Клеточный иммунитет в этиологии и патогенезе эндометритов у коров . 34
1.3. Заключение по обзору литературы 38
2. Материалы и методы 41
2.1. Выделение лимфоцитов и макрофагов 41
2.2. Изучение прямой антимикробной активности Т-лимфоцитов крупного рогатого скота 49
2.3. Определение влияния стимуляции эндогенного синтеза бактерицидных Т-лимфокинов на восстановление репродуктивной функции у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом 50
3. Результаты исследований 53
3.1. Изучение in vitro у крупного рогатого скота Т-клеточного иммунитета по отношению к штаммам условнопатогенной микрофлоры 53
3.1.1. Прямое бактерицидное действие Т-клеток крупного рогатого скота по отношению к штаммам синегнойной палочки 53
3.1.2. Определение специфичности антимикробного Т-клеточного иммунитета по отношению к штаммам условнопатогенной микрофлоры 61
3.2. Клеточный иммунитет у клинически здоровых коров и коров с хроническим эндометритом 64
3.3. Влияние инактивированной суспензии синегнойной палочки на восстановление воспроизводительной функции у коров с хроническим эндометритом 66
3.4. Изменение клеточного иммунитета у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом до и после обработки инактивированной суспензией штаммов Ps. aeruginosa 71
4. Обсуждение результатов 74
Выводы 86
Практические предложения 88
Литература 89
- а/р CD2+Т-лимфоциты в иммунобиологическом надзоре организма
- Клеточный иммунитет в этиологии и патогенезе эндометритов у коров
- Выделение лимфоцитов и макрофагов
- Прямое бактерицидное действие Т-клеток крупного рогатого скота по отношению к штаммам синегнойной палочки
Введение к работе
Актуальность темы. Увеличение продуктивности в молочном скотоводстве в значительной степени зависит от сокращения времени от отела до плодотворного осеменения. Это удлинение сервис-периода часто обусловлено возникновением у коров в послеотельный период воспалительных процессов в половых путях. В этой форме нарушения репродуктивной функции значительный удельный вес принадлежит хроническим гнойно-катаральным эндометритам (8,99).
Несмотря на многообразие экзо- и эндогенных факторов, вызывающих увеличение сервис-периода у крупного рогатого скота, непосредственной их причиной, является угнетение иммунной системы и в первую очередь местного иммунитета тканей половых путей. Подавление активности лимфоидной ткани матки снижает ее репаративную регенерацию и способствует колонизации ее условнопатогенной микрофлорой. Данная микрофлора, синтезируя факторы патогенности (эндо-, экзотоксины и др.), усиливает эту иммунодепрессию (29, 190).
В настоящее время существует большое количество способов ликвидации воспаления и восстановления воспроизводительной функции у коров с хроническими гнойно-катаральными эндометритами. Большинство этих способов основано на применении антимикробных препаратов. Существенным недостатком их является высокая устойчивость к ним штаммов условнопатогенных микроорганизмов, а также их иммунодепрессивное действие (68, 84). В связи с этим наиболее перспективным направлением в профилактике и ликвидации эндометритов у коров считают разработку способов восстановления активности местного иммунитета тканей матки (79, 106).
Известно, что Т-лимфоциты осуществляют важную роль в регуляции практически всех звеньев иммунитета. В частности, они сами синтезируют и регулируют синтез другими клетками про- и противовоспалительных
цитокинов. Соотношение этих цитокинов определяет направленность обменных процессов в клетках, их устойчивость к действию апоптогенных факторов и многие другие физиологические функции в организме, оказывающие непосредственное влияние на репаративные процессы в тканях (131,168,174).
Недавно было показано, что Т-лимфоциты некоторых видов млекопитающих оказывают антимикробное действие к Ps. aeruginosa (внеклеточный патоген) не только опосредованно через активацию и регуляцию антителогенеза, но и осуществляют прямое бактерицидное действие на штаммы этого микроорганизма. Важной особенностью этого иммунитета является специфичность его индукторного звена и неспецифичность - эффекторного. Так, ресенсибилизирующий штамм Ps. aeruginosa вызывает синтез Т-лимфоцитами бактерицидных факторов к широкому спектру штаммов не только других видов, но даже родов и семейств условнопатогенных микроорганизмов (122, 100).
Известно, что липолиполисахарид клеточной стенки синегнойной палочки (как и других грамотрицательных бактерий) является природным иммуномодулятором, способным оказывать существенное влияние на соотношение про- и противовоспалительных цитокинов (63, 181). Соотношение этих про- и противовоспалительных цитокинов определяет не только направленность иммунного ответа, но и интенсивность регенеративных процессов в тканях.
Таким образом, иммуномодулирующий препарат на основе инактивированных штаммов Ps. aeruginosa может стимулировать восстановление воспроизводительную функцию у коров после отела (в том числе и у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом) посредством активации местного иммунитета лимфоидной ткани матки, индуцирующего ликвидацию воспаления и стимулирующего репаративные процессы в маточных структурах.
Научная новизна. Впервые показано, что у крупного рогатого скота:
Т-лимфоциты обладают прямой бактерицидной активностью по отношению к внеклеточным патогенам, которая усиливается после специфической ресенсибилизации;
эта антимикробная функция Т-клеток возрастает в присутствии макрофагов;
для активации этого вида иммунитета, в отличие от иммунитета к внутриклеточным патогенам, не требуется непосредственного контакта Т-клетки и макрофагов. Он осуществляется синтезом макрофагами ИЛ-1;
индукторное звено прямого антимикробного иммунитета является специфическим, тогда как эффекторное - неспецифично и направлено против широкого спектра внеклеточных патогенов;
цитотоксическое проявление этого вида иммунитета, в отличие от иммунитета к внутриклеточным патогенам, не требует обязательного контакта Т-лимфоцита и клетки-мишени, а опосредуется синтезом Т-клетками растворимых бактерицидных факторов;
Т-лимфоциты способны оказывать прямое антимикробное действие на большинство условнопатогенных микроорганизмов, в том числе и Act. pyogenes, нередко обнаруживаемых в патологическом материале, полученном от коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом;
у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, по сравнению со здоровыми коровами, отмечена тенденция снижения прямой бактерицидной активности Т-лимфоцитов периферической крови, а также внутрипопуляционное изменение среди них - снижение общей численности Т-клеток с одновременным увеличением количества Е-РОК;
внутриматочная обработка ИССП, по сравнению с аналогичной обработкой левоэритроциклином коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, оказала сильный противовоспалительный эффект, сильнее активировала репаративную регенерацию матки, повысила результативность
от первого осеменения, за 90 суток и значительно укоротила период времени от начала лечения до плодотворного осеменения;
более сильное протективное действие ИССП, по сравнению с левоэритроциклином, было связано с интенсивным изменением у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, местного и отчасти системного соотношения про- и противовоспалительных цитокинов. У коров, обработанных ИССП, в первые сутки после обработки происходило обострение воспалительного процесса, сопровождающееся увеличением выделения из матки гнойных масс, повышением температуры тела, снижением аппетита, суточного удоя, что было обусловлено действием прововоспалительных цитокинов. Стимуляция восстановления маточных структур после ликвидации воспалительного процесса была связана с активностью противовоспалительных цитокинов, индуцирующих анаболитические процессы в организме и обладающих антиапоптогенным действием;
у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, после обработки ИССП, по сравнению с ее началом, отмечено увеличение бактерицидной активности Т-лимфоцитов периферической крови, а также общего их количества, происшедшие, главным образом, за счет возрастания Е-РОК.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы было определение возможного существования у Т-лимфоцитов крупного рогатого скота прямой антибактериальной активности к внеклеточным патогенам; изучение иммунопротективной роли Т-лимфоцитов в восстановлении репродуктивной функции у коров после отела; а также выяснение возможности сокращения времени восстановления этой функции посредством активации местного иммунитета тканей матки.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Определить возможное существование у Т-лимфоцитов крупного рогатого скота прямой бактерицидной активности по отношению к внеклеточным патогенам.
1. Выяснить роль макрофагов в существовании этой возможной
функции у Т-лимфоцитов крупного рогатого скота.
2. Изучить специфичность индукторного и эффекторного звеньев этого
возможного вида иммунитета.
Определить конкретные механизмы этой возможной Т-клеточной антимикробной активности.
Провести сравнительное изучение содержания Т-, В-лимфоцитов, Е-РОК и бактерицидной активности Т-клеток периферической крови здоровых коров и коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом.
Выявить возможность коррекции местного иммунитета лимфоидной ткани матки у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, с целью стимуляции его противовоспалительного и репаративного эффекта.
Сравнить эффективность обработки ИССП и левоэритроциклином коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, по времени прекращения воспалительного процесса, времени от начала лечения до плодотворного осеменения, а также по числу коров, ставших стельными от первого осеменения и за 90 суток.
7. Изучить численность Т-, В-лимфоцитов, Е-РОК, а также
бактерицидную активность Т-клеток периферической крови коров с
хроническим гнойно-катаральным эндометритом, до и после обработки их
ИССП.
Практическая значимость работы. Разработан метод определения прямого антимикробного иммунитета Т-лимфоцитов крупного рогатого скота по отношению к внеклеточным патогенам, Данный метод может быть использован в научных исследованиях по изучению этого вида иммунитета в норме и различных патологиях у животных. Создан новый подход в разработке методов иммунодуляции местного иммунитета тканей матки,
проявляющийся в активации антимикробного иммунитета (в том числе и Т-клеточного), а также в усилении репаративной регенерации в этих тканях. Данная разработка может быть использована для дальнейшего совершенствования предложенного подхода иммунокоррекции местного иммунитета лимфоидных тканей матки.
Основные положения, выносимые на защиту: Т-лимфоциты крупного рогатого скота, как и других видов млекопитающих, обладают прямой бактерицидной активностью к внеклеточным паразитам. Эта активность усиливается после специфической ресенсибилизации, а также в присутствии макрофагов. Данное стимулирующее действие макрофагов обусловлено синтезом ими ИЛ-1.
Индукторное звено прямого антимикробного иммунитета Т-лимфоцитов носит специфический характер, тогда как эффекторное -неспецифично и проявляет бактерицидную активность к широкому спектру внеклеточных патогенов, в том числе и условнопатогенным микроорганизмам, нередко выделяемым из патологического материала, полученного от коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом.
Обработка коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, ИССП стимулирует активность местного иммунитета лимфоидных тканей матки, проявляющейся в ликвидации воспалительного процесса и усилении восстановления маточных структур.
Главное иммуномодулирующее действие ИССП связано с индукцией ЛПС клеточной стенки Ps. aeruginosa миграции фагоцитарных клеток и лимфоцитов в очаг воспаления и поочередная стимуляция местного и отчасти системного синтеза клетками иммунной системы (в первую очередь Т-лимфоцитами) про- и противовоспалительных цитокинов, обеспечивающих антивоспалительное и репаративное действие в матке.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на международной научно-практической конференции ФГОУ РАМЖ «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового
обеспечения», 2003 и 2004 гг., п. Быково Московской обл.; международной научно-практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки» ВГНИИЖ, п. Дубровицы, 2004 г.
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 7 печатных работах.
а/р CD2+Т-лимфоциты в иммунобиологическом надзоре организма
Функционально а/р Т-клетки подразделяются на две большие субпопуляции - хелперную и киллерную. Основными маркерами для них являются: CD4 для Т-хелперов (хотя от 5 до 10% этих лимфоцитов обладают цитотоксической активностью), CD8 для киллеров (43,153,177). а/р ТКР представляют собой гетеродимер, состоящий из двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидной связью. В мембране клеток ТКР тесно связан с полипептидным комплексом - CD3 антигеном, образуя ТКР комплекс (33,109). CD3 принимает непосредственное участие в трансмембранной передаче активационного сигнала после связывания ТКР с антигеном (34,113). В формировании этого сигнала у Th принимает участие СД4 молекула, а у Т-киллеров - CD8. (43,103,109). а/р Т-клетки, как хелперы, так и киллеры, распознают не сам антиген, а в комплексе его с антигенами МНС. Такой вид распознавания антигена имеет важное биологическое значение, так как он предупреждает блокаду внеклеточными "чужеродными" антигенами ТКР ЦТЛ и, соответственно, подавляет генерацию инфекции внутриклеточными патогенами (33,109,153). Большинство клеток, осуществляющих иммунологический надзор, способны осуществлять антигенпрезентирующую функцию, но ведущая профессиональная роль в этом процессе принадлежит дендритным клеткам (5, 27, 88). Дендритные клетки происходят из предшественников лимфоидного и миелоидного рядов кроветворных клеток (5, 140). Незрелые формы этих клеток преимущественно локализованы в эпителии слизистых оболочек и в эпидермисе, они имеют высокую фагоцитарную активность и низкую антигенпрезентирующую функцию (27).
АПК являются первыми клетками системы иммунобиологического надзора, формирующими реакции отторжения "чужого". Дендритные клетки, захватив антиген, перемещаются из интерстиция тканей в микроциркуляторное русло лимфатической системы и далее в Т-клеточные зоны селезенки и лимфатических узлов (5, 88). В процессе этого перемещения происходит созревание дендритных клеток и процессинг ими антигенов. Созревание стимулируют ИЛ-1р\ ФНОа, ГМ-КСФ и ПГЕ2 (27), синтез которых индуцируется молекулами клеточной стенки патогенов и их метаболитами (49). Фагоцитированные дендритными клетками антигены подвергаются расщеплению в протеосомах, а затем с помощью ТАР белков (transporter for antigen presentation) транспортируются в просвет гранулярной эндоплазматической сети, где они связываются с молекулами антигенов МНС I класса. (103) Образовавшийся комплекс через аппарат Гольджи транспортируется на плазматическую мембрану, где он и экспрессируется (5,27,103). Образование комплекса "чужеродный" антиген с молекулой МНС II класса происходит иначе. В цитозоле эта молекула находится в комплексе с инвариантной цепью пептида (Л), который закрывает антигенсвязываюшую выемку данной молекулы. Из цитозоля комплекс МНС II класса с Л пептидом через эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи попадает в лизосому, где в кислой среде происходит отщепление этого пептида, а его место занимает антигенный пептид. Затем комплекс антиген МНС II класса поступает на цитоплазматическую мембрану (9, 26). Захватывая и процессируя антиген, дендритные клетки проходят стадию созревания, которая сопровождается их миграцией в Т-зоны лимфоидных органов, сближение дендритных клеток с Т-хелперами обеспечивается хемокинами - MIP-3P, SLC, а начальное межклеточное контактное взаимодействие - адгезивными молекулами CD54 (ІСАМ-1) и CD58 (FLA-3), которые служат лигандами для CD2 и LFA-1 антигенов Т-лимфоцитов. Взаимодействие комплекса антигена и аутологичного антигена I или II класса МНС с комплексом сс/р TKP/CD3/CD4 обеспечивает первый активационный сигнал для Т-хелперов (9,112,153). Этот сигнал индуцирует экспрессию данными клетками CD40L, который взаимодействует с CD40 дендритных клеток, что обеспечивает дополнительную активацию дендритных клеток, сопровождающуюся повышением экспрессии на них костимуляторных молекул CD80 (В7-1), CD86 (В7-2) и синтезом ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, ФНОа и ИЛ-15 (83,130,181). ИЛ-1 обеспечивает пролиферацию и предупреждает апоптоз "naive" Т-хелперов (40,113). Помимо этой иммунорегуляторной функции, он осуществляет нейроиммунноэндриное взаимодействие в организме (40). У крупного рогатого скота, как и у других видов млекопитающих, семейство ИЛ-1 содержит три лиганда: ИЛ-1а. ИЛ-ір, ИЛ-1 R- антагонист и два рецептора (90).
Костимулирующие молекулы CD80 и CD86 дендритных клеток, взаимодействуя с антигеном CD28 на поверхности Т-хелперов, дают им второй сигнал, который опосредуется через активацию специфической фосфодиэстеразы, вызывающей снижение внутриклеточного 3,5 циклического аденозинмонофосфата и стимулирующей экспрессию HJI-2R а также секрецию этого лимфокина. ИЛ-2, как и ИЛ-1, обеспечивает пролиферацию CD4 клеток и их апоптогенную защиту (17,20,169). В то же время у мышей, дефицитных по эндогенному, генетически детерминированному синтезу ИЛ-2, не установлено значительных нарушений в формировании клонов Т-хелперов (168). Недавно было обнаружено, что функцию ИЛ-2 в этом процессе дублирует ИЛ-15, причем антиапоптогенное действие последнего выше, нежели ИЛ-2 (51,168).
Взаимодействие CD40L ct/p TKP/CD3/CD4 лимфоцитов с CD40 антигеном дендритных клеток активизирует синтез ими ИЛ-12. Этот цитокин осуществляет ведущую роль в обеспечении иммунного ответа по ТЫ-пути формирования антигенспецифических (рестриктированных по МНС I класса) цитолитических Т-лимфоцитов (49,51). В индукции ТЫ могут участвовать и В-клетки, которые также экспрессируют CD40L, и, взаимодействуя с CD40 антигеном активированных CD4+ Т-лимфоцитов, продуцируют ИЛ-12(69,123). Связывание ИЛ-12 с ИЛ-12ІІ CD4+ Т-клеток стимулирует синтез ими цитокинов ТЫ пути иммунного ответа - ИФу и ФНОа.(160,189) Данные цитокины обеспечивают формирование клонов ЦТЛ и активируют цитолитическую функцию (43,115,). Обработка животных, экспериментально инфицированных С. pseudotuberculosis моноклональными антителами к ИФу или ФНОа, значительно увеличила пролиферацию бактерий в органах и повысила летальность этих животных. Аналогичным действием обладали моноклональные антитела к маркерам Т-хелперов и Т-киллеров, соответственно CD4 и CD8. Причем максимальное проявление иммунодепрессивного действия этих антител наблюдали с первых по четвертые сутки после инфицирования, что свидетельствует о том, что критическим периодом формирования а/р ЦТЛ является этот период времени после инфицирования (108). Помимо стимуляции CD4 Т-лимфоцитами синтеза ИФу и ФНОа ИЛ-12 сам обладает способностью активировать цитолитическую активность Т-киллеров, а также стимулировать подобную активность NK-клеток (48,170).
Клеточный иммунитет в этиологии и патогенезе эндометритов у коров
В связи с тем, что условнопатогенная микрофлора практически неотделима от среды, окружающей животных, в процессе эволюции выработалась система защитных механизмов к их патогенному действию на репродуктивную функцию.
Первым из этих защитных механизмов является анатомический. Во время стельности и лютеальной фазы шейка матки закрыта, что препятствует проникновению данной микрофлоры в полость матки. Экспериментальное введение в этот период репродуктивной стадии в полость матки таких микроорганизмов, как Е. coli, Staph, aureus и Ps. aeruginosa стимулировало воспалительные процессы в эндометрии (166). Бластоцисты, полученные на седьмые сутки стельности от коров, больных субклиническим гнойно-катаральным эндометритом, были живыми, но их прозрачная оболочка была практически полностью фагоцитирована активированными нейтрофилами и макрофагами. В дальнейшем у таких коров происходило нарушение плацентации вследствие неподготовленности маточных структур к данному процессу (42).
При экспериментальном введении в матку условнопатогенной микрофлоры во время эстральной (в отличие от лютеальной) фазы репродуктивной функции была установлена полная их элиминация при отсутствии каких-либо воспалительных процессов (19, 166). Эта разница в устойчивости эндометрия к инфицированию условнопатогенной микрофлорой обусловлена различными иммуномодулирующими свойствами прогестерона и эстрадиола (23, 29, 186). Показано, что эстрадиол стимулирует выход из кровеносного русла в эндометрий его собственную пластинку и подслизистый слой дендритных клеток, эозинофилов, лимфоцитов, моноцитов и полиморфноядерных лейкоцитов (55). Моноциты, лейкоциты и клетки эндометрия под действием эстрадиола синтезируют ИЛ-8, индуцирующий образование супероксидного аниона, оксида азота и дегрануляцию у фагоцитов (39, 107) - главных механизмов антибактериальной активности этих клеток. Эстрадиол также стимулирует продукцию моноцитами и лимфоцитами ИФу, активирующего цитоксическую активность ЦТЛ и НК клеток (29). Помимо этого в период эструса в 7-8 раз возрастают опсонизирующие (по отношению к бактериям) свойства маточной слизи, а также ее прямая бактерицидная активность (187). Во время коитуса ТФРр плазмы семени дополнительно стимулирует синтез клетками эндометрия ИЛ-8 (155). Одно из проявлений тесного взаимодействия иммунной и эндокринной систем в репродуктивной функции - синергизм ФНОа и ГЕТга во время родов. Во время беременности в плаценте синтезируется растворимый (55 кДа) рецептор к ФНОа, блокирующий действие этого цитокина. Перед родами продукция данного рецептора резко подавляется, что приводит к накоплению свободного ФНОа, который совместно с ШТга стимулирует роды (131, 144). Другим проявлением тесного взаимодействия иммунной и эндокринной систем при родах является изменение клеточных иммунных реакций под действием кортикостероидов. Во время отела в крови резко понижается уровень прогестерона и эстрадиола, но в тоже время более чем в четыре раза повышается концентрация глюкокортикостероидов (29). Непосредственно перед отелом и во время его в периферической крови происходит значительное снижение общей популяции лимфоцитов (CD3+ и mlg+), а также их отдельных субпопуляций CD2+, CD3+, CD4+, CD8+, WC1+ и mlg+ (101, 169). В то же время в других исследованиях в первую неделю после отела в периферической крови отмечено увеличение CD4+ Т-клеток, которое снижалось к 16 суткам после отела, динамика CD8+ и WC1+ Т-лимфоцитов была противоположна динамике CD4+Т-клеток (169, 179). По данным Shafer-Weaver К.A et al. (161), в первые сутки после отела по сравнению с серединой лактации в периферической крови снижено почти в 1,5 раза уб и mig экспрессирующих клеток, но почти в два раза увеличено количество моноцитов. CD4+ Т-лимфоциты продуцировали ИЛ-4 и ИЛ-10, тогда как в середине лактации наоборот, ИФу и ИЛ-2. После отела происходит снижение митогениндуцированной активности лимфоцитов и снижение синтеза ИФу (91, 162), в то же время не отмечено снижения синтеза Ig В-клетками (178). Хотя у лимфоцитов происходило снижение продукции ИФу, синтез этого цитокина моноцитами возрастал (167). У коров непосредственно перед отелом, во время него и в течение 2-3 недель после в периферической крови происходит увеличение численности нейтрофилов, возрастает их фагоцитарная активность, хемотаксис, но снижается образование супероксидного радикала, оксида азота и антителзависимая цитотоксичность (30, 46, 157). С увеличением количества стельностей все эти функции нейтрофилов еще более снижаются (74). Считают, что снижение продукции супероксидного аниона нейтрофилами в течение недели после отела связано с иммунодепрессивным белком стельности, пик которого происходит в этот период времени. Угнетение кислородзависимой бактерицидной активности нейтрофилов может быть связано и со снижением уровня цитокинов ТЫ пути, которые стимулируют их синтез. Недостаточность этой иммунореактивной функции нейтрофилов компенсируется их кислороднезависимой антибактериальной активностью - увеличением продукции антимикробных пептидов, а также лактоферрина и калипротектина (соответственно, связывающих железо и цинк, необходимых для роста и размножения бактерий) и других. У коров, у которых происходит задержание последа с последующим развитием эндометрита, по сравнению с коровами без этой формы патологии, перед отелом, во время него и после весь антимикробный спектр активности нейтрофилов значительно снижен (46, 67, 74). У коров с хроническим эндометритом почти в два раза снижена пролиферация лимфоцитов периферической крови (127, 136, 157).
У крупного рогатого скота, как и у других видов млекопитающих, в патогенезе воспалительных процессов значительная роль принадлежит острофазным белкам, синтезируемым клетками печени - гаптоглобину и сывороточному амилоиду А, в отличие от человека, у данных животных уровень С-реактивного белка в крови не зависит от остроты воспаления (86). Индукторами синтеза этих белков являются ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНОа. У коров после отела увеличивается концентрация сывороточного амилоида А, участвующего в клиренсе микроорганизмов (21). В этот же период у них происходит увеличение уровня гаптоглобина в секрете матки. Пик в первые сутки с последующим снижением его параллельно восстановлению маточных структур, Этот острофазный белок обладает антипротеазной активностью и связывает железо (наряду с трансферрином), необходимое для роста микроорганизмов. У маток с контаминацией репродуктивных органов Е. coli, Clostridia sp., Staph, aureus, Strept. uberis Enterococcus sp. было обнаружено повышенное содержание этого белка. В то же время не установлено какой-либо зависимости между контаминацией и восстановлением маточных структур. У этих животных не было установлено изменения в маточной слизи, сывороточного амилоида А и церулоплазмина (152). В индукции местного синтеза гаптоглобина ведущая роль принадлежит ПГФ2аи ФНОа (164).
Таким образом, у коров во время отела и в первые три недели после него происходит системное изменение иммунного ответа в сторону Th2 пути в ущерб ТЫ. Этот процесс является физиологически необходимым, так как цитокины ТЫ обладают сильным апоптогенным действием и могут вызывать апоптоз клеток, обеспечивающих репаративную регенерацию в процессе восстановления маточных структур после отела. Кроме того, данные цитокины стимулируют катаболитические процессы и индуцируют синтез лептина, подавляющего аппетит. Цитокины Th2 пути обладают противоположным действием.
Выделение лимфоцитов и макрофагов
Выделение мононуклеарных клеток с целью определения прямой антимикробной активности Т-лимфоцитов осуществляли традиционным способом на градиенте плотности фикол-верографина (18).
Пробы периферической крови брали с гепарином либо с 3,2% раствором цитрата натрия из расчета, соответственно, 20-40 ЕД/мл крови или 1 часть раствора цитрата натрия и 9 частей крови.
В центрифужные пробирки вносили одну часть раствора фикол-верографина с плотностью 1,077 и на него осторожно наслаивали 6-8 мл периферической крови коров, разбавленной в два раза физиологическим раствором хлористого натрия, забуференного фосфатами с рН 7,4. Полученную смесь оставляли на несколько минут при комнатной температуре и центрифугировали 15 минут при 1500 g. После этого собирали слой мононуклеарных клеток, образовавшийся на границе между плазмой крови и раствора фикол-верографина, отмывали его физиологическим раствором хлорида натрия и доводили до конечной концентрации 4x105 клеток среды RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глутамина, 25 мМ HEPES-буфера, 50 мг/мл
Изучение антибактериальной активности Т-лимфоцитов и восстановление воспроизводительной функци у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом после обработки ИССП, либо левоэритроциклином. гентамицин-сульфата и 10% инактивированной сыворотки плода крупного рогатого скота.
Известно, что при выделении на градиенте плотности мононуклеарных клеток периферической крови крупного рогатого скота (в отличие от приматов) происходит частичная потеря лимфоцитов. Так как популяция лимфоцитов гетерогенна, то при получении клеток белой крови этим способом может происходить частичное изменение соотношения субпопуляций лимфоцитов. В связи с этим при определении количества Т-, В- и Е-РОК лейкоциты периферической крови выделяли посредством гемолиза эритроцитов 0,83%) раствором хлористого аммония, забуференного трис с рН 7,4. В то же время данный метод получения клеток мало приемлем для выявления прямой бактерицидной активности Т-лимфоцитов, так как получаемая популяция клеток белой крови содержит большое количество полиморфнонуклеарных лейкоцитов, которые обладают как прямой антимикробной функцией, так и опосредованной через фагоцитоз.
При выделении лейкоцитов смешивали 7-8 частей раствора хлорида аммония и 1 часть крови, выдерживали 1-2 минуты при комнатной температуре до наступления гемолиза, который останавливали добавлением большого количества забуференного физиологического раствора хлорида натрия с рН 7,4. Полученную суспензию трехкратно отмывали от следов гемолиза и доводили до конечной концентрации 2-4x10б лейкоцитов в 1 мл суспензии.
Получение субпопуляций лимфоцитов, обогащенных Т- или В-клетками, посредством их разделения на поверхности пластика, нагруженного антителами к мембранным маркерам данных лимфоцитов, осуществляли по Мейсону Д и др. (6).
При выделении Т-клеток в чашки Петри вносили по 8 мл физиологического раствора хлористого натрия с рН 7,2, содержащего 10 мкг/мл аффинноочищенных козьих антител к иммуноглобулинам крупного рогатого скота, и адсорбировали эти антитела на поверхности пластика в течение ночи при +4С. Затем сливали раствор антител и дважды обмывали чашку забуференным 0,9% раствором хлористого натрия. Для предотвращения неспецифической адгезии клеток в каждую чашку вносили по 5 мл физиологического раствора хлористого натрия, содержащего 0,2% бычьего сывороточного альбумина, и оставляли при комнатной температуре на 30 мин. После этого сливали данный раствор, отмывали чашки забуференным раствором хлористого натрия с рН 7,2 и вносили в каждую чашку по 2-4x107 мононуклеарных клеток (полученных на градиенте плотности фикол-верографина) в 4 мл культуральнои среды. Инкубировали 45 мин. при +4С. По истечение половины срока инкубации содержимое чашек осторожно перемешивали круговыми движениями. По завершении инкубации неприлипающие клетки ресуспендировали и вновь переносили в чашки Петри, обработанные козьими антителами к Ig крупного рогатого скота, инкубировали 45 мин. при +4С, ресуспендировали осторожным круговым движением. Неприлипающие клетки сливали и доводили культуральнои средой до необходимой концентрации. В полученной субпопуляции лимфоцитов не более 5% клеток реагировали с антииммуноглобулиновой сывороткой в прямом иммунофлуоресцентном тесте.
Выделение субпопуляции лимфоцитов, обогащенной В-клетками осуществляли на поверхности пластика, но в этом случае его нагружали кроличьими поликлональными антителами к Thy-антигену крупного рогатого скота.
Для приготовления анти-Тпу-сыворотки кроликов иммунизировали экстрактом тимуса теленка (из расчета 40-50 мг белка на одну иммунизацию) первый и пятый раз подкожно с адъювантом Фрейнда (в соотношении 1:1), второй, третий и четвертый раз - внутримышечно одним экстрактом без адъюванта и пятый раз внутривенно клетками тимуса (из расчета 1х108 моноцитов на одно введение). После последней иммунизации на седьмые сутки брали кровь, получали сыворотку, инактивировали 45 мин. при +56С, адсорбировали при +37С в течение 30 мин. равными объемами - дважды эритроцитами крупного рогатого скота, однократно нормальной аллогенной лиофилизированной сывороткой крови и однократно 30 мин. при +37С и в течение ночи при +4С клетками костного мозга теленка из расчета одна часть клеток костного мозга и две части полученной сыворотки. Из полученной анти-Тпу-сыворотки выделяли глобулиновую фракцию сернокислым аммонием, преципитат растворяли в забуференном физиологическом растворе хлористого натрия с рН 7,2.
Полученная антисыворотка отвечала требованиям, предъявляемым к анти-Тпу-сывороткам, так как она реагировала более чем с 95% тимоцитов, менее чем 5% клеток костного мозга и с 71,4+3,7% лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота.
Прямое бактерицидное действие Т-клеток крупного рогатого скота по отношению к штаммам синегнойной палочки
Многочисленными исследователями было показано, что Т-лимфоциты крупного рогатого скота (как и других видов млекопитающих) осуществляют ведущую роль как в регуляции клеточного и гуморального иммунитета, так и в эффекторной функции иммунной системы - элиминации клеток, инфицированных внутриклеточными патогенами. В то же время у мышей была обнаружена неклассическая функция этих клеток, проявляющаяся в прямом бактерицидном действии их по отношению к штаммам условнопатогенной микрофлоры (122). В связи с этим на первом этапе исследований изучали возможность наличия аналогичной функции у Т-клеток крупного рогатого скота.
В данном эксперименте использовали Т-лимфоциты, выделенные от клинически здоровых коров (сухостойный период). Так как монокины, синтезируемые макрофагами, способны в значительной степени усиливать как регуляторную, так и эффекторную функции Т-клеток, то в этом опыте также изучали возможность участия макрофагов в становлении прямой бактерицидной активности Т-лимфоцитов по отношению к одному из типичных представителей условнопатогенной микрофлоры - синегнойной палочке. В эксперименте в качестве клеток "мишеней" использовали живой штамм Ps, aeroginosa 1418. Результаты этих исследований представлены в табл. 1.
Как видно из данных, представленных в табл. 1, Т-лимфоциты крупного рогатого скота обладают незначительной бактерицидной активностью по отношению к синегнойной палочке. В то же время наметилась тенденция возрастания этой активности в присутствии макрофагов. Незначительное бактерицидное действие Т-лимфоцитов коров по отношению к синегнойной палочке, установленное в данном эксперименте, в отличие от выявленной ранее аналогичной функции у Т-клеток мышей Markham R. В. et al. (122), по-видимому, обусловлена тем, что авторы в своих опытах использовали Т-лимфоциты, выделенные от животных в период становления вторичного иммунного ответа к Ps. aeruginosa, то есть на стадии, близкой к максимальной сенсибилизации Т-клеток к антигенам микроорганизма. Таким образом, вполне вероятно, что в нашем эксперименте инкубации Т-лимфоцитов со штаммом синегнойной палочки недостаточно для интенсивной стимуляции прямой бактерицидной активности этих клеток. В то же время известно, что синегнойная палочка, как и большинство других условнопатогенных микроорганизмов, неотделима от среды обитания животных (13), то есть взрослые животные, как правило, сенсибилизированы к представителям этой микрофлоры. Исходя из этого, в следующем эксперименте (табл. 2) определяли влияние ресенсибилизации ТИССП-1 Т-лимфоцитов на их прямую антимикробную активность. В качестве клеток мишеней использовали штамм 1418. Как видно из данных, представленных в табл. 2, нрТ-клетки (как и в предыдущем эксперименте) практически не проявили антибактериальную активность к синегнойной палочке. В то же время они имели сенсибилизацию к этому микроорганизму, так как ресенсиблизация Т-лимфоцитов ТИССП-1 индуцировала проявление этой активности, которая увеличилась по сравнению с контролем на статистически достоверную величину. Присутствие в культуре клеток макрофагов повысила бактерицидную функцию рТ-клеток на еще большую величину. Таким образом, результаты этого эксперимента показали, что Т-лимфоциты крупного рогатого скота обладают прямой бактерицидной активностью к штаммам синегнойной палочки. Эта активность значительно увеличивается в присутствии макрофагов. В связи с тем, что в среде для культивирования макрофагов и ресенсибилизации Т-клеток мы использовали гентамицин-сульфат, в следующем эксперименте (табл. 3) изучали возможность влияния остаточных количеств этого антибиотика на рост гентамицинрезистентного и гентамицинчувствительного штаммов синегнойной палочки в присутствии рТ-клеток и макрофагов. присутствии макрофагов снизили выживаемость как гентамицинчувствительного, так и гентамицинрезистентного штаммов Ps. aeruginosa. В то же время не было установлено какого-либо возможного влияния остаточных количеств культурального гентамицин-сульфата на выживаемость штаммов Ps. aeruginosa. Известно, что макрофаги индуцируют Т-клеточный иммунитет (в том числе и противоинфекционный) как посредством прямого контакта с Т-клетками предшественниками ЦТЛ (презентация антигена), так и посредством синтеза монокинов, главным образом ИЛ-1. В связи с этим в следующем эксперименте изучали функцию макрофагов в индукции антибактериального действия Т-лимфоцитов. Результаты этого эксперимента представлены в табл. 4. Как видно из данных, представленных в табл.4, антибактериальное действие Т-лимфицитов в присутствии, как макрофагов, так и монокинов, было практически одинаково. Аналогичная активность Т-клеток была установлена и в присутствии ИЛ-1 в дозе 5 ED. Разница между 1, 2 и 4 группами была статистически недостоверна. Таким образом, усиление антимикробной активности Т-клеток обусловлено не прямым межклеточным взаимодействием, а синтезом макрофагами ИЛ-1. В следующем эксперименте изучали бактерицидную активность рТ-лимфоцитов в зависимости от их количества в культуре клеток. Результаты этих исследований представлены в табл. 5. Таким образом, из результатов, представленных в табл. 5, видно, что бактерицидная активность Т-лимфоцитов зависит от их количества в культуральной среде. Результаты вышеприведенных экспериментов показали, что Т-клетки крупного рогатого скота обладают прямой бактерицидной активностью по отношению к синегнойной палочке. Вместе с тем известно, что в использованном нами выделении мононуклеарных клеток на градиенте плотности фикол-верографина от 16 до 20% получаемых клеток составляют В-лимфоциты. В-клетки осуществляют ведущую роль в гуморальном звене противоинфекционного иммунитета посредством синтеза ими комплемент- и некомплементфиксирующих антител. Следовательно, вполне вероятно, что в наших экспериментах антимикробное действие Т-лимфоцитов может быть частично обусловлено синтезом антител к антигенам Ps.aeruginosa.
