Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Этапы индивидуального развития насекомых и их регуляция 12-16
1.2. Развитие нервной системы насекомых в эмбриогенезе и личиночном онтогенезе 16-20
1.3. Анатомия и особенности архитектоники брюшной нервной цепочки насекомых 21-23
1.3.1. Моторный нейропиль 24-28
1.3.2. Основной нейропиль 28
1.3.3. Чувствительный нейропиль 28-29
1.3.4. Область дорсальных и вентральных коннективных волокон 30
1.4. Локомоторные органы насекомых и их рецепторное обеспечение 31-33
1.5. Ультраструктурная организация центральной нервной системы насекомых 34
1.6. Нейрональные механизмы, обеспечивающие двигательные реакции насекомых 35-37
Глава 2. Объект и методы исследования
2.1. Препаровка и методики окрашивания препаратов 37-42
2.2. Изучение наружных проприоцепторов 43
2.3. Морфометрические измерения 43-44
2.4. Электронномикроскопическое изучение метаторакального ганглия личинки саранчи 44-45
2.5. Физиологические опыты по изучению функциональной зрелости нейрональных систем, обеспечивающих различные типы локомоций 45-47
Глава 3. Результаты исследований
3.1. Световая микроскопия
3.1.1. Центральная нервная система личинок саранчи 48
3.1.1.1. Анатомия брюшной нервной цепочки личинок 48-54
3.1.1.2. Эффекторные элементы ганглиев личинок разных возрастов 55-68
3.1.1.3. Длинные восходящие пути в брюшной нервной цепочке личинки 1 возраста 68-70
3.1.1.4. Нисходящие проводящие волокна в метаторакальном ганглии личинки 1 возраста 70-72
3.1.2. Наружные проприоцепторы локомоторных органов личинок младших возрастов 73
3.1.2.1. Чувствительная иннервация и наружные проприоцепторы крыловых зачатков 73-77
3.1.2.2. Наружные проприоцепторы конечностей 78-81
Заключение по данным световой микроскопии 82-83
3.2. Поведенческие опыты по изучению функциональной зрелости нейрональных систем, обеспечивающих различные типы локомоций 84-86
Заключение по данным поведенческих опытов 86-87
3.3. Электронная микроскопия Ультраструктурная организация метаторакального ганглия личинки саранчи через сутки после вылупления
3.3.1. Мотонейроны продольной крыловой мышцы 88-93
3.3.2. Проводящие пути вентральной зоны основного нейропиля.. 93-95
3.3.3. Основной нейропиль 95-99
Заключение по данным электронной микроскопии 100
Глава 4. Обсуждение результатов 101-119
Выводы 120-121
Список литературы 122-140
- Развитие нервной системы насекомых в эмбриогенезе и личиночном онтогенезе
- Препаровка и методики окрашивания препаратов
- Эффекторные элементы ганглиев личинок разных возрастов
- Мотонейроны продольной крыловой мышцы
Введение к работе
Насекомые достигли наивысшего уровня эволюционного развития среди беспозвоночных. Появившись на Земле более 300 млн. лет назад, насекомые прошли сложный путь эволюционных изменений. Образование крыльев и возникновение у большинства представителей этого класса способности к полету - основные факторы, которые дали этим животным возможность расширить среду обитания, завоевав обширные экологические ниши. Распространение насекомых в широком диапазоне климатических условий привело к величайшему разнообразию их морфологических форм, форм их поведения и, в частности, двигательного поведения.
Полет насекомых является одной из форм двигательного поведения, выделяющей их среди других беспозвоночных. Полет отличается большой сложностью организации нейрональных систем его запуска, поддержания и контроля, которые в течение многих лет являются предметом нейрофизиологических и морфологических исследований (Weis-Fogh, 1956; Воскресенская, 1959; Wilson, 1961,1965; Свидерский, 1969, 1980, 1997; Kutsh, Usherwood, 1970; Burrows, 1975, 1978;Fourtner, 1976; Robertson, Pearson, 1985; Kutsch, 1989 и др.). Главное внимание исследователей морфологии центральной нервной системы членистоногих и, в особенности насекомых, уделялось туловищному мозгу (Заварзин, 1924,1941; Цвиленева, 1951, 1979; Плотникова, 1969, 1979 и др.), где находятся генераторы двигательных ритмов (Wilson, 1961; Свидерский, 1969 и др.).
В настоящее время установлено, что основные принципы моторного контроля локомоцией у позвоночных и беспозвоночных животных едины (Свидерский, 1969, 1979, 1997; Pearson, Duysens, 1976; Baev, 1991; Pearson, 1993). В этой связи отметим, что сравнительно небольшое число нейрональных элементов, обеспечивающих сложные двигательные реакции насекомых, позволяет использовать этих животных в качестве удобных модельных объектов при решении вопросов общей нейрофизиологии, теории управления, кибернетических построений и математического моделирования работы нейрональных систем с фиксированным количеством анализируемых элементов (Bullock, Horridge, 1965; Меншуткин, Свидерский, Умнов, 1968; Delcomyn, 1985 и др.).
В последние годы, во многом благодаря новейшим методам молекулярной биологии и генной инженерии, было обнаружено, что беспозвоночные и позвоночные животные используют сходные гены во время развития эмбриональных и дефинитивных органов. Этот факт, в свою очередь, предполагает сходство в процессе детерминации различных типов клеток (Coffman et al., 1991; Ellisen et al., 1991). В этой связи необходимо отметить, что А.А.Заварзиным еще в 20-е годы прошлого столетия на основании обширного экспериментального материала и использования сравнительного метода была сформулирована теория параллелизма тканевых структур в эволюции (Заварзин,1925). А.А.Заварзин показал, что организация нервной системы высших беспозвоночных (насекомых) и высших позвоночных (млекопитающие) имеет ряд сходных черт, обосновав распространение в живой природе параллелизмов как закономерного явления, отражающего наличие общих внутренних закономерностей преобразования живой материи в ходе эволюции.
Возрождается интерес специалистов в области морфологии и физиологии беспозвоночных к проблемам развития структуры и функции в онтогенезе. На пути разрешения этих проблем изучение особенностей индивидуального развития, и, в частности, становления и закономерностей формирования нервных и мышечных элементов насекомых в связи с развитием локомоторной активности и «добавлением» новых форм двигательного поведения, несвойственных особям ранних стадий развития, может
6 представлять особый интерес для современных морфологов и физиологов как беспозвоночных, так и позвоночных животных. Необходимо отметить, что основоположник эволюционной физиологии Л.А.Орбели (Орбели, 1938) подчеркивал, что подобные исследования имеют особое значение для эволюционной теории, т.к. обычно предшествующие филогенетические стадии не исчезают бесследно, а могут " прятаться" за более поздними, подчиняясь им, но могут проявиться при определенных условиях, например, в раннем онтогенезе.
Известно, что двигательная активность, как разновидность поведения, незрелорождающихся животных существенным образом отличается от таковой у зрелорождающихся животных (Волохов, 1961; Hamburger, 1963).
Многие незрелорождающиеся животные в первые дни или месяцы жизни не способны к стабильной установке тела в пространстве и выполнению простейших локомоторных актов. Так, при внешнем сходстве строения имаго и личинки насекомых с неполным превращением у личиночных особей отсутствует такая двигательная форма активности как полет. Таким образом, метаморфоз насекомых может служить удобной моделью для изучения механизмов развития и реорганизации нервных сетей, обеспечивающих специфические поведенческие акты - ходьбу, прыжок, полет.
Актуальность проблемы. Исследование центральной и периферической нервной системы насекомых, являющихся высшими представителями филогенетической ветви первичноротых, представляет большой интерес для эволюционной физиологии и сравнительной морфологии.Изучение структур, обеспечивающих выполнение различных форм двигательной активности (ходьба, прыжок и полет) и само формирование этой активности в процессе онтогенетического развития насекомых позволяют выяснить общие закономерности дифференцировки и особенности функционирования . нервной и мышечной тканей у беспозвоночных и позвоночных животных.
Результаты современных физиологических исследований, связанных с изучением двигательного поведения насекомых, требуют новых сведений о структуре и взаимоотношениях нервных элементов, управляющих этими движениями.
Несмотря на значительное количество работ, посвященных структуре и функции нервной системы взрослых насекомых, пути ее формирования в онтогенезе во многом остаются неясными.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение '* структурно-функциональных особенностей организации ЦНС на нейрональном и поведенческом уровнях и путей ее реорганизации в ходе постэмбрионального развития личинки, а также строения и формирования наружных рецепторных структур, связанных с контролем двигательного поведения насекомого. Задачами исследования являлось:
Проследить общее развитие брюшной нервной цепочки у личинок саранчи 1-5 возрастов.
Исследовать особенности дифференцировки мотонейронов, иннерви-рующих функционально различные мышцы у личинок ранних возрастов (монофункциональную (мышца 112) и бифункциональную терго-коксальную (мышца 120), т.е. мышц, обеспечивающих у взрослой саранчи опускание и подъем крыла во время полета.*
Охарактеризовать состояние нейросекреторных нейронов и нейронов непарного нерва у личинок разных возрастов. *) мышца 120 (нумерация по: Snodgrass, 1935) участвует также в контроле щ ходьбы
Провести анализ структурно-функционального состояния проводящих нервных путей, обеспечивающих различные типы локомоции личинок.
Проследить развитие рецепторных структур конечностей и зачатков крыльев и выявить возможные связи в степени развития этих структур с характером локомоции личинок саранчи.
Охарактеризовать особенности ультраструктурного строения мотонейронов крыловой мускулатуры и состояние основного нейропиля метаторакального ганглия личинки, с которым связывают генерацию ритма полета насекомого.
Научная новизна. Выявлены особенности становления и развития брюшной нервной цепочки в процессе личиночного онтогенеза саранчи. Показано, что, если на 1-2-ой стадиях личиночного развития ганглии туловищного отдела увеличиваются в размерах относительно равномерно, то на 3-ей стадии происходит значительное увеличение размеров грудных (про-, мезо-, метаторакального) ганглиев, контролирующих локомоторные реакции у личинок и имаго саранчи. Период резкого увеличения площади грудных ганглиев у личинки саранчи совпадает с началом обширных перестроек крыловых зачатков. Поскольку развитая ходьба присуща не только взрослым насекомым, но и личинкам всех возрастов, кажется вероятным, что резкое увеличение размеров грудных ганглиев связано прежде всего с созреванием и развитием нейронов и их связей, обеспечивающих в будущем полет насекомого. Подтверждением этому предположению является и обнаруженная нами различная степень дифференцировки эффекторных нейронов туловищного мозга личинок. Вместе с тем показано, что при сходстве общего плана строения личиночных и имагинальных мотонейронов, иннервирующих продольную спинную мышцу 112 (которая, как мы уже упоминали, является депрессором крыла у взрослого насекомого), у личинок 1 возраста (когда имеется только зачаток крыла) в этих нейронах выявляются признаки незрелости. Имеющиеся различия касаются формы тела клетки, ядерно-цитоплазменных отношений, количества дендритических ветвлений. Сходные отношения наблюдаются и в мотонейронах бифункциональной мышцы 120 (функции ходьба и полет). Установлено, что, в отличие от мотонейронов, нейросекреторные клетки грудного и брюшного отделов нервной цепочки, также относящиеся к эффекторным элементам ЦНС, созревают уже на 1 стадии развития и отличаются от нейросекреторных элементов имаго саранчи только размерами.
Исследования, проведенные на ультраструктурном уровне, показали, что в мотонейронах продольных спинных мышц выявляются признаки их незрелости, что отражается в размерах тел клеток, ядерно-цитоплазменных отношениях, значительном количестве свободных рибосом, слабом развитии ш-ЭПС и отсутствии большого числа вакуолей, свойственных клеткам имаго. Характерным является и наличие значительного межклеточного пространства, окружающего тела таких нейронов. Показано, что основной нейропиль метаторакального ганглия личинки саранчи через сутки после ее вылупления из яйца морфологически уже сложно организован, часть синаптических терминалей содержит сложный гетероморфный набор везикул.
Изучение наружных проприоцепторов развивающихся локомоторных органов и иннервации крылового зачатка личинок саранчи младших возрастов показало наличие у них всех типов клеток (I и II типа по-Заварзину), присущих взрослому насекомому. Различия в организации наружных проприоцепторов локомоторных органов у личинок и взрослого насекомого касаются количественного состава и местоположения этих элементов, что может быть связано с различной степенью развития локомоторного аппарата, и, как следствие - локомоторного поведения.
Результаты исследования вносят существенные дополнения в представленияо прохождении личиночного этапа развития нервной системы насекомых. Полученные данные имеют принципиальное значение для понимания путей структурной и функциональной дифференцировки тканей беспозвоночных животных.
Теоретическое и практическое значение. Полученные данные в сопоставлении с литературными источниками позволяют приблизиться к решению вопроса о путях формирования центральных и периферических элементов, обеспечивающих локомоторное поведение, выявить характерные черты организации этих структур у личиночных особей саранчи. Обобщение нейроморфологических данных и результатов поведенческих опытов открывает новые возможности для раскрытия механизмов эволюции ЦНС на одном из важнейших этапов развития беспозвоночных - у насекомых. Настоящая работа имеет прикладное значение. Объектом исследования являлась саранча - опасный вредитель сельскохозяйственных посевов и урожаев, способствующий распространению болезней человека, животных и растений. Эффективная и целенаправленная борьба с этим насекомым, поиск новых инсектицидов направленного действия, невозможен без должного понимания структуры и функционирования локомоторных центров нервной системы этого животного, в частности, без знания особенностей развития и формирования нервной системы в личиночном онтогенезе. Результаты, полученные в ходе работы, позволяют считать, что личинки саранчи могут использоваться в качестве удобной методической модели для исследования закономерностей развития структуры и формирования локомоторных функций у беспозвоночных.
Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских программ ИЭФиБ им. Сеченова РАН. Тематика исследования является составной частью комплексного плана научно-исследовательских работ Научного Совета по проблеме «Закономерности индивидуального развития животных и управление процессами онтогенеза» Отделения общей биологии РАН, «Механизмы, обеспечивающие поведение беспозвоночных в процессе онтогенеза (программа «Интеграция»)», «Исследование нейрональных
11 механизмов локомоторного поведения беспозвоночных», «Изучение организации нейрональных сетей в туловищном мозге насекомых и их взаимоотношения с надсегментарными структурами при реализации двигательного поведения».
Материалы диссертации включены в курс лекций студентам кафедры общей физиологии и кафедры цитологии и гистологии Санкт-Петербургского государственного Университета.
Апробация работы. Результаты исследования были доложены на заседании Ученого Совета ИЭФиБ РАН 24 декабря 1992 года, на Конференции молодых ученых и специалистов «Механизмы регуляции физиологических функций», С.-Петербург, 1992г.,на 1 (IX) Международном Совещании по эволюционной физиологии, С.-Петербург, 22-26 апреля 1996г., на III Международной конференции стран СНГ («Колосовские чтения») 7-8 апреля 1997г., в докладах XI Всероссийского энтомологического съезда, 24-26 сент. 1997г. на Секции сенсорной физиологии и на Секции ортоптероидных того же Съезда. В сентябре 1998г. материалы исследования вошли в доклад «Становление и развитие нейрональных систем у беспозвоночных» на XVII Всероссийском съезде физиологов России в Ростове-на Дону, в ноябре 2001г.- в материалы XII Международного Совещания и V Школы по эволюционной физиологии. В июле 2002г. данные исследования докладывались на IV Международной конференции стран СНГ ("Колосовские чтения-2002").
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 12 работ, из них: 4 статьи и 8 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах, она состоит из введения и обзора литературы, описания методик, изложения результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего Z02 источников (из них 123 иностранных). Работа иллюстрирована 29 рисунками и фотографиями и содержит 2 таблицы.
Развитие нервной системы насекомых в эмбриогенезе и личиночном онтогенезе
Нейробласты и их изменения в эмбриональный период Известно, что клетки, дающие начало нервной системе насекомых, - это нейробласты (Roonwall, 1937). Благодаря большому размеру, повторяющимся циклам митозов и сегментарному происхождению эти клетки стали объектом пристального внимания ученых разных областей биологии: для изучения митотических процессов, в качестве источника нейронов для изучения роста в тканевой культуре и происхождения и судьбы нейробластов (Панов, 1962, 1966; Seecof et al., 1973; Bate, 1976; Condron, Zinn, 1994).
Нейробласты дифференцируются среди клеток эпидермиса. В работе Бате (Bate, 1976) на саранче был продемонстрирован ход развития нейробластов на ранних этапах эмбрионального развития, причем на всем протяжении брюшной цепочки - от проторакса до последнего абдоми нального сегмента. Процесс дифференцировки нейробластов идет в ростро-каудальном направлении. Нейробласты делятся, таким образом увеличивается количество дочерних клеток вплоть до ПО часа развития, когда появляются первые признаки смерти клеток - хроматиновые капли (Wigglesworth, 1942), что предполагает наличие избирательной волны дегенерации нейробластов, которая, также как и деление, проходит в ростро-каудальном направлении. Процесс этот оказывается более выраженным в абдоминальных сегментах и почти не отражается на торакальных. К 155 часу развития яйца нейробласты в абдоминальных ганглиях не наблюдаются. Отметим, что в это время происходит начальное слияние 1 абдоминального ганглия с метаторакальным. Этот процесс продолжается на протяжении всего эмбриогенеза и, как показывают наши собственные наблюдения, на первых стадиях личиночного развития. Слияния ганглиев имеет место и в брюшном отделе. Так образуется сложный (последний) ганглий абдомена. Нейробласты здесь исчезают, по данным Бате (Bate, 1976), только к 210 часу эмбрионального развития. Наиболее интересным фактом при изучении развития нейробластов саранчи оказалось то, что для образования абдоминальных (простых) и относительно больших и сложных грудных ганглиев (метаторакальный слит из четырех нейромеров) требуется одинаковое число нейробластов. Сложность торакальных ганглиев по сравнению с абдоминальными, таким образом, может быть связана с замедленной дегенерацией части нейробластов в тораксе. Однако этот факт не является общепризнанным, поскольку у большой части других насекомых подобного процесса не отмечалось (Truman, 1990).
К сожалению, эти работы не дали возможности для объяснений дальнейшей картины распределения моторных нейронов в ганглии взрослой саранчи. Однако есть указания на наличие функционального группирования между быстрыми (fast) и медленными (slow) нейронами одних и тех же мышц и синергичных нейронов, которые лежат близко в ганглиях таракана (Young, 1973), и саранчи (Burrows, Hoyle, 1973). Так, Берроуз и Хойл показали, что тормозные и возбуждающие мотонейроны располагаются в ганглии отдельно: тормозные - у средней линии, возбуждающие - латерально и кзади. Предполагается, что некоторые нейробласты могут давать не один мотонейрон, а больше (Burrows, Hoyle, 1973; Bate, 1976). Современные исследования показывают, что медиальный нейробласт является мульти-потентной клеткой, способной в различные временные периоды продуцировать как нервные, так и глиальные элементы (Condron, Zinn, 1994).
К настоящему времени при изучении нейрогенеза некоторых насекомых возникло представление о так называемых «пионерных» (первичных) нейронах (Goodman, Spitzer, 1979; Bentley, Keshishian, 1982 и др.).В ЦНС кузнечика отмечались клетки, так называемые midline precursors, которые маркируют путь будущим продольным трактам в ЦНС насекомого (Goodman et al., 1984), а затем гибнут.
Подобные явления описаны не только для центральных, но и для периферических нейронов. Так, согласно представлению о первичных «нейронах-волокнах», периферические нейроны дают отросток, конус роста которого движется в определенном направлении за счет селективного контакта с последовательно расположенными столбовыми клетками (guidepost cells). Происходит так называемое контактное ориентирование. Другие отростки нервного пучка, развиваются позже, используя пионерный нейрит в качестве предпочтительного адгезивного субстрата. Кутч и Бентли (Kutsch, Bentley, 1987) считают, что такие первичные нейроны, в частности выявленные ими нейроны Ті 1, наблюдаемые на ранних стадиях эмбриогенеза в дистальном отделе голени метаторакальной конечности саранчи, являются первыми нейронами в зачатке конечности, которые дают аксоны в ЦНС. Эти первичные аксоны прокладывают путь основным нервным стволам в ноге насекомого.Сходные процессы, имеют место и в зачатке крыла (Palka et al., 1984). Предполагается, что наличие таких нейронов может быть важным для нормального развития периферической нервной системы. Показано, что лазерное облучение таких первичных нейронов на концах церков у сверчка, вызывает формирование ненормальных, множественных, нервных стволов, вероятно, в результате нарушения необходимой ориентации сенсорных нейронов церков (Edwards et al., 1981). В дальнейшем, первичные нейроны, выполнив свою морфогенетическую функцию, запрограммировано гибнут (Kutsch, Bentley, 1987; Lee et al., 1989). Судьба первичных нервных клеток на личиночном этапе развития
Выше указывалось, что явление запрограммированной гибели нейронов присуще эмбриональной стадии развития нервной системы насекомых. Однако, как показали исследования Трумэна (Truman, 1990), подобное явление может иметь место и в личиночный этап онтогенеза и на ранних стадиях имагинального развития. Так, у дрозофилы первая волна гибели нейронов наблюдается вскоре после образования пупария. Причем, нередко гибнет до 40% клеток (Truman, 1990). Первоначально считалось, что нейроны теряют большинство своих отростков (Но, Goodman, 1982; Weeks et al, 1989). Вторая волна гибели нейронов следует в период окрыления насекомого (Truman, 1990).
К настоящему времени показано, что явление запрограммированной гибели нейронов отражает общую тенденцию нейрогенеза беспозвоночных животных (Oppenheim, 1985).
Дальнейшая дифференцировка центральных нейронов изучена довольно мало (Tsujimura, 1988). Имеющиеся литературные данные (Goodman, Spitzer, 1979; Condron, Zinn, 1994) касаются так называемых DUM-нейронов. Показано, что они становятся чувствительными к ацетилхолину и к у-аминомаслянной кислоте на 8-ой день развития яйца, когда эти нейроны только начинают образовывать аксонные отростки. Таким образом, эти элементы ЦНС приобретают хемочувствительность еще в эмбриональном периоде, до того, как их аксоны успевают достичь мышц-мишеней.
Изучены также популяции спайковых локальных интернейронов из группы, расположенной по средней линии торакальных ганглиев (Shepherd, Laurent, 1992). В этой работе дано подробное описание происхождения нейронов, приводятся детали роста отростков, которые затем формируют главные ветви, изучены процессы утери части ветвей, что ведет к развитию определенного типа нейронов. Интересно, что на начальных этапах развития таких интернейронов их клеточные отростки покрыты филоподиями по всему протяжению, на поздних этапах эмбриогенеза таких выростов не наблюдается.
К сожалению, формированию эффекторных элементов ЦНС насекомых в постэмбриональный период развития насекомого в исследованиях последних десятилетий уделяется мало внимания. Так, известная нам работа Брайдбаха и Кутча (Breidbach, Kutsch, 1990) посвящена рассмотрению строения мотонейронов дорсальной продольной спинной мышцы саранчи Schistocerca gregaria F. лишь у личинки последнего возраста и содержит общие сведения о сходстве в плане строения этих нейронов у личинки и имаго (так называемый «имагинальный гештальт»). Применяемая авторами методика окраски мотонейронов хлоридом кобальта, не позволяет судить о ядерно-цитоплазменных отношениях в личиночных нейронах.
Препаровка и методики окрашивания препаратов
Разнообразие и сложность двигательного поведения насекомых (ходьба, лазание, прыжок, полет) достигается благодаря совершенству межнейро-нальных связей в ЦНС этих животных, у которых насчитывают относительно небольшое количество центральных нейронов, включенных в различные нейрональные системы.Так, показано, что для запуска и поддержания полета насекомого необходимо наличие пяти систем: рецепторной, командной, генераторной, моторной и системы периферического контроля локомоцией. К первой относят ветрочувствительные рецепторы фронтальных областей головы, подробно изученные в лаборатории нейрофизиологии беспозвоночных ИЭФБ (Свидерский, 19696; Князева, 1970, 1988), тарзальные рецепторы конечностей и церков (Fraenkel, 1932; Roeder, 1948); ко второй -командной - систему нисходящих, либо восходящих, проводящих волокон нейропиля (Cook, 1951; Roeder, 1948, 1953; Shen, 1983). Систему генерации ритма полета саранчи, расположенного в грудных ганглиях, составляет сеть интернейронов (Свидерский, 1965, 1969а; Robertson, Pearson, 1985 и др.). Активация генератора ритма полета осуществляется через систему нисходящих (командных) интернейронов, которые активируются ветрочувстви-тельными рецепторами головы. К моторной системе относят, в данном случае, мотонейроны, иннервирующие мышцы непрямого действия (продольные спинные и дорсовентральные мышцы груди (Snodgrass, 1935; Шванвич, 1949: Wilson, Weis-Fogh, 1962). Мышцы непрямого действия непосредственно не соединены с крыловой пластинкой. Удар крыла вниз обеспечивается, главным образом, спинными продольными мышцами (мышцы 81 и 112), являющимися депрессорами. Опускание крыловой пластинки осуществляется путем движения ее основания вверх. Взмах же крыльев обеспечивают дорсовентральные мышцы (мышцы 83 и 113). При сокращении этой мускулатуры происходит уменьшение расстояния между тергитами и стернитами птероторакса, основание крыла смещается вниз, крыловая пластинка же движется вверх.. Кроме указанных мышц в обеспечение работы крылового аппарата включены и бифункциональные мышцы, влияющие на эластичность груди (в частности, мышцы 85, 98, 114,120 и др.). К последней системе принято относить рецепторы крыльев и конечностей, которые лишь частично могут модифицировать центральные программы за счет периферических обратных связей (Gettrup, 1965; Finlayson, 1975; Горелкин, 1975 и др.).
Вопросы формирования системы полета у насекомых еще далеки от решения. Имеются лишь фрагментарные данные, подтверждающие, что крыловые зачатки саранчуков способны к легким вибрациям (Bentley, Hoyle, 1970). На миограммах крыловых мышц саранчуков можно выявить компоненты близкие к паттерну полетной активности, наблюдаемому у взрослых животных, однако, такая активность носит скорее тонический, чем фазный (как у взрослого) характер (Kutsch, Stevenson, 1984). Некоторую ясность вносят работы Кутча (Kutsch, 1988, 1989). В них исследуются паттерны крыловых мышц ювенильных и имагинальных животных. Оказалось, что с увеличением массы тела насекомого идет и увеличение скорости полета (Fischer, Kutsch, 2000). Более того, на протяжении созревания происходят изменения в параметре угол наклона тела насекомого, что связано с аэродинамическим выходом от крыльев. Значение угла наклона тела уменьшается во время "взросления" насекомого и это может играть важную роль в дирекциональном контроле результирующего вектора силы полета.
На основании изложенных литературных данных, можно заключить, что к настоящему времени накоплен значительный объем информации о строении нервной системы насекомых и механизмах ее функционирования при обеспечении двигательного поведения у взрослых особей. Изучен ход индивидуального развития насекомых и эндокринный контроль этого процесса. В то же время, остаются неясными вопросы развития и становления эффекторных элементов ЦНС, мышечного аппарата, формирования рецепторного обеспечения насекомых в постэмбриональном периоде развития. С учетом этого, в настоящей работе и были поставлены задачи проследить изменения, происходящие в нервной системе саранчи в ходе личиночного развития и, по возможности, сопоставить полученные морфологические результаты и данные поведенческих опытов о формировании локомоторных реакций, в особенности нового для личинок насекомого двигательного поведения - полета.
Эффекторные элементы ганглиев личинок разных возрастов
Существенным звеном в изучении становления локомоторных реакций насекомых является оценка эффекторных элементов ЦНС (мотонейронов, нейросекреторных клеток, нейронов непарного нерва).
На продольных срезах метаторакального ганглия личинки саранчи 1 возраста (1-2 часа после вылупления из яйца),окрашенных гематоксилином, можно проследить расположение тел нейронов и нейробластов (рис.10). На препаратах различаются тела нервных клеток, расположенные в латеральной области ганглия на вентральной его стороне. При изучении срезов показано,что на дорсальной стороне ганглия имеются лишь единичные клетки, расположенные по средней линии ганглия. Латеральные скопления нервных клеток в ганглии отделены от нейропиля небольшим слоем глиальных клеток (рис.10). В части клеток наблюдаются митозы. Размеры нервных клеток у личинки 1 возраста колеблются в пределах 10-23 мкм.
Уже на 2 часу после вылупления личинки из яйца нервные клетки находятся на разных стадиях дифференцировки. Так, в грудных ганглиях мы наблюдали клетки размером 10x10 мкм, и более крупные (15x15 мкм) клетки. Ядерно-цитоплазменные отношения последних были сходны с таковыми у имаго. Сходные отношения выявляются в метаторакальном ганглии и у парных клеток, расположенных на границе I и II нейромеров этого же ганглия. Такие клетки мы наблюдали и во всех простых брюшных ганглиях (рис. 11). Эти клетки обнаруживают поразительное однообразие как в строении, так и в топографии терминальных арборизаций. На рисунке с правой стороны (внизу) изображены две такие клетки, ядра которых имеют ядерно-цитоплазменные отношения близкие к таковым у имаго. По ряду анатомических признаков (локализации тел, характеру хода отростков, терминальным ветвлениям) мы можем идентифицировать их как нейросекреторные клетки типа В (Панов, 1962; Rabbe, 1966; Chalaye, 1967).
Такие нейроны окрасились в грудных и брюшных ганглиях личинок всех стадий развития. Приведем описание таких клеток, расположенных во 2 абдоминальном ганглии. У личинок 1 возраста это клетки чуть вытянутой (овальной) формы, размерами 14x12 мкм с крупным ядром и небольшим количеством цитоплазмы в клетке (рис.12; А). К клеточному телу при-членяется тонкий отросток, который направлен ростро-медиально, и через некоторое расстояние, в моторной области ганглия, делает крутой изгиб («петлю») и идет на периферию. Он направляется из ганглия со 2-ым нервом и идет по его оболочке, в непосредственной близости от ганглия (в абдоминальных ганглиях) раздваивается и прослеживается до пери-симпатического органа, в котором дает короткие ветвящиеся коллатерали, образующие сеть терминальных волокон на поверхности 1-ой и 2-ой пары нервов (рис.12; А). Эти нейроны у личинок 3-4 возраста отличаются от таковых у имагинальных особей только размерами тел клеток. Ядерно-цитоплазменные отношения в этих нейронах приближаются к имагинальным уже у личинок 3 возраста (рис. 12; В).
Клетки непарного нерва наиболее часто окрашивались в брюшных ганглиях цепочки личинок саранчи. Как правило, это были 4-6 клеток в кау-дальной части ганглия в медиальной заднеконнективной области (рис.11;3). Размеры клеток несколько меньших (10x10 мкм), чем нейросекреторных, располагаются на вентральной стороне ганглия. Клеточный отросток поднимается в ростральном направлении на дорсальную сторону ганглия, главный отростокрасширяется в моторном нейропиле и затем резко переходит в аксон, уходящий в ствол непарного нерва, который вблизи выхода из ганглия делится на левую и правую ветви.Отростки клеток в перисимпатическом органе дают множество коротких ветвящихся коллатералей, оканчивающихся округлыми утолщениями на нейрилемме органа. Приведенное нами описание клеток непарного нерва личинки соответствует данным Плотниковой (1979) для имаго. Отношения ядро-цитоплазма в этих клетках устанавливаются к 3 возрасту.
Для анализа моторных элементов мы выбрали участок в области переднего коннектива метаторакального и 2-го брюшного ганглиев. В этих областях мы обнаружили гомологичные нейроны (их размеры в среднем 10x13 мкм), расположение клеточных тел которых, ход мозговых разветвлений и уходящие в дорсальный корешок 1-ого нерва аксоны позволяют идентифицировать их. Такие нейроны, как известно из нейрогистологических работ (Burrows, 1973; Tyrer, Altman, 1974; Плотникова, 1979), у имаго иннервируют продольную спинную мускулатуру, которая в брюшном отделе осуществляет движения брюшного отдела, а в грудном -является мышцами депрессорами крыльев.
Как видно на тотальных препаратах, эти нейроны имеются уже у личинок 1 возраста, у которых крылья присутствуют лишь в зачаточном состоянии в виде листообразных выростов.Эти симметричные двусторонние мотонейроны в грудных и брюшных ганглиях обнаруживают большое сходство (рис.13; А,В) как в строении, так и в топографии основных арборизаций. Аксоны этих нейронов удалось проследить до продольных спинных мышц личинок.
Мотонейроны продольной крыловой мышцы
Предварительно визуально и с помощью секундомера оценивалась фоновая двигательная активность у личинок 1-5 возрастов в условиях лабораторного содержания. Проводили также видеосъемку при помощи видеокамеры JVCHandycam.
Сразу после вылупления личинки из яйца, когда насекомое оказывается на поверхности почвы, наблюдается длительное (1-2 часа) отсутствие каких-либо движений. Затем отмечали кратковременные "проходы" (на 2-Зсм заметим, что длина тела личинки 1 возраста 0,8-1,2 см.Особенностью отдельного локомоторного акта является довольно низкая скорость перемещения насекомого (менее 1 см/сек), чередование в его составе кратковременных периодов ходьбы вперед с длительными паузами (до 20-30 сек, а иногда до 2-4 минут). Это касается как фоновых, так и вызванных локомоторных актов.При попытке взять насекомое из садка защитная локомоторная реакция проявлялась в прыжке. У личинок 2 возраста, кроме медленной ходьбы (с периодами замирания) наблюдали прыжки в направлении к источнику пищи.
У личинок 3-5 возрастов периода ходьбы (от 5 до 15 см) различной направленности, перемежались с отсутствиями движений. Отмечали прыжки 10-12 см в высоту, 3-7 см в длину, горизонтальное (дорсальной стороной вниз и вверх) и вертикальное лазание по опорам, расположенным в садках.
Методика проведения поведенческих опытов подробно изложена в разделе 2.5 главы 2. "Объект и методы исследования". В первой серии опытов ветровой стимул (скорость 3,5 м/с, длительность 2 сек) наносили на конец брюшка личинок саранчи (рис.7, А), изучая при этом способность выявленных нами восходящих путей активировать так называемую реакцию избегания ("реакцию убегания" у бегающих насекомых, например, таракана -см. Roeder, 1948). В этом случае подвижность нелетающих личинок в ответ на стимул ограничивалась у личинок саранчи 1 возраста прыжком, как правило, чаще вверх (до 6-7 см высотой), чем в длину (3-5 см).Направление этой двигательной реакции часто было хаотическим, т.е. при обдувании насекомое прыгало в любых направлениях, даже навстречу ветровому потоку. Тактика личинок 4-5 возрастов выражалась в медленной ходьбе, как правило, в направлении от источника раздражения прямо, либо в сторону. Иногда, но очень редко, это могли быть и прыжки той же направленности.
Эта поведенческая реакция показала, что выявленные нами гигантские восходящие интерсегментарные нейроны через свои дендриты, уже у личинок 1 возраста получают синаптический вход от афферентных волокон церкаль-ных рецепторов. Информация передается по восходящим аксонам, показанным в нашей работе, в сегментарные центры локомоции, расположенные в грудных ганглиях, где и происходит активация соответствующего генератора. Во второй серии (рис.7, Б) мы попытались выяснить вопрос: в какой мере формирующийся генератор полета (напомним, что крылья у личинки представлены в зачаточном состоянии и неподвижны) может проявляться при так называемом тарзальном рефлексе..Это один из самых стабильно проявляющихся рефлексов крылатых насекомых, вызываемый потерей контакта тарзусов конечностей насекомого с субстратом, вызывает растор-маживание генератора полета у взрослого насекомого, что приводит к активации крыловых мышц и двигательной активности - полету. Если летящему насекомому предоставить возможность для контакта тарзусов конечностей с субстратом (подвести опору), полет будет остановлен. В этой серии опытов отведение опоры из-под конечностей саранчука вызывало отдельные вздрагивания тела, легкое подгибание первой и второй пары конечностей. При этом личинка старалась компенсировать изменение силы тяжести действующей на тело и стремилась приподнять задний конец брюшка вверх. Никаких признаков движения, либо вибрации крыловых зачатков, отмечено не было, они были (как и в покое) сложены на спинке.
Третья серия опытов, помимо условий, обозначенных выше, была дополнена ветровой стимуляцией фронтальных областей головы личинки. Показано (Свидерский, 1969), что рецепторы ветрочувствительных сенсилл головы у личинок саранчи старших возрастов уже могут давать фазно-тонический тип ответа, сходный с таковым у имаго, т.е. являются функционально зрелыми. В этой серии опытов ветровая стимуляция была продолжительной и занимала по времени 10-20 сек, одновременно у насекомого из-под ног убирали опору. На протяжении действия ветрового потока на сенсиллы головы саранчука наблюдали типичную позу полета: - первая пара конечностей приведена к нижней боковой части головы, - вторая пара конечностей бедрами прижата к плейритам, голени и тарзусы отведены назад, - третья пара конечностей слегка расслаблена в коксо-трохантеральном сочленении, бедро и голени слегка согнуты друг относительно друга (угол порядка 95-110), отведены вдоль тела насекомого вниз под углом 30-45 к горизонтальной оси брюшка, тарзусы отведены назад (угол голень-тарзус 160-170). Все время действия ветрового стимула наблюдали небольшие по амплитуде движения всех конечностей. Прекращение ветрового потока снимало эти двигательные реакции.
