Сравнительное исследование периферических мускариновых холинорецепторов Дорофеева Наталья Адольфовна

Содержание к диссертации

Введение

Глава I. Мускавшобые холинорецептош мышц (обзор литера туры) 7

1.1. Введение 7

1.2. Локализация М-ХР 7

1.3. Выделение М-ХР 9

1.4. Физиология М-ХР II

1.5. Биохимия М-ХР 17

1.6. Исследование М-ХР химико-фармакологическим методом и связывание фармакологических веществ с М-ХР 20

1.7. Изучение М-ХР методом химической модификации . 30

1.8. Типы М-ХР, различия между М-ХР разной локализации 35

1.9. Заключение. Основные черты М-ХР 51

Глава 2. Объекты и метод исследования 55

2.1. Объекты исследования 55

2.2. Метод исследования 56

2.3. Характер сокращений гладких мышц морской свинки 61

Глава 3. Активность классических мускаішомиметйческих и мускаринолитмеских веществ на изолированных мыш цах разных органов морской свинки 65

3.1. Введение 65

3.2. Активность классических мускариномиметических веществ на гладких мышцах разных органов морской, свинки 66

3.3. Активность классических мускаринолитических веществ 74 стр.

3.4. Обсуждение 77

3.5. Выводы 81

Глава 4. Исследование способности алкилзамещенных аналогов бшзшшлхолйна и хинуклйдинилбензилата блокировать мускарйновые холинорецепторы мышц разных органов морской свинки 82

Введение 82

4.1. Мускаринолитическая активность алкилзамещенных аналогов бензилилхолина на продольной мышце тонкой кишки морской свинки 84

4.2. Мускаринолитическая активность алкилзамещенных аналогов бензилилхолина на предсердиях морской свинки 88

4.3. Исследование способности аналогов бензилилхолина (МО-1,7,8,9) блокировать М-ХР мышц мочевого пузыря, матки и трахеи морской свинки 89

4.4. Мускаринолитическая активность алкилзамещенных аналогов хинуклидинилбензилата на продольной мышце тонкой кишки и предсердиях морской свинки 92

4.5. Обсуздение 96

4.6. Выводы 102

Глава 5. Способность мйорелаксантов блокировать мускарйновые холинорецепторы сердца и тонкой кишки 104

Введение 104

5.1. Блокада миорелаксантами М-ХР сердца и кишки крысы 107

5.2. Сопоставление фармакологической активности со связыванием миорелаксантов с М-ХР сердца и кишки крысы НО

5.3. Блокада галламином мускариновых холинорецепторов седпда и кишки морской свинки 117

5.4. Обеувдение 117

5.5. Выводы 125

Глава 6. Общее заключение 127

Общие выводы 136

Список литературы 138

• Исследование М-ХР химико-фармакологическим методом и связывание фармакологических веществ с М-ХР
• Активность классических мускариномиметических веществ на гладких мышцах разных органов морской, свинки
• Мускаринолитическая активность алкилзамещенных аналогов бензилилхолина на продольной мышце тонкой кишки морской свинки
• Блокада миорелаксантами М-ХР сердца и кишки крысы

Введение к работе

Актуальность темы. В последние годы появились данные о различиях между мускариновыми холинорецепторами (М-ХР) ( Subtypes of muscarinic receptors, Symposium , 1984). Ha основании результатов биохимических и фармакологических исследований выделены два подтипа М-ХР: Mj, расположенные преимущественно в центральной нервной системе и в вегетативных ганга-лиях, и М₂, локализованные преимущественно в гладких мышцах разных органов и в сердце. С 1976 года появляются работы, указывающие на фармакологические различия между Mg-XP сердца и гладких мышц ( Barlow et al., 1976, 1980; Mutschler, Lam-brecht , 1980, 1984; Zwagemakers , Glaassen , 1980). В литературе нет данных о фармакологических различиях между М-ХР гладких мышц разных органов. Выявление различий в чувствительности М^-ХР мышц разных органов важно для понимания функционирования периферических синапсов, через которые осуществляется регуляция вегетативных функций, и для создания лекарственных веществ, избирательно действующих на М-ХР того или иного органа. Для решения этих задач необходимо знать, какие химические особенности строения активного центра М-ХР определяют фармакологические отличия М-ХР одних тканей от М-ХР других тканей. Установление связи между строением веществ и избирательностью действия важно для целенаправленного синтеза новых лекарственных веществ, действующих на М-ХР определенного органа. Систематического исследования чувствительности разных органов одного вида животного к веществам, взаимодействующим с М-ХР, в одинаковых экспериментальных условиях не проводилось. Сравнивая активность гомологичного ряда веществ, полученную в опытах на разных мышцах, можно сделать предположения об особенностях строения М-ХР этих мышц.

При поиске различий между М-ХР пользуются также биохимическим методом определения связывания меченых веществ с рецепторами разных тканей. Результаты биохимических экспериментов важно сравнивать с результатами, полученными в фармакологических опытах.

Дель и задачи работы. Цель исследования состояла в поиске фармакологических различий между М-ХР разных органов.

В качестве конкретных задач исследования были выбраны следующие:

1. Сравнить в одинаковых экспериментальных условиях действие наиболее известных агонистов и антагонистов М-ХР на изолированные мышцы пяти органов морской свинки: кишки, трахеи, мочевого пузыря, матки и сердца.

2. Исследовать на этих объектах действие производных бен-зилилхолина и хинуклидинилбензилата, имеющих разную длину алкиль-ного радикала при атоме азота.

3. Сравнить действие некоторых миорелаксантов на М-ХР продольной мышцы тонкой кишки и предсердий.

4. Выявить веществ, обладающие избирательным действием на М-ХР того или иного органа.

Научная новизна. Впервые проведено систематическое исследование действия большого набора известных мускариновых агонистов и антагонистов на М-ХР мышц разных органов одного и того же животного - морской свинки - в одинаковых экспериментальных условиях. Исследована мускаринолитическая активность и - алкила-миноэтиловых эфиров бензиловой кислоты и алкилзамещенных аналогов хинуклидинилбензилата в опытах на изолированных предсердиях и на гладких мышцах морской свинки. Среди них найдены два вещества ( и- октиловый аналог бензилилхолина и ж- дециль-ное производное хинуклидинилбензилата), обладающие избирательным

действием на М-ХР гладких мышц. При исследовании способности миорелаксантов блокировать М-ХР сердца и кишки выявлены вещества: а) избирательно блокирующие М-ХР сердца, б) вещества, блокирующие М-ХР сердца и кишки в одинаковых концентрациях, в) вещества, не блокирующие ни М-ХР сердца, ни М-ХР кишки. Мускарино-литическое действие пяти из семи исследованных миорелаксантов исследовано впервые. Сравнение результатов фармакологических и биохимических опытов показало важность фармакологического исследования для правильного представления о функциональном значении участков М-ХР, связывающихся с лигандом.

Практическое значение работы. Выявленные различия в действии ряда веществ на М-ХР мышц разных органов морской свинки могут быть использованы для синтеза лекарственных веществ избирательного действия на М-ХР определенного органа, лишенных побочных эффектов. Два из исследованных веществ могут быть использованы для избирательной блокады М-ХР гладких мышц. Результаты исследования действия миорелаксантов на М-ХР сердца и кишки могут быть полезны анестезиологам для правильного выбора миорелак-санта в клинике.

СОКРІШЩНЙЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В ТЖСТЕ
М-ХР/ - мускариновый холинорецептор

АХ - ацетилхолин

EL или K_d - константа диссоциации

ЕС₅₀ - концентрация вещества, вызывающая 50$

ответ ткани
УШ - метилфурметид

F-2268 - 2-метш-4-триметилашнометил-1,3-диоксо-

лан (Фурно 2268)
McN-A-343 - 4-(ш-хлоркарбамоилокси)-2-бутинилтриме-

тиламмоний гидроксид
AHR-602 - я-бензилттрролидил ацетат метобромид

4 АМР - 4-ацетоксм -метил пиперидин метиодид

4 damp 4-дифвнил-ацетоксшметилшшеридин

нем - и- этилмалеимид

рсмв - р-хлормеркурий бензоат

ДТТ - дитиотреитол

- дитио-бис-нитробензоат
qhb или ХБ - хинуклидинилбензилат

МО - ряд метациновых оснований, н-алкилзаме-

щенные аналоги бензилилхолина
sh, н, ь участки - участки связывания со сверхвысоким, высо
ким и низким сродством, соответственно
цШ? - циклический гуанозинмонофосфат

КХ - карбахолин

Г л а в a I

МУСКАРИНОВЫЕ ХОЛШОРЕЦЕЖОРЫ МЫЩ

(Обзор литературы)

Дейл в своей классической работе "Действие некоторых эфи-ров холина и их отношение к мускарину" впервые установил, что ацетилхолин (АХ) обладает двумя видами действия. Действие АХ, сходное с эффектом раздражения парасимпатических нервов, было названо "мускариновнм", так как оно воспроизводится при введении мускарина. Атропин блокирует действие мускарина и малых доз АХ. В присутствии атропина развивается "никотиновое" действие АХ, которое имитируется малыми дозами никотина и блокируется большими дозами никотина ( Dale , 1914).

1.2. Локализация М-ХР

М-ХР широко представлены в организме. В центральной нервной системе количество М-ХР значительно превышает количество никотиновых холинорецепторов. М-ХР распространены в разных отделах центральной системы ( Shimoyama et al. , 1982): в коре головного мозга (Phillis, York , 1968; Stone , 1972), в хвостатом ядре (Bloom et al. , 1965; Takano et al. , 1981), в гиппокампе ( Palacios , 1982; Bevan , 1984), в промежуточном, в среднем мозге, в коре мозжечка, в области моста и в спинном мозге ( Curtis, Ryall , 1964; Curtis, Ryall , I966;Kayaalp , ffeff , 1980;King, Ryall , 1981; Gillberg et al. , 1984). М-ХР обнаружены в нейронах симпатических ( Constanti et al., 1981; Dodd, Horn , 1983; Cole , Shinnick - Gallgher

1984; Brown , 1984) и парасимпатических ( Hartzell et al., 1977; Morita et al. , 1982; Horth, Tokimasa , 1983; North, Tokimasa , 1984) ганглиев. Пресинаптические M-XP встречаются на многих типах нервных терминален, как на холинергических ( Szerb , 1977; Sastry et al. , 1978; Kloog et al. , 1980; Koketsu ,Yamada , 1982; Bowen , Marek , 1982; Kilbinger , 1984), так и на нехояинергических ( Ennis , Сох , I982;Fuder , 1982; Raiteri et al. , 1984). M-XP широко распространены во внутренних органах - в сердце ( Cavey et al. , 1977; Fields et al., 1978; Hartzell , 1980), трахее ( Basbaum et al., 1982, 1984), бронхах (pieisch, Calkins, 1976 ), в гладких мышцах желудочно-кишечного тракта ( Yamamura , Snyder , 1974), мочевого пузыря ( Creed , 1971; Craggs et al. , 1981; Anderson , Marks , 1982), матки ( Dale , 1914; Hakanishi , Wood , 1971), В некоторых СО-судах ( Furchgott ,Zawadski , 1980;Furchgott ,Cherry , 1984), в семявыносящем протоке ( Lindamood et al., 1978; Wakui et al. , 1984). Наличие M-XP было доказано ж в некоторых невозбудимых тканях: в экзокринных и эндокринных железах (Putney , Van de Walle , 1980; barose et al. , 1981; Champion t Mauchamp , 1982), эритроцитах ( Mantione ,Hanin , 1980), лейкоцитах ( Keiras et al. , 1977; Maslinski et al. , 1980; Maslinski et al. , 1983), В тучных клетках ( Blandina et al. , 1981; Mannaioni et al. , 1981) и яйцеклетках (Eusebi et al. , 1984).

M-XP как в гладких мышцах, так и в мышце сердца расположены, по-видимому, по всей поверхности мелких мышечных волокон (Hart -zeli » 1980; Sinback , Shain , 1980). Вероятно не на всех мышечных волокнах имеются М-ХР, а только на части их. Холинергичес-кие нервные окончания как в гладких мышцах, так и в сердце

содержат много варикозных расширений. Предполагают, что именно

в области варикозных расширений происходит освобождение АХ.

Расстояние от этих расширений до мышечных волокон сильно варьи-

о рует и может достигать 500 - 1000 А и более ( Burnstock , 1970;

Hartzell , 1980).

1.3. Выделение М-ХР

Попытки выделить М-ХР предпринимались уже давно, однако ранние работы показали только белковую природу М-ХР, а очистка М-ХР не была осуществлена (Турпаев, 1962; Турпаев и др., 1964; Нистратова и др., 1966; Takagi et al. , 1965; Takagi , Така -hashi , 1968). Использование меченых 2-галоидалкиламинов, имеющих высокое сродство к М-ХР и образующих ковалентную связь с ними (бензилилхолин иприт и пропилбензилилхолин иприт) позволили выделить из гладкой мышцы кишки белки с молекулярным весом 23 и 50 кД ( Fewtrell , Rang , 1973; Rang , 1975). Основные работы по выделению М-ХР осуществляются сейчас с помощью меченого хинуклидинилбензилата - высокоактивного и специфического мускаринового антагониста. Солюбилизированные М-ХР из центральной нервной системы, из сердца и гладких мышц проявляли сходные физические характеристики, выделенные белки имели молекулярный вес ОКОЛО 80000 Д ( Gorissen et al. , 1978; Birdsall et al. , 1979; Haga , 1980; Gorissen et al. , 1981; Laduron , Ilien ) 1982; Carson , 1982; Manalan et al. , 1983).

На основании данных, полученных методом включения фото-афинной метки, недавно была предложена схема, описывающая строение М-ХР и процесс перехода от связывания рецептора с лигандом к физиологическому ответу ( Avissar et al. , 1982;

AGONIST LOW AFFINITY STATE

INTERCONVERSION

AGONIST

HIGH AFFINITY

STATE

//"

fc>^0^[>^<3

Рис.I. Схема связывания лигандов с М-ХР (Sokolovsky , 1984)

А - Лиганд, взаимодействующий с М-ХР (агонист или антагонист)

О» Q~ субъединицы димера и.тетрамера соответственно, не
связанные с лиганд ом;..-" ....

j\, тг--конформации участков связывания мускариновых лиган-
^ дов после изомеризации димерной и тетрамерной форм

рецептора, соответственно;

_{а о}

конформации свободных субъединиц, возникающие вследст
вие изменения конформации соседних, связанных с лиган-
дом субъединиц. Этот эффект может привести к коопера-;
тивности при связывании лигандов с М-ХР; |

а - связывание лиганда А со свободными субъединицами димера (вверху) и тетрамера (внизу).М-ХР;

ь - изомеризация димера (вверху) или тетрамера (внизу), вызванная связыванием с лигандом А; "

с - связывание лиганда А с остальными субъединицами димера (вверху) или тетрамера (внизу.) М-ХР;

X, У - взаимодействие между узнающим участком тетрамера и димера соответственно и другими рецепторними белками рецепторного комплекса (ионные каналы, белки, связывающие циклические нуклеотиды и другие рецепторы);

Согласно этой схеме, М-ХР может существовать, по крайней мере, в 2-х состояниях: в форме димера, обладающего низким сродством к агонистам, и в форме тетрамера, обладающего высоким сродством к агонистам. Возможны взаимные переходы из одного состояния в другое.

- II -

1983; Sokolovsky , 1984). Предполагают, что М-ХР могут существовать, по крайней мере, в двух состояниях: в виде димера, состоящего из двух субъединиц (молекулярный вес одной субъединицы равен 40 кД), которые связаны между собой ковалентної связью, а также в виде тетрамера (молекулярный вес равен 160 кД), состоящего из двух таких димеров и содержащего одну или более дополнительные ковалентные связи (рис.1, Sokolovsky , 1984).

1.4. Физиология М-ХР

Физиологический ответ ткани при действии АХ на М-ХР.

Активация М-ХР приводит к сокращению круговых мышц глаза, трахеи, бронхов, сокращению всех мышц пищеварительного тракта, мышц матки, мочевого пузыря, оемявыносящего протока, к расширению кровеносных сосудов, к ослаблению и урежению сердечных сокращений. Возбуждение М-ХР приводит к секреции слюнных, потовых и других желез, к изменению функции щитовидной железы, гипофиза, лимфоцитов, тучных клеток ( Barlow , 1959; 1968; Sande et al. , 1979; Mannaioni et al. , I98I;Bevan , 1984). Активация пресинаптических М-ХР приводит к уменьшению выброса медиатора (Kilbinger , Wessler , 1980; Nordstrom , Bartfai , 1980; Fosbraey , Johnson , 1980; KilDinger , Kruel , 1981; Lechmann , banger , 1982; Komori , Ohashi , 1984).

Электрофизиологические изменения при действии АХ на М-ХР

мышц

Электрофизиологические исследования показали, что при возбуждении М-ХР большинства гладких мышц ацетилхолином или дру-

гими мускариномиметическими веществами происходит деполяризация мембраны и учащение спонтанных потенциалов действия (вїіі -bring , Kuriyama , 1963; Kuriyama et al. , 1970; Creed , 1971; Bolton , 1972; 1973; Kirkpatrick , 1975; Bolton , 1979). Увеличение концентрации агониста приводит к стойкой деполяризации ( Bolton , 1972; Btilbring , Kuriyama , 1963; BulDring , Szurszewski , 1974; Bolton , 1979). Как отмечает Болтон, в некоторых гладких мышцах (продольной мышце тонкой кишки, taenia coli морской свинки; в привратнике желудка собаки) АХ и мускариномшетики, кроме вышеперечисленных эффектов, обладают дополнительным влиянием на форму спонтанных потенциалов действия (Bolton , 1979, 1981). Муска-риновые агонисты увеличивают продолжительность потенциала действия, в результате чего развивается фаза плато (тонкая кишка морской свинки, Bolton , 1975). Б тех мышцах, в которых потенциал действия имеет плато и до воздействия веществ (привратник желудка собаки), увеличивается аглплитуда и длительность этого плато ( Szurszewski , 1977). Поэтому Болтон ( Bolton, 1979) предполагает, что в этих мышцах существуют три типа М-ХР: два типа М-ХР, связанные с потенциалзависимыми каналами, и М-ХР, связанные с каналами, не зависящими от потенциала (третий тип). Первый тип М-ХР есть не во всех мышцах, а только в тех, где наблюдается влияние мускариномиметиков на форлу потенциала действия. Второй тип М-ХР, связанных с потенциалзависимыми каналами, обладает высоким сродством к мускариновым агонистам, их стимуляция приводит к сокращению. Третий тип М-ХР, связанный с каналами, не зависящими от потенциала, имеет низкое сродство к мускариномиметикам и их стимуляция приводит к увеличению проницаемости мембраны.

- ІЗ -

Изменение проницаемости мембраны для ионов при действии

АХ на М-ХР

Деполяризация мембраны гладких мышц, вызванная АХ или карбахолином, значительно снижается в растворе, не содержащем ИОНЫ На⁺ (Bolton, 1972, I973;Bulbring , Szurszewski , 1974; Brading et al. , 1980). Удаление ионов Na⁺ из раствора, омывающего мышцу, приводит также к угнетению сокращений, вызванных мускариновыми агонистами. Однако корреляции между степенью уменьшения деполяризации в безнатриевом растворе и угнетением сокращений нет. В некоторых случаях деполяризация сохраняется, в то время как сокращения полностью угнетены (Brading et al. , 1980). Предполагают, что угнетение сокращений при действии карбохолина в растворе, не содержащем ияны Na⁺ , связано прежде всего с уменьшением внутриклеточного содержания На* . Снижение содержания Ua⁺ внутри клетки приводит к нарушению связывания ионов Са⁴⁴" с внутриклеточными участками хранения. Б результате при повторной стимуляции мышцы запасы Са*⁺ быстро . истощаются и сократительные ответы исчезают ( van Breemen et al. , 1978; Brading et al. , 1980).

Вещества, активирующие М-ХР, вызывают значительное усиление тока калия из клетки, что было определено в опытах с использованием радиоактивных ионов (Burgen , Spero , 1968, 1970; James - Kracke , Roufogalis , 1981; Bolton , Clark , 1981). Усиление выходящего тока K⁺ вызвано, по-видимому, двумя причинами: увеличением калиевой проводимости и деполяризацией мембраны. Удаление ионов Na⁺ из внеклеточной среды влияет на калиевой ток в той мере, в какой оно влияет (в зависимости от природы заместителя) на деполяризацию мембраны (Brading et al.,

1980).

Сокращение продольной мышцы слепой кишки и продольной мыш- цы тонкой кишки морской свинки, вызванное мускариномиметически-ми веществами, связано с усилением обмена ионов Са⁴⁴* между наружным раствором и мышцей ( Hasu , Urakawa , 1973; Bolton , Kitamura , 1983). Предполагают, что сокращения гладких мышц возникают вследствие, поступления ионов Са"^н"1)за счет увеличения спайковой активности, так как входящий ток потенциала действия в гладких мышцах осуществляется ионами Са"¹*⁴" ( Tomita , 1970); 2) при вхождении ионов Са"¹*⁴" через потенциалзависимые каналы при длительной аппликации вещества и 3) при освобождении внутриклеточных запасов Са"¹⁴" при действии больших концентраций агониста (Brading , Sneddon , 1980). По схеме Рихельсона и Эль-Факаха-НИ ( El-Fakahany , Richelson , 1981) кальциевый канал ВКЛЮ-чен как возможное связуицее звено между М-ХР и физиологическим ответом (рис.2).

Изменение концентрации ионов хлора в растворе, омывающем мышцу, имеет незначительное влияние на деполяризацию, вызванную АХ или карбахолином (Bolton , 1972, 1973$ Bulbring , Szurszewski , 1974). Однако в опытах с мечеными ионами хлора было показано, что при действии карбахолина на мышцы матки увеличивается выход ионов хлора из клетки ( Worcel , Hamon , 1976). Возможно, что несоответствие атих результатов объясняется тем, что увеличение выхода ионов хлора связано в основном с активностью переносчика ионов и поэтому не может быть замечено в электрофизиологических опытах ( Bolton , 1981).

Регуляция силы и частоты сокращений сердца при действии АХ на М-ХР связано с разными ионными механизмами; снижение силы сокращений - результат уменьшения втекания ионов Са"¹"** в

C*R C*E
t+C 1+
A + R ^ ^A ^-А..-R + в< iA.R«B * ОТВЄТ

tt+B | Ca²⁺ it

B*R A-R + E»-fc==5A.R«E'

_тъз+

Рнс.2

Схема взаимодействия агонистов, обратимых антагонистов и 2-га-

лоид-алкиламинов с мускариновыми холинорецепторами (El - Ра-

kahany , Richelson , 1981).

А - агонист

В - обратимый антагонист

С - 2-галоидалкиламин

R - рецептор

Е - кальциевый канал в активной форме

Е»- кальциевый канал в десенситизированном состоянии

Агонист А образует обратимый комплекс с рецептором (A.R ), а затем тройной комплекс с кальциевым каналом (A»R^#E ). После этого возникает физиологический ответ ткани, комплекс A^#R»E переходит в десенситизированное состояние A*R-E' . Десенситизиро-ванный комплекс A«R*E» распадается с образованием комплекса A»R и десенситизированного канала Е'. Затем десенситизация кальциевого канала исчезает (переход кальциевого канала в активную форму Е ) и происходит диссоциация комплекса A«R .

Антагонист В образует обратимый комплекс с рецептором (B*R )

2-галоидалкиламины образуют ковалентную связь с рецептором (C»R ) или с кальциевым каналом (С^#е ).

Ионы кальция ( Са⁺⁺) и ланганиды ( ШЪ⁺⁺⁺) увеличивают сродство комплекса A»R к кальциевому каналу ( Е ).

клетку во время потенциала действия, а уменьшение частоты сокращений - результат увеличения калиевой проводимости и , вследствие этого - гиполяризации (Hartzeil , 1980).

Проводимость калиевого канала сино-атрикулярного узла сердца, связанного с М-ХР (3 рСм) в 5-Ю раз меньше проводимости канала концевой пластинки. Однако калиевый канал сердца открывается на более длительное время (100 мсек), чем канал концевой пластинки (Нота et al. , 1979).

Латентный период, длительность и температурная зависимость при действии АХ на М-ХР

Отличительной чертой М-ХР является длительный латентный период между аппликацией веществ, возбуждающих М-ХР, и ответом, а также медленное развитие ответа ткани. На разных тканях латентный период составляет примерно 100 мсек, а время достижения максимума - около I сек (Purves , 1978;Hartzeil ,1980). Латентный период ответов при возбуждении никотиновых холино-рецепторов составляет всего 0,5 мсек, а время достижения максимума около I мсек (Katz ,Miiedi , 1965). Длительный латент-ный период мускариновых ответов связан, по-видимому, не с проведением импульса по нерву, а с особенностями взаимодействия медиатора с рецептором или с последующими этапами развития ответа, так как при раздражении нерва и при ионофоретической аппликации АХ наблюдают примерно одинаковую задержку, равную 100-500 мсек (Purves , 1974, 1978; Glitch , Pott , 1978; Hill - Smith , Purves , 1978; Horth , Tokimasa , 1984). Многие исследователи считают, что длительный латентный период мускариновых ответов нельзя объяснить диффузией вещества к

рецептору ( Pur es , 1974; 1978; Bolton , 1976; Hartzell , 1980; Osterrieder et al. , 1981). Выдвинуто несколько возможных объяснений существования такого длительного латентного периода: I) Участие второго посредника - цІМФ в мускариновом действии АХ; 2) Существование медленной ферментативной стадии увеличения обмена фосфоинозитидов, следующей за оккупацией М-ХР ( Michell et al., 1976).¹ 3) Медленная кинетика открывания и закрывания ионных каналов, связанных с М-ХР ( Osterrieder et al., 1981). Эффект действия АХ на М-ХР характеризуется высокой температурной зависимостью. Снижение температуры приводит к увеличению латентного периода, увеличению времени нарастания ответа и к уменьшению ответа. Скорость нарастания ответа при уменьшении температуры на ЮС (коэффициент Q₁₀ ) на сердце лягушки уменьшается в 2,75 раза, а на сердце кролика в 1,5-1,9 раза ( Hartzell , 1980; Osterrieder et al. ,I98I)V

1,5. Биохимия М-ХР

Участие циклических нуклеотидов в реализации эффекта АХ на М-ХР

С начала 70-х годов развивается представление о том, что цІМФ является внутриклеточным посредником в реализации эффекта АХ на М-ХР ( George et al. , I970;Ferrendelli et ,1970; Lee et al. , 1972). Действительно, во многих тканях: в гладких мышцах, в сердце, в ганглиях, в разных отделах центральной нервной системы, в эндокринных железах, в лимфоцитах и в других тканях - было обнаружено увеличение цВИФ при действии мускари-номиметических веществ на М-ХР ( George et al. , 1970; Lee et al. _f 1972; Cramer , Schultz , 1977; Hanley , Iversen ,1978; Sande

Sande et al,I979; Derome et al. , I98I).

Предполагается, что при действии АХ на М-ХР кальций активирует гуанилатциклазу (schultz , 1973), происходит увеличение цШФ в клетке. Это приводит к активации цЕМФ-зависимых протеин-киназ, которые фосфоржщруют белки мембран, в результате чего повышается проницаемость мембраны и развивается физиологический ответ (кио , 1974; Greengard , 1976). Наиболее убедительные доказательства в пользу такой последовательности событий были получены в опытах на нейронах нейробластомы мыши. На этих клетках мускариномиметики увеличивают образование цІМФ более чем в 10 раз, причем этот эффект специфически блокируется атропином. При блокаде фосфодиэстеразы-фермента, разрушающего цІМФ усиливается эффект мускариномиметиков. Увеличение уровня цІМФ при действии АХ на М-ХР нейробластомы зависит от ионов кальция. В отсутствии кальция увеличение цІМФ не происходит. При введении внутрь клетки нейробластомы цІМФ вызывает такой же эффект, как и мускариномиметики, т.е. гиперполяризацию, которая не блокируется атропином. Временные параметры увеличения цІМФ близки времени возникновения гиперполяризации, вызываемой мус-кариномиметиками. Однако участие цІМФ в качестве второго посредника после действия АХ на М-ХР других тканей не доказано так строго и последовательно, как это сделано в случае М-ХР нейробластомы мыши. Наиболее слабым звеном этой теории является тот факт, что во многих тканях развитие физиологического ответа происходит быстрее, чем увеличение содержания цШФ в клетке; Часто эффект мускариномиметиков, подводимых к клетке, не совпадает с эффектом внутриклеточного введения цІМФ.

Роль фосфоинозитидов в реализации эффекта АХ на М-ХР

Во многих тканях, содержащих М-ХР, показано усиление обмена фосфоинозитидов в ответ на активацию М-ХР ( Michell et al,, I976;Jafferji ,Michell , 1976; Davis et al., 1980; Hauser, Parks , 1983;Brown , Brown , 1983). Считают, что изменение обмена фосфатидилинозитола регулирует работу кальциевых каналов на поверхности мембраны ( Michell et al. , 1977). Митчелл ( Michell, 1975) пре,дположил, что имеет место следующая цепь событий: оккупация рецептора — ^> усиление распада фосфатидилинозитола —]> освобождение мембранно-связанных ионов кальция —У> открытие ионе елективних каналов. Получены экспериментальные данные, доказывающие, что усиление распада фоефо-тидилинозитола при активации М-ХР предшествует увеличению внутриклеточной концентрации кальция. Во-первых, усиление обмена фосфоинозитидов, вызванное муокариновыми агонистами, не зависит от содержания ионов кальция ( Jones , Michell ,1975; Oron et al., 1975). Правда, из этого правила есть исключение; Например, в сердце синтез фосфатидилинозитола значительно замедляется при удалении ионов кальция из раствора ( Brown, Brown , 1983). Во-вторых, ионофоры кальция не стимулируют обмен фосфоинозитидов («Bones ,Michell , 1975; Michell et al., 1975). В-третьих, антагонисты кальциевых каналов блокируют вхождение кальция внутрь клетки и угнетают физиологический ответ ткани, но не влияют на усиление обмена фосфоинозитидов, вызванное стимуляцией М-ХР (Birdsall , Hulme , 1976). На тесную связь между активацией М-ХР и распадом фосфоинозитидов указывает также то, что кривая концентрация - действие карбахолина, полученная на тонкой кишке морской свинки по включению меченого фосфора в фосфо-

инозитиды (Micheii et ai., 1976), практически совпадает с кривой концентрайия - действие, полученной в опытах по связыванию карбахолина с мускариновыми холинорецепторами той же ткани ( Birdsall, Hulme, 1976).

1.6. Исследование М-ХР химико-фармакологическим методом и связывание фармакологических веществ с М-ХР

Взаимодействие АХ с М-ХР На основании результатов изучения зависимости между активностью и химической структурой веществ были предложены различные Схемы СТроеНИЯ аКТИВНОГО центра М-ХР ( Barlow, 1959, 1968; Beckett et al. , I96I;I963; Burgen, 1965; BebMngton et al., 1966; Кузнецов, ІЬликов, 1962; Кіег, 1967; Брице, 1974). Одна из схем взаимодействия АХ с М-ХР представлена на рис.З

Схема взаимодействия АХ с М-ХР

Предполагают, что активный центр М-ХР имеет анионный пункт, взаимодействующий с катионной группой молекулы АХ, ж эстерофильный пункт, взаимодействующий со сложноэфирной

Таблица I

Химическое строение мускариномиыетических веществ

Название

Химическое строение

Диоксолан F-2268

,0

у wCH₂-N (СН₃)₃ J

н^-cr н

Мешилфурметид

н₃о- ^

-сн₂-н (сн₃)₃ J"

Ацетил- 6 -метилхолин

н₃с-с-о-сн-сн₂-іт(сн₃ )₃ сн₃

С1*

о

Ареколин

н₃с-о-с-

НВг

Оксотреморин

-СНо-С=С~СНр-ЇІ

Пилокарпин

н_кс₀-сн-

э с I

о=с

сн-сн₀-с .сн₂ на.

'Н-

1-⁰ . неї .сн

Ацеклидин

н₃с-с-о-

* ^С?^нб3

Продолжение таблицы I

группой молекулы АХ (рис.3). Анионный пункт окружен гидрофобной областью, на которой сорбируются радикалы катионной группы. Метильная группа кислотной части молекулы АХ сорбируется на втором гидрофобном участке М-ХР. Многие считают, что анионный пункт М-ХР, вероятно, представлен карбоксилат-анионом дикарбоновой аминокислоты (аспарагиновой или глютаминовой) или фосфат анионом. Исследование соединений, имеющих различные гидрофобные радикалы, показало, что гидрофобная область у анионного пункта М-ХР имеет относительно "небольшие" размеры. Гидрофобный участок расположенный за эстерофильннм пунктом М-ХР -"короткий и широкий" (Barlow , 1968; Брипе, 1974). При взаимодействии молекулы АХ с эстерофильннм пунктом М-ХР важное значение имеет эфирный кислород (Barlow , 1968; Безноско и др., 1981). Для взаимодействия с М-ХР важное значение имеет распределение электронной плотности молекулы АХ ( Pullman et al. 1971; Голованов и др., 1975). На основании теоретического кон-формапионного анализа АХ и его аналогов показано, что АХ взаимодействует с М-ХР в гош-гош-конформапии фрагмента C-0-C-C-N (Kier , 1967; Бровцына, 1981).

Активность и связывание мускариномиметических и мускаринолитических веществ с М-ХР

В таблицах I и 2 приведено строение, а в таблицах 3 и 4 активность наиболее известных веществ, возбуждающих и блокирующих М-ХР. Из периферических М-ХР наиболее изучена фармакология М-ХР тонкой кишки морской свинки, поэтому в таблицах 3 и 4 приведена активность веществ, полученная в опытах на этом объекте. Чувствительность М-ХР других тканей к этим веществам менее .изучена и в литературе имеются лишь разрозненные сведения об

Таблица 2 Химическое строение мускаринолитических веществ

Название

Химическое строение

Атропин

СН_о0Н СН.

-сн-с-о-сн

II I О СН.

и-сн.

СН —

СН,

СН,

_о

Скополамин

Антренил

Ж-СН-
t J
СН

1/2 HgSO.* 1/2 Н₂0

\

СН_о0Н сн₀-

I с. \ с

-СН-С-О-СН

/

И і

о сн„-

* НВг з н₂о

+⁽?2^Н5

\

2 « v«₃

с₂н₅

с -С-0-СН_о-СН_о-Ш-СН

о

Бензилилхолин (метацин)

+ 1 і

С-С-0-СН_о-СН_о-1Т-СН., / II ^ ^ I J

о сн₃

_{О' о}

Хинуклидинил-бензилат

\|

с-с-о-

НВг

активности некоторых из этих веществ (Машковский, Зайцева, I960; Barlow , 1959; 1968; Rossum et al. , I960; Голиков, Кузнецов, 1962; Голиков и др., 1973; Зайцева, 1972; Lamhrecht , 1979; Barlow et al. , 1980; Brown et al. , 1980; Barlow, Kitchen , 1982; Barlow, Chan , 1982; Caufield, Stubley , 1982).

Чувствительность разных отделов желудочно-кишечного тракта крыс к мускариномиметикам (ареколину, ацетилхолину) и мускаринолитику (атропину) исследована в онтогенезе. Было показано, что гладкие мышцы крысят 1-недельного возраста отчетливо реагируют на эти вещества (Бельгова и др., 1972; Маркова, Бельгова, 1976; Маркова, Бельгова, 1981). Из таблицы 3 и 4 видно, что мускариномиметические и мускаринолитические вещества активны в низких концентрациях. Из мускариномиметиков ^{! f}:. наиболее активны диоксолан Р - 2268, метилфурметид и оксотре-морин; а из мускаринолитиков - хинуклидинилбензилат, скополамин и антренил. АХ имеет активность, близкую наиболее эффективным мускариномиметикам.

При исследовании защиты М-ХР мускариномиметиками от связывания мускаринолитиков получен коэффициент Хилла около 0,5 (см. Birdsall , Hulme , 1976). Такой коэффициент объясняют тем, что мускариномиметики обладают высоким и низким сродством к разным участкам М-ХР и связываются с М-ХР с двумя разными константами. Например, при связывании АХ с М-ХР продольной мышцы тонкой кишки морской свинки Кд составляют I,8'I0""^ М и I,6'I0""⁶ М (Burgen , Hiley , 1974). Хинуклидинилбензилат является наиболее активным и длительно действующим мускаринолити-ком, поэтому он обычно используется для изучения связывания веществ с М-ХР, а также для выделения М-ХР ( Yamamura, Snyder,

Таблица З Активность мускариномиметических веществ, взаимодействующих с М-ХР тонкой кишки морской свинки

- концентрация вещества, вызывающая 50% ответ ткани.

Активность веществ, полученная в опытах на тонкой кишке крысы

Таблица 4 Активность мускаринолишических веществ, взаимодействующих с М-ХР тонкой кишки морской свинки

1974; Fields et al., 1978; El-Fakahany et al., 1984).

Хинуїшздикилбензилат связьшается с единой популяцией М-ХР, имеющих одну константу диссоциации (около 2 ^10^-1) и с коэффициентом Хилла равным I.

Стереоспецифичность М-ХР

М-ХР позвоночных обладают высокой стереоспецифичностью, что говорит о наличии трех участков связывания веществ в активном центре М-ХР (см.Голиков и др., 1973). Для классических мускариновых веществ миметика ацетил-А-метилхолина и литика гиосциамина отношение активности оптических изомеров составляет 240 И 100 соответственно (CM. Barlow, 1968; Barlow et al., 1973). Стереоспецифичность никотиновых холинорецепторов во много раз ниже (Голиков и др., 1973).

Исследование активности етереоизомеров мускариновых аго-нистов помогли сформулировать ряд требований для веществ с высокой акТИВНОСТЬЮ (Chotia, 1970; Shefter, Triggle, 1970; Baker et al., 1971). Оказалось, что при взаимодействии с М-ХР более активны изомеры соединений, находящиеся в транс-конформации (Biggs et al., 1973). Кроме того, для высокой мускариновой активности важна абсолютная конфигурация асимметричного центра молекулы. Например, отношение активности оптических изомеров транс-ацетоксициклопропилтримегиламмония, имеющих различные конфигурации асимметричных центров, равно 450. Как правило, высокая активность мускариномиметиков обусловлена s- конфигурацией второго от азота углеродного атома (см.Голиков и др., 1973).

Значение абсолютной конфигурации асимметричного центра для

высокой мускаринолитической активности было также показано при исследовании энантиомерных пар антагонистов. Однако в разных группах мускаринолитиков стереоизомеры, обладающие высокой активностью, могут иметь разные абсолютные конфигурации асимметричных центров. Например, среди стереоизомеров производных циклогексилгликолевой и dl~ метилтроповой кислот более активны (+)-изомеры, асимметрические центры которых имеют r - конфигурацию ( Barlow et al. , 1973), тогда как более активные (-) - изомеры гиосцина и гиосциамина имеют s - конфигурацию асимметричного центра (см. Barlow , 1968),

Исследование мускаринолитиков с 2 или 3 центрами асимметрии позволило выяснить значение каждого из этих центров для стереоспецифичности их действия. Было показано, что для стерео-специфичности веществ основное значение имеет асимметричный центр, расположенный в кислотной части молекулы, тогда как асимметричный центр в основной части молекулы менее важен (Brimhle-combe et al. , 1971а, І97ІВ; Inch , Brimhlecombe , 1971; inch et al. , 1973). Однако абсолютные конфигурации асимметричного центра в кислотной части молекулы стереоизомера, обладающего более высокой активностью, для разных групп холинолити-ков не совпадают ( Cherkez et al. , 1978; Aronstam et al. , 1979). Предполагают, что высокоактивные мускаринолитики, имеющие разные конформации асимметричного центра, одинаково ориентированы по отношению к активной поверхности рецептора (см. Голиков и др., 1973). Б ряде случаев стереохимические требования для мускариновых агонистов и для разных групп антагонистов не совпадают.- Это возможно, связано с разными механизмами действия и с тем, что мускариновые антагонисты, содержащие циклические радикалы, взаимодействуют с дополнительными участками

- зо -

М-ХР.

Важно отметить, что при изучении стереоизомеров аналогов оксотреморина был показан различный тип действия этих веществ на М-ХР. Среди исследованных веществ были антагонисты, агони-сты и частичные агонисты. Во всех случаях R - изомеры были более активны, чем S - изомеры ( Dahlbom et al. , 1982). Следовательно, в данном случае стереохимические требования для а гонистов и антагонистов совпадают. Авторы объясняют это тем, что в ряду этих веществ при переходе от агониста к антагонисту требуются менее значительные изменения в структуре лиганда, чем в случае классических мускаринолитиков, которые получают путем присоединения циклических радикалов к кислотной части молекулы агониста ( Dahlbom et al. , 1982).

1.7. Изучение М-ХР методом химической модификации

рецептора

Метод химической модификации очень удобен при изучении строения и функционирования рецепторов в составе живой мембраны ( Вульфиус, 1978). Главной особенностью метода является использование веществ, которые образуют ковалентные связи с определенными химическими группами. В первых работах по изучению М-ХР методом химической модификации были получены факты в пользу предположения о белковой природе М-ХР (Турпаев, I962;Takagi et al. , 1965; Takagi, Takahashi , 1968).

На основании изучения действия полиэтиленимида и диазо-сульфониевой кислоты на М-ХР было высказано предположение, что в активном центре М-ХР имеется имидазольное кольцо ( shild , I960; см.Северин, 1967).

- ЗІ -

Бензодиазоний

На основании изучения защиты М-ХР "полярными" (карбахолин, АХ, F-2268) и "неполярными" (ажил-производные тетраметиламмо-ния) агонистами от действия бензодиазония, который ковалентно связывается с рецепторами, Росс и Триггл предложили схему строения М-ХР гладкой мышцы ( Ross , Triggle , 1974). Согласно этой схеме "полярные" и "неполярные" агонисты.взаимодействуют четвертичными атомами азотов с анионным пунктом М-ХР, остальные части молекул этих соединений с разными участками М-ХР; "полярные" - с эстерофильным участком, а "неполярные" - с гидрофобным участком. Гидрофобный участок, по их мнению, является регуляторним пунктом М-ХР, который аллостерически влияет на другой пункт (анионный) М-ХР. Бензодиазоний образует ковалентную связь прежде всего с регуляторним участком М-ХР.

2-галоидалкиламины

Из группы 2-галоидалкиламинов наиболее активными и избирательными оказались производные бензшшлхолина: бензшшлхоли-ниприт и пропилбензилилхолиниприт. Эти вещества блокировали М-ХР тонкой кишки морской свинки в концентрации 10 М ( Gill, Rang , 1966; Young et al. , 1972). Эти соединения при растворении образуют этилениммониевый ион, катионная группа которого похожа на катионную группу молекулы АХ.. Это дает основание считать, что 2-галоидалкиламины блокируют анионный пункт М-ХР.

На основании относительно быстрого отмывания 2-галоидалкиламинов от М-ХР {Ъ% М-ХР в час) было выдвинуто предположение, что они связываются с карбоксильной или фосфатной груп-

пами в М-ХР, т.к. при блокаде других групп разрушение ковалентної связи происходит намного медленнее. Активность 2-гало-идалкиламинов не меняется при изменении рН раствора с мышцей от 6 до 10. Поэтому можно предположить, что степень ионизации группы, с которой образует ковалентную связь 2-галоидалкиламин, остается постоянной при изменении рН в этих пределах. Вероятно это карбоксильная группа, константа ионизации которой около 3-4 ( Gill, Rang , 1966; Beddoe et al. , 1971; Шелковников, Михельсон, 1977). Отмывание эффекта 2-галоидалкиламинов происходит в две фазы; полупериод первой фазы на порядок меньше, чем второй. Кроме того, в опытах на гладких мышцах 2-галоидал-киламины могут либо вызывать параллельный сдвиг кривой концентрация - действие мускариномиметика, либо сразу уменьшить максимальный эффект мускариномиметика. Авторы, получившие эти результаты, предположили, что 2-галоидалкиламины связываются в двух разных участках М-ХР. Алкилирование одного участка алло-стерически изменяет работу другого (основного) участка и происходит параллельный сдвиг кривой концентрация - действие мускариномиметика. Алкилирование другого участка - анионного пункта - ведет к уменьшению величины максимального эффекта мускариномиметика ( Moran , Triggle , 1970; Gupta et al. _t 1976). Исследование блокады М-ХР бензилилхолинипритом и пропил-бензилилхолинипиритом показало, что каждый из них имеет две константы связывания, различающиеся на два порядка ( Hiley et al. , 1972; Fewtrell , Rang , 1973; Burgen , Hiley, 1974, 1975; Robinson et al. , 1975).

Возможно, что одним из участков связывания 2-галоидалкиламинов является кальциевый канал ( El-Fakahani , Richelson , 1981). Эль-Факахани и Ричельсон сравнили способность 2-галои-

далкиламинов - феноксибензамина и дибенамина - блокировать образование цІМФ и связывание меченого хинуклидинилбензилата в клетках нейробластомы. Оказалось, что эти вещества блокируют образование цІМФ, вызванное карбахолином, в меньших концентрациях, чем связывание хинуклидинилбензилата. Кроме того, повышение концентрации Са⁴⁴" в наружном растворе приводило к ослаблению блокирующего действия 2-галоидалкиламинов в отношении образования цГШ, но не влияло на способность этих веществ блокировать связывание хинушшдинилбензилата. Эти результаты авторы объяснили предположением, что 2-галоидалкиламины связываются не только с М-ХР, но и с кальциевыми каналами (Е1 -Pakahani , Richelson , 1981).

Реагенты на дисульфидные связи и сулъфгидрильные

группы

Хотя для никотиновых холинорецепторов доказано существование дисульфидных связей, важных для взаимодействия АХ с рецептором ( Karlin , 1969; Karlin et al. , 1973), для М-ХР факты, отвечающие на этот вопрос однозначно, не получены. Турпаев (1962) показал, что сулема - агент, взаимодействующий с сульфгидрильными группами - блокирует М-ХР сердца. В других работах, посвященных исследованию значения сульфгидрильных групп и дисульфидных связей в функции М-ХР, были использованы три группы веществ: I) вещества, восстанавливающие дисульфидные связи с образованием сульфгидрильных групп - дитиотреитол (ДТТ), пистеин, глютатион; 2) вещества, окисляющие сулъфгидрильные группы (образование дисульфидных связей) - красная кровяная соль, дитио-бис - 2-нитробензоат ( dtito ); 3) вещества, ковалентно связывающие сулъфгидрильные группы - н - этилмалеимид

( НЕМ ), р-хлормеркурийбензоат (РСМВ), соли ртути (CH₃H_g, %01₂).

При исследовании действия ДТТ и item на М-ХР тощей кишки крысы авторы не обнаружили функционально важных дисульфид-ных связей и сульфгидрильных групп в М-ХР ( stub"bins, Hudgins , 1971). Недавно было показано, однако, что ДТТ вызывает неспецифическое потенцирование спазмогенной активности ряда агони-стов ( АХ, гистамина, брадикинина, хлористого калия) на тонкой кишке морской свинки ( Watson, ivsrsen , 1982). Потенцирование связано, по-видимому, с восстановлением дисульфидных связей, т.к. оно обратимо и исчезает после обработки dthb.

Во многих работах последних лет исследуют влияние ДТТ, нем и других веществ подобного действия на связывание меченых лигандов с М-ХР, в основном, с М-ХР мозга ( Aronstam et al. , 1977, 1978; Aronstam , Eldefrawi , 1979; Hedlund , Bartfai, 1979; Birdsall et al. , 1980; Abd - Elfattah , Shamoo , 1981; Hukada et al. , 1983; Korn et al. , 1983; Abd-Elfattah et al,, 1984). Было показано, что разрыв дисульфидной связи и образование сульфгидрильных групп, а также обратный переход от сульфгидрильных групп к дисульфидннм связям может иметь важное значение в связывании лигандов с М-ХР. Аронштам с соавторами предполагают, что действие РСМВ и нем на сродство и число участков связывания М-ХР определяется взаимодействием с двумя независимыми сульфгидрильными группами ( Aronstam et al.,I978). Однако полученные данные не позволяют пока сделать окончательные выводы о локализации и роли дисульфидных связей и сульфгидрильных групп в М-ХР.

1.8. Типы М-ХР, различия между М-ХР разной локализации

Первым косвенным свидетельством неоднородности М-ХР можно считать данные, полученные более 30 лет назад Riker и Wescoe (1951). Они показали, что миорелаксант галламин обладает избирательным блокирующим действием на сердце. Интерес к этой проблеме возник с появления работ Барлоу и сотрудников ( Barlow et al. , 1972; 1976). Данные в пользу различий между М-ХР получены как в фармакологических опытах в результате сравнения активности некоторых холиномиметических и холинолитичес-ких веществ на М-ХР разных тканей, так и при изучении связывания этих веществ с М-ХР этих тканей. Оказалось, что некоторые мускариномиметические вещества (ацетил^метилхолин, бетанехол,

McN-A-343, 4-ацетокси-и - метилпиперидин) и мускаринолити-ческие вещества (некоторые миорелаксанты, пирензепин, процикли-дин, цикримин, сековерин, 4-дифенилацетокси- н -метилпиперидин и тід.) влияют на М-ХР только определенной локализации (табл.5,6,7). На этом основании были выделены разные подтипы М-ХР: М-ХР гладких мышц, два подтипа М-ХР сердца, М-ХР ганглиев; Биохимические данные полученные при изучении связывания веществ с М-ХР не только показали неоднородность М-ХР периферических тканей, но и выявили разные подтипы М-ХР в центральной нервной системе.

Три типа М-ХР по Барлоу. Сравнение М-ХР трех тканей -продольной мышцы тонкой кишки, мышцы бронхов и круговых мышц глаза морской свинки - не выявило значительных различий в их сродстве к разным мускаринолитическим веществам ( Barlow et al., 1972). Только один мускаринолитик в 9 раз сильнее блокировал

Таблица 5 Химическое строение веществ, избирательно действующих на М-ХР определенной локализации

Название

Химическое строение

Орган

м у с к а р и н о м и м е т и к и

Пилокарпин

Н|-Со"*СН~ 5 2 |

0=С

сн-сн₀-с

сн.

і 2 и

-Н-СНо t J

Ганглий

Мсїї-А-343

^% -ш-с-о-сн₂-с-с-сн₂-Жсн₃ )₃

Ганглий

С1

н,с-с-о-сн

³ _{ft к}

\^гон^_н²

AHR-602

он₂ _

^itcH--0

Ганглий

н^с-с-оч и

³ _{8 \-У}

и(сн₃)₂

4-ацетокси-1-метшыш перидии метиодид (4 ЖР)

Ацетил-^-метилхолин

Н_аС-С-0-СН-СН₀-Н(СНо)^
З и і 2 3 3

о сн₃

МУСКАРИНолитики

Кишка

Сердце

N

_v-TO^(0H3)_*

сн-

4-дифенилацето-кеи-Н-метилпи-пегадин метиодид

(4 DjffiP)

О / \

Н-Й-СН₂-1Т U-CH,

Пирензепин

Кишка

Ганглий

Продолжение табл.5

Цикримин

v он с-сн₂-сн₂-н<

Кишка

G-GB₂-CE₂-B

Проциклидин

он

Кишка

-о-/(^)\-сн₂-сн-ічзн₂-сн₂-с

I СН-

Сековерин

_'Л

Кишка

иорелакеанты

Галламин

(флакседил,

пиралаксон)

О-СН^СН^-ЖС^)-

- 0-CH₂-CH₂-N(C₂H₅)₃ . 3 J* — 0-СН₂-СН₂-її(G₂E₅)₃

Сердце

О

сн_3/с-о-сн_{3 |+}

Панкуроний (павулон)

Сіеркуроний

Сердце

Сердце

Продолжение табл. 5

Анатруксоний

Сердце

_н

(сн„),-о-с-
с^₅ о

^сб^н5

о II

^5

-2-С-0-(СН₂)^Д

^С6^Н5

Таблица 6 Сравнение активности мускариномиметических и мускаринолитичес-ких веществ в опытах на сердце (по влиянию на частоту и силу сокращений) и на тонкой кишке морской свинки

Продолжение табл. 6

Л - отношение к, , полученный в опытах на кишке, к к

полученной в опытах на предсердиях.

^х' - активность веществ, полученная в опытах на крысе.

I - Barlow et al., 1980 П - Barlow et al», 1976

III - Barlow, Chan, 1982

IV - Brown, Crout, 1970

V - Clark, Mitchelson, 1976

VI - Saxena, Bonta, 1970

УП - Leung, Mitchelson, 1982 УДІ - Li, Mitchelson, 1980 IX - Харкевич, Шорр, 1980.

М-ХР кишки, чем М-ХР бронхов. Такие различия в мускариноли-тической активности вещества на разных тканях Барлоу объяснял заменой одной аминокислоты в рецепторном белке другой ткани на гомологичную, наприглер, заменой валина на лейцин или изолеицин.

При исследовании мускариновых антагонистов на М-ХР тонкой кишки и сердца морской свинки Барлоу с соавторагли показали, что самое избирательное из исследованных веществ - 4 - дифенилаце-токси - N - метилшшеридин метиодид (4-ЛАМР) - обладает в 20 раз более высоким сродством к М-ХР кишки, чем к М-ХР сердца. Эти результаты дани возможность высказать предположение, что М-ХР сердца и кишки имеют разное строение ( Barlow et al. , 1976). Интересно, что М-ХР ганглиев по чувствительности к 4-йШР занимали промежуточное положение между кишкой и сердцем; Сродство М-ХР ганглия крыс и 4-ІШІР в S раза меньше, чем к М-ХР кишки (табл.7).

Были найдены и друтие избирательные антагонисты по отношению к М-ХР кишки. Например, проциклидин и цикримин обладают в 38 раз большим сродством к М-ХР кишки, чем к М-ХР сердца ( Lambrecht et al. ,1983).- Сековерин избирательно блокирует М-ХР гладких мышц ( Zwagemakers , Claassen , 1980). Активность сековерина на продольной мышце морской свинки и на трахее быка составляет 0,6 от активности атропина. Это вещество почти не действует на холинергическую стимуляцию слюноотделения и потоотделения, на сокращения мочевого пузыря.

В опытах Барлоу фармакологическая активность мускариноми-метических веществ различалась на сердце и на кишке ( Barlow et al, 1980)'. Мускариновый агонист 4-ацетокси - и - метилпи-перидин в 3 раза слабее действует на М-ХР сердца, чем на М-ХР кишки. Ацетил - В метилхолин угнетает сокращения сердца

БІійЛІЮТЕКД COUP

Таблица 7

Сравнение активности мускариномиметических и мускарино-литических веществ на тонкой кишке в верхнем шейном ганглии крысы

хххх)

1,0-10

4,4-10

0,39

100 1,4

ускаринолитики ( , М)

Пирензепин

4-дифенилацетокси-и -метил пиперидин

9,6-10

2,5-10

метиодид ^:sxxx'

2,6-10 3,4-10'

2,6-10

2,4-10

Стеркуроний хххх) Атропин X^х-)

А- отношение ЕС₅₀ ^_{или к} ^ полученных в опытах на кишке, к

ЕС₅₀ (или к, ), полученных в опытах на ганглии. х) Caufield, StubDley, 1982 хх) Brown et al., 1980a xxx) Mutschler, bamorecht, 1984 xxxx) Brown et al., 1980Ъ

в концентрации, не влияющей на их частоту. На основании исследования действия мускариномиметических и мускаринолитических веществ на сердце и кишку Барлоу высказал предположение о существовании трех типов М-ХР, которые можно различить с помощью фармакологических веществ: I) М-ХР тонкой кишки; 2) М-ХР сердца, участвующие в регуляции силы сокращений и 3) М-ХР сердца, участвующие в регуляции частоты сокращений сердца. Различия между М-ХР сердца обусловлены, возможно, тем, что они контролируют разные ионные каналы. Один подтип М-ХР связан с кальциевыми каналами, ответственными за силу сокращения сердца, другой -с калиевыми каналами, ответетвенными за частоту сокращений сердца.*

Действие миорелаксантов на М-ХР

Много данных в пользу фармакологической неоднородности М-ХР было получено при исследовании действия миорелаксантов ( Brown, Crout , 1970; Saxena , Bonta , 1970; Шорр, 1975; Claris, Mitchelson , 1976; Marshall , Ojewole , 1979; Li, Mitchelson , 1980; Leung, Mitchelson , 1982; см.также Харке-вич, Шорр, 1983; Mitchelson , 1984). Было показано, что мио-релаксанты галламин ( Brown, Crout , 1970; Clark, Mitchel son , 1976), панкуроний ( Saxena, Bonta , 1970; Leung, Mitchelson , 1982), анатруксоний (Шорр, 1975), стеркуроний ( Li, Mitchelson , 1980),и алкуроний ( Dalton, Tyers , 1982) избирательно блокируют М-ХР сердца. Различия в активности миорелаксантов на разных тканях представлена в таблице 6. Однако по данным Барлоу, панкуроний в равной степени блокирует М-ХР сердца и кишки морской СВИНКИ ( Barlow et al. , 1980). Оказалось, что эффект миорелаксанта на М-ХР сердца и

кишки зависит от вида животного.

Некоторые миорелаксанты взаимодействуют не только с М-ХР сердца, но и с М-ХР ганглиев. Активация М-ХР верхнего шейного симпатического ганглия кошки вызывает два типа ответов - медленно развивающуюся деполяризацию и гиперполяризацию. Галламин и панкуронии избирательно блокируют М-ХР, активация которых вызывает гиперполяризацию ( Gardier et al. , 1978). В верхнем шейном симпатическом ганглии крысы мускарин вызывает деполяризацию. Исследование способности стеркурония и панкурония блокировать деполяризацию, вызванную мускарином, показало, что стеркуроний имеет в 100 раз более высокое сродство к М-ХР ганглиев, чем к М-ХР сердца, тогда как сродство панкурония к М-ХР ганглиев в 80 раз ниже, чем к М-ХР сердца ( Brown et al. , 1980; Dal ton , Tyers , 1982).

При исследовании взаимодействия миорелаксантов с М-ХР часто используют метод связывания меченых лигандов. Обычно определяют влияние миорелаксантов на связывание меченого хинуклидинилбен-зилата ( Ellis , Hoss , 1982; Stockton et al. , 1983; Dunlap , Brown , 1983). В этих исследованиях также как и в фармакологических опытах была показана избирательность действия миорелаксантов на М-ХР сердца. Например, сродство галламина к М-ХР сердца в 40 раз выше, чем к М-ХР слезных желез ( Stockton et al. , 1983). Однако по друтим данным константы диссоциации галламина и панкурония, полученные в опытах по вытеснению %) хинуклидинилбензилата, одинаковы на кишке и на сердце (cM.Mit-ichelson, 1984!).

Исследование действия миорелаксантов на М-ХР выявило ряд особенностей. Было показано, что зависимость между концентрацией миорелаксанта и его блокирующей способностью (график

Арунлакшана-Шильда) не линейна для всего диапазона концентраций ( Clark , Mitchelson , 1976; Li, Mitchelaon , 1980;

Dalton, Tyers , 1982), что говорит об отклонении от конкурентного типа антагонизма, другое отличие действия галламина от действия конкурентных антагонистов заключается в том, что комбинация миорелаксанта с атропином приводит к меньшему сдвигу-кривой концентрация-действие, чем в случае аддитивности их действия ( Clark , Mitchelson , 1976; Mitchelson , 1984).

В опытах по связыванию было показано, что в присутствии галламина уменьшается скорость ассоциации и диссоциации |_³HJ -Н - метилскополамина с М-ХР сердца ( Stockton et al. ,1983); Все эти особенности действия миорелаксантов объясняют аллосте-рическим взаимодействием их с рецептором ( Clark, Mitchelson , 1976; Stockton et al. , 1983; Mitchelson , 1984; Birdsall

et al. , 1984). Предполагают, что галламин связывается с участком, расположеннвм вне участка связывания обычных мускариновых антагонистов, и модулирует связывание агонистов и антагонистов с "обычным" участком связывания М-ХР. Было показано, что муска-риновый агонист МсН-А-343, так же как и галламин, имеет неконкурентный тип связывания с М-ХР миокарда. Высказано предположение, что эти два вещества - антагонист галламин и агонист

McN- А-343 - связываются с одним и тем же участком, который аллостерически влияет на связывание классических мускариновых агонистов и антагонистов ( Birdsall et al. , 1984).

Биохимические данные о типах М-ХР

Благодаря исследованию М-ХР с помощью меченых специфических лигандов были получены данные, которые так же, как и результаты фармакологических опытов, указывают на неоднородность

M-XP ( Burgen et al. , .w,^, , 1976; Birdsall ,

Hulme , 1976). Анализ данных, полученных при изучении связывания агонистов с М-ХР коры головного мозга, показал, что существует три подтипа М-ХР, которые различаются по сродству к агонистам. Эти участки связывания были названы SH (участки со сверхвысоким сродством), н (участки с высоким сродством) и ъ ( утастки с низким сродством) ( Birdsall et al. , 1978), Гетерогенность связывания агонистов с М-ХР наблюдается также в опытах на интактных гладких мышцах ( Young , 1974; Taylor et al.", 1975), в миокарде ( Berrie et al. , 1979), и на тонких срезах тканей парасимпатических ганглиев кишки и мозга (авторадиографический метод) ( Wamsley et al. , 1980; Buckley , Burn stock , 1984; Potter et al. , 1984). Между сродством агонистов к разным участкам связывания ( sh , н , ь ) и их активностью, полученной в фармакологических опытах, выявлены следующие соотношения: сродство агонистов к н участкам соответствует их активности, полученной в опытах по сокращению гладких мышц, тогда как сродство к L участкам приблизительно равно значениям, полученным в опытах с использованием необратимых антагонистов с целью выключения запаса М-ХР ( Birdsall et al. , 1978).

Первые исследования связывания классических высокоактивных антагонистов с М-ХР показали, что они связываются с единой популяцией рецепторов ( Burgen et al. , 1974; Yamamura , Snyder, 1974; Beld et al. , 1975; Hulme et al. , 1978). Константы сродства антагонистов, полученные в этих опытах, хорошо согласуются со значением констант сродства, полученных в фармакологических опытах (Birdsall, Hulme , 1976).

С появлением нового мускаринового антагониста пирензепина

(1980) начался новый этап в изучении вопроса о неоднородности М-ХР. Пирензепин оказался антагонистом М-ХР, обладающим необычными для классических антагонистов свойствами ( Hammer et al., 1980), Кривая связывания пирензепина с М-ХР мозга, так же как и кривые связывания агонистов, не подчиняются закону действия масс, что указывает на существование подтипов участков связывания, имеющих разное сродство к пирензепину ( Hammer et al. , 1980; Birdsall et al. , 1980; Hammer , 1982).

Позднее было показано, что пирензепин не является единственным антагонистом М-ХР, связывание которого неоднородно. В некоторых областях мозга, например, в аденогипофизе крыс ( Henis , Sokolovsky , 1983) и в хвостатом ядре мозга коровы (Демушкин, Храмцов, 1981) наблюдается неоднородность связывания и для других антагонистов М-ХР: 4 - К - метилпиперидилбензилата, хину-клидинилбензилата, N - метилскополамина, а также атропина. При взаимодействии с М-ХР этих тканей эти антагонисты имели по две константы связывания, которые различались в 4,9; 5,4; 5,5'и 21 раз соответственно.

Следует отметить, что участки с высоким сродством к пирензепину соответствуют L - участкам с низким сродством, выявленным по связыванию агонистов ( Mj тип рецептора), тогда как участки с низким сродством к пирензепину обладают высоким сродством к мускариновым агонистам за исключением МсЖ-А-343 ( Mg тип рецептора). М-ХР гладких мышц и сердца относят к М₂ типу рецепторов, М-ХР ганглиев - к Mj типу. В разных областях мозга наблюдают разное соотношение между Мт и М₂ типами рецепторов. Например, в гшшокампе крыс 80$ М-ХР составляют MV рецепторы, тогда как ствол мозга и верхние холмы содержат 90$ М₂ рецепторов ( Potter et al. , 1984). Пресинаптические М-ХР

по своим свойствам ближе к М₂ типу рецепторов, чем к Mj ( Kil -binger, 1984).

Фармакологические данные соответствуют данным, полученным по изучению связывания пирензепина. Исследование фармакологического действия пирензепина на крысе показало, что сродство пирензепина к М-ХР верхнего шейного симпатического ганглия в 23 раза выше, чем к М-ХР кишки (табл.7) ( Brown et al. , 1980). Активность пирензепина на изолированных предсердиях и на кишке оказалась одинаковой и довольно низкой ( Brown et al. , 1980; Barlow et al. , 1981; Barlow, Chan , 1982; Puder , 1982; Szelenyi , 1982). Низкое сродство к пирензепину имеют М-ХР, расположенные на адренергических нервах сердца кролика и крысы ( Fuder , 1982; Fuder et al. , 1982), а также пресинаптичес-кие М-ХР холинергических нервов тонкой кишки морской свинки ( Halim et al. , 1982).

Данные о строении и активности веществ, обладающих избирательным действием на разные типы М-ХР, представлены в таблицах 5 и 6.

Изучение природы неоднородности участков связывания М-ХР
показало, что под влиянием некоторых факторов неоднородность
связывания агонистов может уменьшаться ( SH и Н участки прев
ращаются в ь участки,.или наоборот) и образуется гомогенная
популяция рецепторов. К таким факторам относят действие гуани-
новых нуклеотидов. ( Wei , Sulakhe ,

1979; Rosenberger et al. , 1980; Ehlert et al. , 1980; Wael broeck et al. , 1982). іуанозинтрифосфат вызывает уменьшение сродства агонистов к М-ХР разных областей мозга и сердца. Однако изменения, вызванные гуанозинтрифосфатом, не всегда можно рассматривать как простое превращение участков с высоким срод-

ством в участии с низким сродством. Например, на сердце гуано-зинтрифосфат вызывает уменьшение сродства всех участков связывания до уровня более низкого, чем сродство L участков ( Waelbroeck et al. , 1982). Влияние гуанозинтрифосфата ( и его стабильных аналогов) на связывание лигандов с М-ХР не одинаково для разных тканей. Максимальный эффект гуаниновых нукле-отидов наблюдают на миокарде. В мозге он выражен в разной степени ( см. Burgen , 1984).

Двухвалентные катионы , особенно ионы магния, также влияют на связывание агонистов. Было показано, что ионы магния проявляют два эффекта в отношении связывания агонистов: I) увеличивают сродство агонистов к М-ХР, 2) в присутствии гуаниновых нуклеотидов усиливают их действие ( Wei , Sulakhe , 1980;

Hulme et al. , 1983; Eukada et al. , 1983).

В растворах с низкой ионной силой двухвалентные катионы и гуаниновые нуклеотиды влияют также и на связывание антагонистов с М-ХР сердца. Их эффект был противоположным тому, который наблюдается при связывании агонистов: ионы магния уменьшали, а гуанпзинтрифосфат увеличивал сродство антагонистов к М-ХР ( Hulme et al, 1981; Ehlert et al. , 1981; Btirgisser et al, 1982; Hosey , 1982). Все эти данные указывают на взаимодействие М-ХР сердца с белком, связывающим гуаниновые нуклеотиды, и на связь этих рецепторов с циклазной системой. Комплекс рецептора с щгклеотид-связывающим белком был недавно получен в растворимом состоянии (см. Birdsaii et al. , 1984). Этот комплекс имеет свойства SH участка, т.е. обладает сверхвысоким сродством к агонистам. Связывание с этим комплексом так же, как и с мембраносвязанными рецепторами, ингибируется стабильным аналогом гуанозинтрифосфата, 5'- гуанилилимидодифосфатом.

Регуляция гуаниновыми нуклеотидами более важна в случае М₂ типа рецепторов, тогда как ионы влияют на тот и другой подтипы рецепторов ( Мт и Eg).

Неоднородность участков связывания М-ХР не исчерпывается конформационными изменениями, которые могут быть вызваны гуаниновыми нуклеотидами, 2-валентными ионами и другими агентами. Доказательством того, что различия между подтипами М-ХР не связаны исключительно с разным окружением рецептора (разным липид-ным составом мембраны или разной степенью ассоциации с другими, не рецепторными белками), а отражают внутренние различия между рецепторными белками,явились данные о свойствах солюбилизирован-ных рецепторных белков. Было показано, что пирензепин сохраняет способность различать М-ХР головного мозга и миокарда при взаимодействии с солюбилизированными рецепторами этих двух тканей ( см? Birdsali et al. , 1984), Избирательность связывания пи-рензепина с Mj типом рецепторов сохранялась также при взаимодействии пирензепина с солюбилизированными Mj и М₂ рецепторами мозга крыс ( Potter et al. , 1984);

Таким образом, данные фармакологических опытов по избирательности действия некоторых веществ на М-ХР определенной локализации, а также данные, полученные в опытах по связыванию меченых лигандов, позволяют сделать вывод о существовании разных подтипов М-ХР. У млекопитающих обнаружено два подтипа М-ХР, которые различаются по локализации, фармакологии и функциям (таблица 8).'

Таблица 8

Разные типы мускариновых холинорецепторов

1.9. Заключение

М-ХР имеют следующие свойства:

I) Активируются и блокируюіся следующими веществами: мус-

кариномиметиками - метилфурметидом, диоксоланом р - 2268, оксо-

треморином, ацетил - В - метилхолином, пилокарпином, ацеклиди-ном; мусісаринолитиками: атропином, скопо ламином, хинуклидинил-бензилатом, антренилом, бензилилхолином, пропантелином и другими. Эти вещества избирательно связываются с М-ХР в биохимических экспериментах.

2. В отличие от никотиновых холинорецепторов, ответ при возбуждении М-ХР имеет большой латентный период, развивается очень медленно и значительно зависит от температуры.

3. В сердце гладких мышцах, обладающих автоматизмом, а также в ганглиях М-ХР выполняют регуляторную функцию. Блокада М-ХР не приводит к прекращению функции ткани. В отличие от М-ХР никотиновые холинорецепторы несут основную физиологическую роль в синаптическои передаче, например в ганглиях и в скелетных мышцах; блокада Н-ХР этих тканей ведет к значительным физиологическим нарушениям, к ганглионарному и курарному блоку;

4. При активации М-ХР происходит увеличение цШФ в ткани и изменение обмена фосфоинозитидов.

Получены фармакологические и биохимические данные о существовании нескольких типов М-ХР, Наиболее убедительные данные о различиях между М-ХР получены в биохимических экспериментах по связыванию веществ с М-ХР центральной неравной системы. Показаны фармакологические различия между М-ХР гладких мышц и сердца. Однако не известно, какие химические особенности строения активного центра М-ХР определяют отличие М-ХР сердца от М-ХР гладких мышц. До сих пор неизвестно, имеются ли фармакологические различия между М-ХР других тканей, например, между М-ХР гладких мышц разных органов.

Мускаринолитические и мускариномиметические вещества,

избирательно действующие на М-ХР определенной локализации, важны не только для физиологического исследования функции данного органа или ткани, но и для клинической практики. В клинике важно, чтобы мускаринолитические вещества, блокирующие М-ХР сердца, не блокировали М-ХР гладких мышц и, наоборот. В противном случае эти вещества вызывают побочные эффекты. Например, при применении мускаринолитиков для блокады М-ХР сердца их побочным действием будет атония кишечника. Для избирательной блокады М-ХР сердца нельзя воспользоваться миоре лаке антами, которые блокируют М-ХР сердца некоторых животных и не блокируют М-ХР гладких мышц, из-за их блокирующего действия на нервно-мышечную передачу. Вещества, избирательно блокирующие М-ХР гладких мышц и не действующие на М-ХР сердца, очень нужны для клиники. Известно, что атропин вызывает нежелательную тахикардию, а иногда нарушение ритма сокращения сердца (см. Innes,Nickerson , 1975). Вещества, избирательно блокирующие М-ХР желудочно-кишечного тракта (сековерин, проциклидин, цикримин), не могут быть предложены для клинического использования. Из избирательных мускаринолитических веществ широкое клиническое применение получил пирензепин. Это вещество избирательно блокирует М-ХР вегетативных ганглиев. Показано, что пирензепин тормозит желудочную секрецию и не влияет на деятельность сердца, на двигательную активность желудка, на функцию слюнных желез, на сокращение мочевого пузыря ( Jeimewein , 1979; Del Soldato et al,, 1982; Watson et al. , 1984), поэтому пирензепин в клинике используется для лечения язвенной болезни ( Pirenzepine, Sym -posium, 1980).

Важно знать, какие особенности молекулы мускаринолитичес-кого вещества определяют их избирательность действия. Зная эти

особенности молено вести целенаправленный синтез лекарственных веществ, избирательно действующих на М-ХР определенной локализации.

Исследование М-ХР химико-фармакологическим методом и связывание фармакологических веществ с М-ХР

Взаимодействие АХ с М-ХР На основании результатов изучения зависимости между активностью и химической структурой веществ были предложены различные Схемы СТроеНИЯ аКТИВНОГО центра М-ХР ( Barlow, 1959, 1968; Beckett et al. , I96I;I963; Burgen, 1965; BebMngton et al., 1966; Кузнецов, ІЬликов, 1962; Кіег, 1967; Брице, 1974). Одна из схем взаимодействия АХ с М-ХР представлена на рис.З Предполагают, что активный центр М-ХР имеет анионный пункт, взаимодействующий с катионной группой молекулы АХ, ж эстерофильный пункт, взаимодействующий со сложноэфирной группой молекулы АХ (рис.3). Анионный пункт окружен гидрофобной областью, на которой сорбируются радикалы катионной группы. Метильная группа кислотной части молекулы АХ сорбируется на втором гидрофобном участке М-ХР. Многие считают, что анионный пункт М-ХР, вероятно, представлен карбоксилат-анионом дикарбоновой аминокислоты (аспарагиновой или глютаминовой) или фосфат анионом. Исследование соединений, имеющих различные гидрофобные радикалы, показало, что гидрофобная область у анионного пункта М-ХР имеет относительно "небольшие" размеры. Гидрофобный участок расположенный за эстерофильннм пунктом М-ХР -"короткий и широкий" (Barlow , 1968; Брипе, 1974). При взаимодействии молекулы АХ с эстерофильннм пунктом М-ХР важное значение имеет эфирный кислород (Barlow , 1968; Безноско и др., 1981). Для взаимодействия с М-ХР важное значение имеет распределение электронной плотности молекулы АХ ( Pullman et al. 1971; Голованов и др., 1975). На основании теоретического кон-формапионного анализа АХ и его аналогов показано, что АХ взаимодействует с М-ХР в гош-гош-конформапии фрагмента C-0-C-C-N (Kier , 1967; Бровцына, 1981).

Активность и связывание мускариномиметических и мускаринолитических веществ с М-ХР В таблицах I и 2 приведено строение, а в таблицах 3 и 4 активность наиболее известных веществ, возбуждающих и блокирующих М-ХР. Из периферических М-ХР наиболее изучена фармакология М-ХР тонкой кишки морской свинки, поэтому в таблицах 3 и 4 приведена активность веществ, полученная в опытах на этом объекте. Чувствительность М-ХР других тканей к этим веществам менее .изучена и в литературе имеются лишь разрозненные сведения об активности некоторых из этих веществ (Машковский, Зайцева, I960; Barlow , 1959; 1968; Rossum et al. , I960; Голиков, Кузнецов, 1962; Голиков и др., 1973; Зайцева, 1972; Lamhrecht , 1979; Barlow et al. , 1980; Brown et al. , 1980; Barlow, Kitchen , 1982; Barlow, Chan , 1982; Caufield, Stubley , 1982).

Чувствительность разных отделов желудочно-кишечного тракта крыс к мускариномиметикам (ареколину, ацетилхолину) и мускаринолитику (атропину) исследована в онтогенезе. Было показано, что гладкие мышцы крысят 1-недельного возраста отчетливо реагируют на эти вещества (Бельгова и др., 1972; Маркова, Бельгова, 1976; Маркова, Бельгова, 1981). Из таблицы 3 и 4 видно, что мускариномиметические и мускаринолитические вещества активны в низких концентрациях. Из мускариномиметиков ! f:. наиболее активны диоксолан Р - 2268, метилфурметид и оксотре-морин; а из мускаринолитиков - хинуклидинилбензилат, скополамин и антренил. АХ имеет активность, близкую наиболее эффективным мускариномиметикам.

При исследовании защиты М-ХР мускариномиметиками от связывания мускаринолитиков получен коэффициент Хилла около 0,5 (см. Birdsall , Hulme , 1976). Такой коэффициент объясняют тем, что мускариномиметики обладают высоким и низким сродством к разным участкам М-ХР и связываются с М-ХР с двумя разными константами. Например, при связывании АХ с М-ХР продольной мышцы тонкой кишки морской свинки Кд составляют I,8 I0"" М и I,6 I0""6 М (Burgen , Hiley , 1974). Хинуклидинилбензилат является наиболее активным и длительно действующим мускаринолити-ком, поэтому он обычно используется для изучения связывания веществ с М-ХР, а также для выделения М-ХР ( Yamamura, Snyder, 1974; Fields et al., 1978; El-Fakahany et al., 1984).

Хинуїшздикилбензилат связьшается с единой популяцией М-ХР, имеющих одну константу диссоциации (около 2 10-1) и с коэффициентом Хилла равным I. Стереоспецифичность М-ХР М-ХР позвоночных обладают высокой стереоспецифичностью, что говорит о наличии трех участков связывания веществ в активном центре М-ХР (см.Голиков и др., 1973). Для классических мускариновых веществ миметика ацетил-А-метилхолина и литика гиосциамина отношение активности оптических изомеров составляет 240 И 100 соответственно (CM. Barlow, 1968; Barlow et al., 1973). Стереоспецифичность никотиновых холинорецепторов во много раз ниже (Голиков и др., 1973).

Исследование активности етереоизомеров мускариновых аго-нистов помогли сформулировать ряд требований для веществ с высокой акТИВНОСТЬЮ (Chotia, 1970; Shefter, Triggle, 1970; Baker et al., 1971). Оказалось, что при взаимодействии с М-ХР более активны изомеры соединений, находящиеся в транс-конформации (Biggs et al., 1973). Кроме того, для высокой мускариновой активности важна абсолютная конфигурация асимметричного центра молекулы. Например, отношение активности оптических изомеров транс-ацетоксициклопропилтримегиламмония, имеющих различные конфигурации асимметричных центров, равно 450. Как правило, высокая активность мускариномиметиков обусловлена s- конфигурацией второго от азота углеродного атома (см.Голиков и др., 1973).

Активность классических мускариномиметических веществ на гладких мышцах разных органов морской, свинки

Некоторые миорелаксанты взаимодействуют не только с М-ХР сердца, но и с М-ХР ганглиев. Активация М-ХР верхнего шейного симпатического ганглия кошки вызывает два типа ответов - медленно развивающуюся деполяризацию и гиперполяризацию. Галламин и панкуронии избирательно блокируют М-ХР, активация которых вызывает гиперполяризацию ( Gardier et al. , 1978). В верхнем шейном симпатическом ганглии крысы мускарин вызывает деполяризацию. Исследование способности стеркурония и панкурония блокировать деполяризацию, вызванную мускарином, показало, что стеркуроний имеет в 100 раз более высокое сродство к М-ХР ганглиев, чем к М-ХР сердца, тогда как сродство панкурония к М-ХР ганглиев в 80 раз ниже, чем к М-ХР сердца ( Brown et al. , 1980; Dal ton , Tyers , 1982).

При исследовании взаимодействия миорелаксантов с М-ХР часто используют метод связывания меченых лигандов. Обычно определяют влияние миорелаксантов на связывание меченого хинуклидинилбен-зилата ( Ellis , Hoss , 1982; Stockton et al. , 1983; Dunlap , Brown , 1983). В этих исследованиях также как и в фармакологических опытах была показана избирательность действия миорелаксантов на М-ХР сердца. Например, сродство галламина к М-ХР сердца в 40 раз выше, чем к М-ХР слезных желез ( Stockton et al. , 1983). Однако по друтим данным константы диссоциации галламина и панкурония, полученные в опытах по вытеснению %) хинуклидинилбензилата, одинаковы на кишке и на сердце (cM.Mit-ichelson, 1984!).

Исследование действия миорелаксантов на М-ХР выявило ряд особенностей. Было показано, что зависимость между концентрацией миорелаксанта и его блокирующей способностью (график Арунлакшана-Шильда) не линейна для всего диапазона концентраций ( Clark , Mitchelson , 1976; Li, Mitchelaon , 1980; Dalton, Tyers , 1982), что говорит об отклонении от конкурентного типа антагонизма, другое отличие действия галламина от действия конкурентных антагонистов заключается в том, что комбинация миорелаксанта с атропином приводит к меньшему сдвигу-кривой концентрация-действие, чем в случае аддитивности их действия ( Clark , Mitchelson , 1976; Mitchelson , 1984).

В опытах по связыванию было показано, что в присутствии галламина уменьшается скорость ассоциации и диссоциации _3HJ -Н - метилскополамина с М-ХР сердца ( Stockton et al. ,1983); Все эти особенности действия миорелаксантов объясняют аллосте-рическим взаимодействием их с рецептором ( Clark, Mitchelson , 1976; Stockton et al. , 1983; Mitchelson , 1984; Birdsall et al. , 1984). Предполагают, что галламин связывается с участком, расположеннвм вне участка связывания обычных мускариновых антагонистов, и модулирует связывание агонистов и антагонистов с "обычным" участком связывания М-ХР. Было показано, что муска-риновый агонист МсН-А-343, так же как и галламин, имеет неконкурентный тип связывания с М-ХР миокарда. Высказано предположение, что эти два вещества - антагонист галламин и агонист

McN- А-343 - связываются с одним и тем же участком, который аллостерически влияет на связывание классических мускариновых агонистов и антагонистов ( Birdsall et al. , 1984).

Биохимические данные о типах М-ХР

Благодаря исследованию М-ХР с помощью меченых специфических лигандов были получены данные, которые так же, как и результаты фармакологических опытов, указывают на неоднородность M-XP ( Burgen et al. , .w, , , 1976; Birdsall ,

Hulme , 1976). Анализ данных, полученных при изучении связывания агонистов с М-ХР коры головного мозга, показал, что существует три подтипа М-ХР, которые различаются по сродству к агонистам. Эти участки связывания были названы SH (участки со сверхвысоким сродством), н (участки с высоким сродством) и ъ ( утастки с низким сродством) ( Birdsall et al. , 1978), Гетерогенность связывания агонистов с М-ХР наблюдается также в опытах на интактных гладких мышцах ( Young , 1974; Taylor et al.", 1975), в миокарде ( Berrie et al. , 1979), и на тонких срезах тканей парасимпатических ганглиев кишки и мозга (авторадиографический метод) ( Wamsley et al. , 1980; Buckley , Burn stock , 1984; Potter et al. , 1984). Между сродством агонистов к разным участкам связывания ( SH , н , ь ) и их активностью, полученной в фармакологических опытах, выявлены следующие соотношения: сродство агонистов к н участкам соответствует их активности, полученной в опытах по сокращению гладких мышц, тогда как сродство к L участкам приблизительно равно значениям, полученным в опытах с использованием необратимых антагонистов с целью выключения запаса М-ХР ( Birdsall et al. , 1978).

Первые исследования связывания классических высокоактивных антагонистов с М-ХР показали, что они связываются с единой популяцией рецепторов ( Burgen et al. , 1974; Yamamura , Snyder, 1974; Beld et al. , 1975; Hulme et al. , 1978). Константы сродства антагонистов, полученные в этих опытах, хорошо согласуются со значением констант сродства, полученных в фармакологических опытах (Birdsall, Hulme , 1976).

Мускаринолитическая активность алкилзамещенных аналогов бензилилхолина на продольной мышце тонкой кишки морской свинки

Сравнение фармакологической активности различных веществ, взаимодействующих с М-ХР разных тканей, а также изучение связывания этих веществ тканями показало, что М-ХР неоднородны ( Subtypes of muscarinic receptors, Symposium , 1984).

Биохимические работы показывают, что в центральной нервной системе имеется несколько .подтипов М-ХР. Периферические М-ХР симпатических и парасимпатических ганглиев (Mj - ХР) отличаются от М-ХР друтих тканей ( М-ХР). Это было показано в опытах по определению связывания меченых веществ и по фармакологическому эффекту веществ на М-ХР этих тканей. М2-ХР также неоднородны, о чем свидетельствуют результаты как фармакологических, так и биохимических исследований. Некоторые исследователи выделяют М-ХР сердца и М-ХР гладких мышц. При этом предполагается, что в сердце имеется два вида М-ХР, один из которых влияет на частоту сокращений, а друтой - на силу сокращений сердца ( Barlow et al. , 1980). Имеются фармакологические данные в пользу предположения о существовании различий между М-ХР гладких мышц. Кроме того, М-ХР слюнных желез тоже обладают некоторыми фармакологическими особенностями.

Различия в чувствительности М-ХР получены, в основном, в результате исследования: I) Миорелаксантов, избирательно блокирующих М-ХР сердца и ганглиев и не влияющих на М-ХР гладких мышц; 2) Некоторых мускариномиметиков, например, ацетил - -метилхолина, влияющего по разному на частоту и силу сокращений сердца, и McN-A-343, избирательно влияющего на М-ХР ганглиев; 3) Пирензепина, избирательно блокирующего М-ХР ганглиев; 4) Веществ, используемых при лечении паркинсонизма (таких как проциклидин, цикримин), а также сековерша, блокирующих М-ХР гладких мышц желудочно-кишечного тракта сильнее, чем М-ХР мышц мочевого пузыря, радужки и слюнных желез,

Мы исследовали различия в фармакологической чувствительности М-ХР мышц разных органов морской свинки с помощью классических веществ, возбуждающих и блокирующих мускариновые холино-рецепторы (табл.10 и 14). Ранее действие этих веществ было исследовано в основном в опытах на тонкой кишке морской свинки ( табл.3, 4; Founeau et al. , 1944; Beckett et al. , 1961; Paton, Rang , 1965; Bebbington et al. , 1966). На других тканях морской свинки исследованы лишь некоторые из этих веществ. Из таблицы 3 видно, что даже на одном и том же объекте, на тонкой кишке морской свинки, для одного и того же мускарино-миметика значения EC Q различаются - по-видимому, в зависимости от методических условий, в которых работали разные авторы. Подробного изучения фармакологической активности классических веществ, взаимодействующих с М-ХР разных органов морской свинки (или какого-либо другого животного), ранее не проводилось.

На рис.7 представлены кривые концентрации-действие для разных мускариномиметических веществ, полученные в одном опыте на продольной мышце тонкой кишки морской свинки. Активность исследованных нами мускариномиметиков на разных тканях представлена в таблице 10. Величина ЕСзд метилфурметида на мышцах разных органов значительно различается: от 3,7xI0"8 М (про-дольная мышца тонкой кишки) до 1,4x10 М (миометрий) (рис.8, табл.10). Столь же большие различия в активности получены и для других веществ в опытах на мышцах разных органов. Это может быть связано не только с различиями в строении активных центров М-ХР разных тканей, но также с различиями в : I) толщине исследованных тканей, и, следовательно, во времени диффузии веществ к рецепторам; 2) количестве рецепторов, содержащихся в данной ткани; 3) зависимости мевду числом занятых рецепторов и величиной эффекта (сокращением гладких мышц или уменьшением амплитуды спонтанных сокращений предсердий); 4) механизмах сопряжения активации рецептора с ответом ткани.

Для того, чтобы избежать влияния всех этих факторов на результаты определения активности мускариномиметиков, активность агонистов оценивали относительно стандарта - МШ, активность которого на каждой из исследованных тканей принимали за I. На мышцах разных органов мы сравнивали, во сколько раз данный мускариномиметик сильнее или слабее МШ. Равноэффективные молярные концентрации мускариномиметиков представлены в таблице II. Активность ь (+) цис изомера диоксолана Р - 2268 и ацетЕкяхолина на всех объектах оказалась выше активности МШ. Мускариномиметики ацеклидин, пилокарпин и D (-) цис изомер диоксолана р - 2268 оказались на всех объектах слабее, чем МШ. Для некоторых мускариномиметиков наблюдались значительные

Блокада миорелаксантами М-ХР сердца и кишки крысы

Первые предположения о различиях между М-ХР разных тканей были сделаны на основе работы, опубликованной более 30 лет назад Riker и Wescoe (1951). Авторы показали, что миоре-лаксант галламин блокирует брадикардиго, вызванную раздражением блуждающего нерва или метахолином. Потоотделение, секрецию слюны и сокращение кишки, вызванные холиномиметиком, галламин не блокировал. Одно из объяснений этим фактам заключается в том, что М-ХР сердца отличаются от М-ХР, ответственных за другие физиологические процессы; Только в 70-х годах на изолированных органах было показано, что как галламин, так и другие миорелаксанты (панкуроний, стеркуроний, анатруксоний и другие производные труксилоновых кислот) на 1-2 порядка активнее блокируют М-ХР сердца, чем гладких мышц кишки ( Brown, Сrout , 1970; Saxena, Bonta , 1970; Шорр, 1972, 1975; Clark, Mitchelson , 1976; Dalton, Tyers , 1982; Mitchelson , 1984). Однако в биохимических работах по изучению способности галламина и панкурония блокировать связывание меченого муска-ринолитика хинуклидинилбензилата показано, что как панкуроний, так и галламин связываются с М-ХР сердца и кишки в одинаковой степени ( Mitchelson, 1984). Таким образом, существует противоречие между данными фармакологических и биохимических исследований;

Мы исследовали способность 7 миорелаксантов разной структуры блокировать М-ХР изолированных предсердий и продольной мышце тонкой кишки крысы как в фармакологических, так и в биохимических экспериментах. В фармакологических опытах определяли способность миорелаксантов блокировать сокращения изолированной продольной мышцы тонкой кишки крысы, вызванные мускариномиметиком ММ. На изолированных предсердиях определяли способность глиорелаксантов блокировать отрицательный инотропныи эффект, вызываемый разными концентрациями МШ. Биохимические эксперименты по изучению связывания миорелаксантов с М-ХР сердца и кишки крысы были проведены аспирантом Института физиологии АН ЧССР И.Недома в соответствии с предварительной договоренностью. Исследовалась способность разных концентраций миорелаксантов блокировать связывание 20 рМ меченого хинуклидинил-бензилата гомогенатами предсердий и продольной мышцы тонкой кишки крысы. Хинуїшщинилбензилат и миорелаксант инкубировали 60 минут, затем производили фильтрование и на фильтрах определяли количество связанного меченого хинуклидинилбензилата і Фармакологические и биохимические эксперименты проведены на крысах линии Бистар. Структуры исследованных миорелаксантов -галламина, панкурония, ажурония, ритетрония, теркурония, де-каметония и тубокурарина - приведены в таблице 18.

Результаты фармакологических опытов представлены в таблице 19, М-ХР сердца наиболее активно блокировал панкуроний rt (IxIO М), галламин был менее активен, теркуроний и ритетроний-. одинаково активны (2хЮ %), еще менее активным был алкуроний (6х10""%); декаметоний и тубокурарин были неэффективны в

По оси абсцисс - концентрации теркурония (И); По оси ординат мускаринолитическая активность, выраженная через логарифм (ОК - I); ОК - отношение концентраций метилфурме-тида, вызывающих одинаковый эффект после и до блокады рецепторов разными концентрациями теркурония. концентрации 1x10""%. Б опытах на сердце все миорелаксанты конкурентно блокировали эффект МШ. На рис.17, видно, что терку-роний параллельно сдвигает кривую концентрация-действие УШ в опытах на предсердиях крысы. На графике Арунлакшана-Шильда (рис.18) также показан конкурентный характер антагонизма между МШ и теркуронием на сердце, точки из разных опытов ложатся на прямую, которая отсекает по оси абсцисс отрезок, соответствующий величине К ;

В опытах на кишке наиболее активным оказался ритетроний (2,2x10-%). Панкуронш и теркуроний блокировал М-ХР кишки в концентрации 1x1 ОлЛ; алкуроний, декаметоний и тубокурарин не блокировали М-ХР кишки в концентрации 1x10" %. Почти в половине опытов на кишке миорелаксанты сдвигали кривую концент-рации-действие для МШ параллельно (рис .І9Н К_, полученные в этих опытах и приведены в таблице 19. Однако в остальных опы--- тах на кишке характер антагонизма между миорелаксантами и МШ оказался смешанным или неконкурентным. Например, на рис.20; видно, что теркуроний не только сдвигает кривую концентрация-действие для МШ вправо, но и уменьшает максимальный эффект МШ.

Алкуроний, галламин и панкуроний оказались в 50-100 раз менее активны на кишке, чем на сердце. Теркуроний на кишке был всего в 6 раз менее активен, чем на сердце. Ритетроний имеет одинаковую активность на кишке и на сердце;