Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Гломерулярная фильтрация белка 8
1.2. Реабсорбция профильтровавшегося белка 18
1.3. Канальцевая секреция белка 25
1.4. Транспорт белка в почке у представителей разных классов позвоночных..28
1.5. Экскреция белка почкой при изменении диуреза 33
Глава 2. Материалы и методы 36
2.1. Объекты исследования и серии экспериментов 36
2.2. Лабораторные методы исследования 40
Глава 3. Результаты исследования 47
3.1. Экскреция белка почкой при разных типах диуреза 47
3.1.1. Выведение белка почкой крыс 47
3.1.2. Выведение белка почкой человека 77
3.1.3. Выведение белка почкой лягушки 86
3.2. Влияние блокады ренин-ангиотензиновой системы на экскрецию белка при разных типах диуреза 89
3.3. Экскреция белка почкой крыс при действии аналогов гормонов нейрогипофиза 94
3.4. Влияние оксида азота (N0) на экскрецию белка почкой крыс 108
Глава 4. Обсуждение результатов 122
Выводы 140
Список литературы
- Гломерулярная фильтрация белка
- Реабсорбция профильтровавшегося белка
- Объекты исследования и серии экспериментов
- Экскреция белка почкой при разных типах диуреза
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одно из основных положений физиологии почки заключается в том, что в клубочках происходит ультрафильтрация плазмы крови, благодаря чему конечная моча представляет собой безбелковую жидкость (Smith, 1951; Наточин, 1993; Шейман, 2001). Проницаемость гломерулярного фильтра для белков очень мала (Deen, 2004; Haraldsson, Sorensson, 2004), а возможности их реабсорбции в проксимальном канальце велики (Christensen, Gburek, 2004), поэтому почка здорового человека и животных практически не выделяет белок - суточная экскреция у человека не превышает .150 мг (Rennke, Denker, 2007). Появление белка в моче, в частности, альбумина относится к числу важных диагностических признаков патологии почек и сердечно-сосудистой системы (Титов, Тарасов, 1988; Bakris, 2001; Аракелянтс и др., 2003; Хирманов, 2004; Наточин, Мухин, 2007). Тем не менее, ряд фактов говорит о возможности протеинурии при некоторых физиологических состояниях, таких как интенсивная физическая нагрузка, ортостаз, лихорадка, эмоциональный стресс (Poortmans et al., 1989; Храйчик и др., 2001). Есть отдельные наблюдения, свидетельствующие об увеличении экскреции некоторых белков почкой при изменении скорости мочеотделения (Guamieri et al., 1979; Viberti et al., 1982; Houser, 1986; Jespersen et al., 1986; Jung et al., 1988; Wiegmann et al., 1989). Факторы регуляции уровня экскреции белка почкой не описаны. Остается открытым вопрос о пределах вариабельности и механизмах влияния процессов, лежащих в основе мочеобразования, на уровень экскреции белка в норме. Выяснение условий развития физиологической протеинурии представляет безусловный интерес как для нормальной физиологии, так и для практической медицины.
Цель исследования: выявление факторов, оказывающих влияние на уровень экскреции белка почкой в норме. Задачи исследования:
Сравнительное исследование экскреции белка почкой при осмотическом, водном диурезе и салурезе.
Сопоставление экскреции белка у человека и некоторых видов животных (крыса, травяная лягушка).
Исследование влияния ренин-ангиотензиновой системы на экскрецию белка при полиурии.
Сравнительное исследование влияния гормонов нейрогипофиза (аргинин-вазотоцин (AVT), аргинин-вазопрессин (AVP) и их аналоги) на экскрецию белка почкой крысы.
Исследование влияния оксида азота (NO) на выведение белка почкой крысы.
Научная новизна. Впервые показано, что у крыс полиурия различного генеза приводит к значимому повышению экскреции общего белка, в том числе альбумина. Аналогичные изменения экскреции белка выявлены при водном диурезе у здоровых обследованных и при глюкозурии у пациентов с сахарным диабетом I типа без нефропатии.
Впервые показано, что у крыс ряд аналогов гормонов нейрогипофиза (1-дезамино-8-аргинин-вазотоцин (1d-AVT), 1-дезамино-8-гомоаргинин- вазотоцин (1d-hAVT), 1-дезамино-4-треонин-8-аргинин-вазотоцин (1d-4Thr-AVT)) в дозах 0.5-1.0 мкг/кг обратимо увеличивает экскрецию белка почкой, этот эффект в значительной степени снимается введением антагонистов Vi-рецепторов.
Впервые показано, что метиловые эфиры Л/ш-нитро-І_-аргинина и Л/ш-нитро-Р-аргинина (L-NAME и D-NAME) при парентеральном введении вызывают, развитие массивной протеинурии (альбуминурии) у, крыс, за счёт увеличения проницаемости гломерулярного фильтра для* белков. На этой экспериментальной модели впервые показано влияние гиперволемии и лигандов вазопрессиновых рецепторов на экскрецию белка почкой крыс.
Научно-практическаязначимость работы. Полученные данные указывают на,необходимость учёта уровня диуреза и тщательной оценки состояния почки для дифференциальной диагностики физиологической протеинурии и повышенной экскреции белков, свидетельствующей о патологии почек.
Результаты диссертации используются в курсах лекций «Физиология почки и водно-солевого обмена», читаемых на,медицинском факультете Санкт-Петербургского государственного университета.
Положения, выносимые на защиту.
Водная нагрузка у крыс и человека, осмотический диурез у пациентов с сахарным диабетом I типа, полиурия у> крыс, вызванная введением осмотических диуретиков, фуросемида и 1d-AVT, приводят к повышению экскреции белка почкой. Угнетение активности ангиотензин-превращающего фермента не препятствует развитию данной формы физиологической протеинурии у крыс.
Ряд аналогов гормонов нейрогипофиза (1d-AVT, 1d-hAVT, 1d-4Thr-AVT) увеличивают экскрецию общего белка, в том числе альбумина, и этот эффект в значительной степени снимается введением антагонистов V-i-рецепторов.
Парентеральное введение L-NAME и D-NAME вызывает развитие массивной протеинурии у крыс, вероятно, за счёт увеличения проницаемости гломерулярного фильтра. Водная нагрузка, введение лигандов вазопрессиновых рецепторов и угнетение синтеза NO усиливают NAME- зависимую протеинурию.
Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на 11-й и 12-й Всероссийских медико-биологических конференциях молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2008 г. и 2009 г.), Всероссийской конференции «Научное наследие академика Л.А. Орбели. Структурные и функциональные основы» эволюции функций, физиология экстремальных состояний» (Санкт-Петербург, 2008 г.), VI Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 50-летию открытия A.M. Уголевым мембранного пищеварения (Санкт-Петербург, 2008 г.), Международной конференции «Ehrlich II conference, 2nd World Conference on Magic Bullets», посвященной 100-летию вручения Нобелевской премии П. Эрлиху (Нюрнберг, Германия, 2008 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи в реферируемых журналах и тезисы 5 докладов.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 172 страницах и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, 4 глав результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 40 отечественных и 214 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 27 таблицами и 46 рисунками.
Гломерулярная фильтрация белка
Концепция о клубочке как высоко эффективном устройстве для ультрафильтрации, способном фильтровать большие объёмы плазмы и эффективно задерживать белки в кровотоке - один из краеугольных камней почечной физиологии (Smith, 1951; Deen et al., 2001). В ранних исследованиях функций гломерулярного барьера капиллярная стенка клубочка рассматривалась как «чёрный ящик» с определёнными измеряемыми параметрами, и результаты микропункционных и клиренсовых измерений выражали, главным образом, в терминах гидравлической проницаемости и эффективного размера пор фильтра. В начале 1990-х годов стали предприниматься усилия по изучению соотношения функциональных свойств капиллярной стенки клубочков и её уникальных черт строения на клеточном и даже макромолекулярном уровне. Это было достигнуто благодаря объединению результатов морфометрических исследований (Arisz et al., 1977; Venkatachalam, Rennke, 1978), данных, полученных in vitro на изолированных клубочках, и детальных гидродинамических моделей капиллярной стенки (Deen, Satvat, 1981; Edwards et al., 1999; Deen et al., 2001).
Фильтрационный барьер состоит из трех основных компонентов: фенестрированного эндотелия, гломерулярной базальной» мембраны и переплетённых отростков эпителиальных клеток (Arisz et al, 1977; Храйчик и др., 2001; D Amico, Bazzi, 2003; Haraldsson, Sorensson, 2004). Фильтрационный путь - внеклеточный" вода и фильтрующиеся растворенные вещества проходят через фенестры эндотелия, сквозь базальную мембрану и через фильтрационные щели, ограниченные отростками подоцитов (Deen, 2004).
Эндотелий. На внутренней поверхности фильтра, в контакте с кровью, находится фенестрированный эндотелий,» образующий первую линию фильтрационного барьера. Фенестры (отверстия диаметром примерно 70 нм) не пропускают форменные элементы крови, но создают лишь минимальное препятствие для белков плазмы, которые намного мельче- радиусы молекул альбумина и иммуноглобулина G равны соответственно 3.6 нм и 5.5 нм (Шейман, 1999).
Клетки эндотелия покрывает специальная выстилка - гликокаликс, который состоит из отрицательно заряженных сульфатированных протеогликанов и гликопротеидов, а также может включать белки плазмы, такие как орозомукоид. Поверхностную выстилку невозможно выявить при использовании рутинной электронной микроскопии, но при специальных методах фиксации гликокаликс выявляется в виде структуры толщиной около 300 нм (Haraldsson, Sorensson, 2004) Гликокаликс заполняет фенестры и может являться важной детерминантой клубочковой проницаемости (Deen et al., 2001).
Базальная мембрана. Базальная мембрана клубочка имеет толщину 250-400 нм и состоит из нескольких слоев: центральный плотный слой (lamina densa) окружён более тонкими слоями с наружной (lamina гага externa) и внутренней (lamina гага interna) стороны. Собственно базальной мембраной служит lamina densa; наружный и внутренний слои являются гликокаликсом подоцитов и эндотелия. В образовании базальной мембраны участвуют не только подоциты и эндотелий, но и мезангиальные клетки (Rennke, Denker, 2007).
Клубочковая базальная мембрана образована гелеподобным веществом и по объёму содержит 90-93% воды. Её структурная целостность обеспечивается гетерополимерной сетью коллагена IV, ламинина, фибронектина, энтактина, протеогликана (гепаран сульфата) (Deen etal., 2001). Протеогликаны базальной мембраны совместно с сиалопротеинами подоцитов и, в меньшей степени, эндотелия обеспечивают отрицательный заряд базальной мембраны, который является основным барьером для анионных и нейтральных макромолекул (Серов, 2000). Полагают, что клубочковая базальная мембрана имеет свойства вязкого геля, поэтому поры, ограничивающие прохождение через неё макромолекул, не могут быть прямо визуализированы (Farquhar, 2006). Нарушения структуры базальной мембраны клубочка могут приводить к протеинурии. Например, с дефектами цепей коллагена IV связано развитие таких важных клинических синдромов, как синдром Альпорта и синдром Гудпасчера (Шейман, 1999).
Подоциты. Клетки эпителия капсулы, которые покоятся на базальной мембране, носят название подоцитов. Они качественно отличаются от сравнительно простых, уплощённых клеток, которые выстилают оставшуюся часть капсулы Боумена (Вандер, 2000; Asanuma, Mundel, 2003). У подоцита имеется основное тело и большие спрутоподобные отростки, от которых практически перпендикулярно отходят малые отростки, или ножки, покрывающие всю фильтрационную поверхность. Между переплетающимися ножками подоцитов существуют узкие щели 25-30 нм - щелевые диафрагмы, через которые проходит фильтрат (Blantz et al., 1994; Kawachi et a!., 2006). Поверхность отростков подоцитов покрыта отрицательно заряженными сиалогликопротеинами (Шейман, 1999; Наточин, 2000; Серов, 2000).
Наиболее авторитетное исследование ультраструктуры щелевой диафрагмы было выполнено Родевальдом и Карновским (Rodewald, Karnovsky, 1974). Они представили щелевую диафрагму в виде структуры, напоминающей застёжку-молнию, в которой центральный филамент, расположенный параллельно мембранам подоцита, соединяется с этими мембранами перпендикулярными волокнами-мостиками. Эти волокна формируют прямоугольные отверстия размером 4x14 нм с обеих сторон от центрального филамента. Тем не менее, приведённые размеры отверстий в щелевой диафрагме спорны (Deen et al., 2001; D Amico, Bazzi, 2003), так как они плохо согласуются с результатами функциональных измерений. В частности, размеры отверстий позволяют предположить, что прохождение в Боуменово пространство сферических молекул с радиусом 2 нм будет полностью исключено, в то время как на самом деле подобные молекулы проходят через фильтр практически без ограничений (Deen, 2004). Благодаря достижениям электронной томографии было получено более детальное изображение пористой структуры щелевой диафрагмы. Основные черты классической структуры застёжки-молнии подтвердились, но оказалось, что поры в ней имеют разные размеры (Deen, 2004).
Щелевые диафрагмы, перегораживающие фильтрационные щели, по сути, являются специализированными межклеточными контактами и образуются из адгезионных контактов (десмосом) в ходе развития гломерулы (Kawachi et al., 2006). Щелевые диафрагмы состоят из кадгеринов и связанных с ними катенинов и, кроме того, содержат более специализированные белки, такие как нефрин, NEPH1 и NEPH2, и подоцин (Farquhar, 2006). Оказалось, что волокна, составляющие щелевую диафрагму, в основном формируются внеклеточными участками нефрина (Deen, 2004).
Стратегическая позиция щелевой диафрагмы долгое время заставляла предполагать, что она играет главную роль в ограничении прохождения растворённых веществ на основании их молекулярного размера. Так, разрушение щелевых диафрагм может приводить к протеинурии. При нарушении структуры нефрина (например, у пациентов с финским врождённым нефротическим синдромом, вызванным мутацией в гене нефрина) или его отсутствии (у нефрин-нокаутных мышей) правильные структуры щелевой диафрагмы перестают выявляться, и развивается протеинурия (Deen, 2004).
Реабсорбция профильтровавшегося белка
Проксимальный каналец является основным местом реабсорбции профильтровавшегося белка (Pollock, Poronnik, 2007). Нормальная концентрация белка в клубочковом фильтрате составляет 10 мг/л, однако из-за огромного объёма жидкости, фильтрующегося в сутки, в просвет нефрона поступает весьма значительное количество белка. Если данный белок не реабсорбируется, то он весь (около 1.8 г/сут у человека) будет потерян с мочой. В норме почти весь профильтровавшийся белок реабсорбируется, поэтому экскреция его с мочой у человека составляет около 100 мг/сут (Вандер, 2000).
Реабсорбция белка эпителиальными клетками канальцев происходит путём рецептор-опосредованного эндоцитоза (Batuman, Guan, 1997). Этот процесс инициируется связыванием молекул профильтровавшегося белка со специфическими рецепторами на люминальной мембране эпителиальных клеток (Sumpio, Maack, 1982; Вандер, 2000; Gekle, 2005). Рецепторы локализуются в окаймлённых ямках апикальной мембраны, либо мигрируют в ямки после связывания с лигандом (Christensen, Birn, 2001). Вследствие впячивания окаймлённые ямки превращаются в окаймлённые везикулы, которые затем теряют своё клатриновое покрытие, сливаются с другими такими же везикулами и формируют ранние эндосомы. На этом этапе происходит высвобождение рецептора с последующим рециклингом и возвращением на апикальную мембрану. В процессе «созревания» ранние эндосомы мигрируют из апикальной в более глубокие области цитоплазмы, превращаются в поздние эндосомы, которые сливаются с лизосомами и/или с заполненными гидролитическими ферментами везикулами. После различного периода времени, длящегося от минут до дней в зависимости от конкретных особенностей изучаемого белка, абсорбированный белок перестает определяться во вторичных лизосомах (Мааск et al., 1979; Cojocel et al., 1984b). Считается, что лизосомальные ферменты расщепляют белки до низкомолекулярных фрагментов, в большинстве случаев - до отдельных аминокислот. Продукты расщепления затем покидают клетку через базолатеральную мембрану и попадают в интерстициальную жидкость, откуда они проникают в околоканальцевые капилляры (Вандер, 2000). Таким образом, термин реабсорбция в применении к всасыванию белка не совсем точен, поскольку целые белковые молекулы как таковые не попадают из просвета нефрона в околоканальцевые капилляры, а расщепляются внутри клеток (Сагопе et al., 1979). Тем не менее, важно понять, что фильтрующиеся белки практически не экскретируются с мочой, а продукты их гидролиза (аминокислоты) остаются в организме (Goldspink, Kelly, 1984; Вандер, 2000).
Транспортный максимум для белков. Классический подход к оценке максимума канальцевой абсорбции вещества (например, глюкозы и других небольших органических соединений) - это измерение уровня его экскреции с мочой при широком диапазоне концентраций в плазме и выявление той концентрации, при которой вещество начинает появляться в моче. Транспортный максимум для крупных белков, определённый таким образом, был весьма невелик, а для некоторых белков (белок Бенс-Джонса, свободный гемоглобин) достоверно не отличался от нуля, так как даже при низких концентрациях в плазме крови белки появлялись в моче (Maack et al., 1979).
Полноценные эксперименты по изучению транспортного максимума белка (на примере лизоцима куриного яйца) были выполнены на изолированных перфузируемых почках крысы и in vivo на собаках (Maack et al., 1979; Cojocel et al., 1984b). Была получена зависимость между выведением с мочой или канальцевой абсорбцией лизоцима и его фильтрующимся количеством, и выявлены ранее не подозреваемые черты процесса канальцевой абсорбции белков. Во-первых, транспортный максимум для абсорбции лизоцима у собак составил около 1.0-1.5 мг/мин, что в 50-100 раз превышает нормальное фильтрующееся количество эндогенного лизоцима. Во-вторых, несмотря на такую огромную способность к абсорбции, выведение лизоцима с мочой начиналось при близком к нормальному фильтрующемуся количеству белка. Таким образом, для лизоцима наблюдалась большая разница между порогом (концентрацией белка в фильтрате, при которой белок появляется в моче) и транспортным максимумом (концентрацией белка в фильтрате, при которой полностью загружена система реабсорбции). В-третьих, в широком диапазоне фильтрующихся количеств белка (от порога до транспортного максимума) фракция абсорбируемого лизоцима была относительно постоянной и составляла около 50% от его профильтровавшегося количества. Как следствие, фракционный клиренс лизоцима оставался постоянным во всем диапазоне. Таким образом, повышение фильтрующегося количества лизоцима выше порога, но ниже транспортного максимума приводило к параллельному повышению канальцевой абсорбции этого белка и его экскреции с мочой. Результаты этих экспериментов, а позднее и ряда других, привели к заключению, что процесс канальцевой абсорбции белка лучше всего описывается как высокоёмкий (по сравнению с нормальными фильтрующимися количествами) низкоаффинный транспортный процесс (Cojocel etal., 1984а; Park, Maack, 1984).
Ингибиторы реабсорбции белка. Канальцевая абсорбция всех белков, исследованных к настоящему времени, подавляется йод ацетатом и цитохалазином В. Известно, что йод ацетат подавляет эндоцитоз и формирование эндосом в различных клетках, а его ингибирующее действие на абсорбцию белков, возможно, является следствием влияния на продукцию энергии для образования эндосом (Sumpio, Maack, 1982). Цитохалазин В тоже воздействует на эндоцитоз белка, он селективно связывается с сократительными микрофиламентами и вмешивается в их работу. Таким образом, ингибиторы клеточного метаболизма и функционирования микрофиламентов снижают канальцевую абсорбцию белков, вероятно, нарушая процесс формирования эндосом (Sumpio, Maack, 1982).
Основные аминокислоты тоже являются ингибиторами реабсорбции белка в проксимальном канальце (Mogensen et al., 1975; Bello et al., 1999) Первоначально этот эффект был объяснён конкурентным взаимодействием катионных аминокислот и профильтровавшихся белков с отрицательным поверхностным зарядом микроворсинок (Mogensen et al., 1975). Тем не менее, имеющиеся данные позволяют предположить, что механизм ингибирующего действия аминокислот более сложный (Cojocel et al., 1981; Sumpio, Maack, 1982; Narita et al., 1995). Показано, что лизин эффективнее подавляет реабсорбцию белка почкой (Tucker et al., 1993; Mogensen, Soiling, 1977; Mazanti et al., 1988; Thelle et al., 2006), чем аргинин (Mogensen et al., 1975; O Reilly et al., 1986), несмотря на то, что имеет меньший положительный заряд. Лизоцим - это единственный белок, чья канальцевая абсорбция сильнее подавляется аргинином, чем лизином. Возможно, это обусловлено тем, что из всех исследованных белков лизоцим единственный, у которого основная масса катионных участков представлена аргинином, а не лизином (Sumpio, Maack, 1982).
Объекты исследования и серии экспериментов
Крысы. Эксперименты были выполнены на беспородных крысах линии Вистар (Rattus norvegicus var. albino) в возрасте 4-6 месяцев, массой 150-220 г. Все животные находились в виварии на стандартном режиме. Утром за день до эксперимента они, как обычно, получали корм, а в течение последующего времени до проведения опыта им не давали пищи при свободном доступе к воде. Опыты выполнены в соответствии с международными стандартами по работе с экспериментальными животными и одобрены этическим комитетом ИЭФБ РАН.
Для сбора мочи крыс помещали в индивидуальные клетки-пеналы с дном из проволочной сетки и металлических воронок с мерными пробирками. Пробы мочи собирали при произвольных мочеиспусканиях, в протоколе фиксировали время сбора и объём мочи. В ряде экспериментов у крыс собирали одну суммарную пробу мочи за 2 ч.
Забор крови проводили у крыс, наркотизированных эфиром, из общей сонной артерии. После свёртывания кровь центрифугировали при 8000 оборотах в минуту на микроцентрифуге «Hettich Mikro 20» (Andreas Hettich GmbH, Германия) в течение 10 минут, полученную сыворотку использовали для последующих анализов.
Лягушки. Эксперименты выполнены в марте-апреле на самцах травяных лягушек (Rana temporaria) весом 25-35 г. Во время эксперимента лягушки содержались в ёмкости с водой при комнатной температуре. Надавливанием на переднюю брюшную стенку добивались опорожнения мочевого пузыря, после чего накладывали кисетный шов на кожу промежности и перевязывали клоаку. Пробы мочи собирали однократно через 1 ч, для чего снимали лигатуру.
Забор крови осуществляли в конце эксперимента у обездвиженных лягушек из полости сердца. Сыворотку получали, как описано выше. Серии экспериментов
Эксперименты на крысах проводили как на фоне обычного режима, так и при усилении мочеобразования разного типа - осмотическом, водном диурезе или салурезе (Боголепова, Шахматова, 2004).
Осмотический диурез вызывали: 1) введением 50% глицерина в объёме 3.2, 6.4 или 9.6 мл на кг массы тела животного (2, 4 или 6 г/кг глицерина, соответственно) ненаркотизированным крысам через зонд в желудок; 2) инфузией в бедренную вену 40% полиэтиленгликоля-400 (PEG) в объёме 7.5 или 10 мл на кг массы тела крысам, наркотизированным внутрибрюшинным введением 6 мл/кг смеси 0 75% нембутала и 0.37% хлоралозы. Водный диурез создавали введением крысам воды в объёме 50 мл на кг массы тела через зонд в желудок, так как ранее было показано, что такая водная нагрузка блокирует эндогенную секрецию антидиуретического гормона (Camps et al., 1986; Andersen, Keiding, 1988; Chen et al., 2005, Strieker, Hoffmann, 2005). Салурез вызывали внутримышечным введением 1% раствора фуросемида в дозе 0.5 или 1.0 мл на кг массы тела (5 и 10 мг/кг фуросемида, соответственно) или введением 1d-AVT в дозах 0 25, 0.5 или 1.0 мкг на кг массы тела. Контроль Группой контроля послужили животные из вивария, содержащиеся при описанном выше стандартном режиме. Гормоны нейрогипофиза и их аналоги.растворяли в 0.9% растворе NaCI и вводили внутримышечно в дозах 0.25, 0.5 и 1.0 мкг на кг массы тела крысам при обычном питьевом режиме и в дозах 0.01 и 0.001 мкг на кг массы тела одновременно с пероральной водной нагрузкой. Пептидныеантагонисты вазопрессиновых рецепторов растворяли в 0.9% растворе NaCI и вводили в дозе 10 мкг на кг массы тела внутримышечно,за 5 минут до инъекции аналога AVT.
Непептидный антагонист вазопрессиновых рецепторов ОРС-31260 перемешивали с киселем из картофельного крахмала (для приготовления киселя 5 г картофельного крахмала размешивали в 20 мл1 воды при комнатной температуре, а затем добавляли 80 мл кипятка). Полученную смесь с антагонистом в концентрации 3 мг/мл вводили крысам через резиновый зонд в желудок в объёме 5 мл на кг веса (15 мг препарата на кг массы тела).
Эналаприлат вводили внутрибрюшинно в дозе 1.0 и 2.0 мг на-кг массы тела за 30 минут до основного воздействия. L-NAME (50 мг/кг), D-NAME (50 мг/кг), лизин (27 мг/кг), аргинин (32 мг/кг) растворяли в 0.9% растворе NaCI и вводили внутрибрюшинно за 15 минут до основного воздействия.
Оксадиазоло-хиноксалин (ODQ) растворяли в небольшом количестве диметилсульфоксида, а затем полученный маточный раствор в 10 раз разбавляли 0.9% раствором NaCI. Препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 2.0 мг на кг массы тела за 20 минут до инъекции аналога AVT.
Животным соответсвующих контрольных групп вместо перечисленных выше препаратов в/м или в/бр инъецировали растворитель (как правило, 0.9% раствор NaCI) в объёме 1 мл на кг массы тела.
Характеристика обследованных. В обследовании приняли участие 15 практически здоровых добровольцев 16-27 лет (12 женщин, 3 мужчины). В протоколе фиксировали время последнего мочеиспускания перед сном, в течение ночи испытуемые не ели и не пили напитки и воду. Утром собирали первую пробу мочи, после чего участники выпивали кипячёную водопроводную воду в объёме 20 мл на кг массы тела. Пробы мочи собирали при произвольных мочеиспусканиях в течение 2.5 ч после водной нагрузки.
Совместно с к.м.н. Ж.В. Шуцкой обследован 21 подросток с сахарным диабетом I типа (14 мальчиков и 7 девочек) и 10 практически здоровых подростков (4 мальчика и 6 девочек). Пациенты с сахарным диабетом наблюдались в городском диабетологическом центре для детей и подростков ГП №44. Возраст пациентов составил 11-19 лет, длительность основного заболевания - от 5 месяцев до 17 лет. Уровень гликированного гемоглобина варьировал от 5.5 до 14%. Пациенты с сахарным диабетом были разделены на 2 группы по уровню гликированного гемоглобина: 1) больные с декомпенсированным сахарным диабетом - 14 детей; 2) больные с компенсированным сахарным диабетом - 7 детей. В обследование не включали пациентов, имеющих патологию почек, в том числе диабетическую нефропатию. Критерием начинающейся диабетической нефропатии служила микроальбуминурия - 30-300 мг/сут (Mogensen, 1995).
Экскреция белка почкой при разных типах диуреза
У крыс экскреция белка почкой, также как и у человека, достаточно низкая (Kashiwagi et al., 2000). У лабораторных крыс разных линий (Sprague-Dawley, Munich-Wistar, SHR) установлены существенные половые различия в уровне экскреции белка с мочой - у самцов суточная потеря белка выше в 3-10 раз по сравнению с самками (Alt et al., 1980; Remuzzi et al., 1988; Reckelhoff et al., 2000; Ogata et al., 2004). В литературе отсутствовали данные о половых различиях уровня экскреции белка у крыс линии Вистар. Мы сопоставили экскрецию белка и другие функциональные показатели работы почек у самцов и самок крыс линии Вистар в возрасте 4-6 нед. (табл. 1). Для животных был характерен достаточно низкий уровень диуреза - 2.1 ± 1.3 мкл/мин на 100 г массы тела и высокая реабсорбция осмотически свободной воды, то есть в контрольной группе крыс почка функционирует в состоянии антидиуреза под действием эндогенного антидиуретического гормона. У самцов отмечена тенденция к более низкому уровню диуреза, тем не менее, значимых различий в скорости мочеобразования, экскреции осмотически активных веществ, ионов натрия и калия выявлено не было. В обеих группах экскреция белка с мочой была на одинаковом (р 0.05) довольно низком уровне, около 65 мкг/ч на 100 г массы тела.
У самцов возможно попадание в мочу белков из половых путей и усиление вымывания белков внепочечного происхождения при увеличении диуреза, поэтому дальнейшие исследования были проведены на самках.
Действие осмотических диуретиков связано с замедлением реабсорбции веществ в проксимальном канальце. Молекулы осмотического диуретика не всасываются (или всасываются ограниченно) клетками проксимального канальца, вследствие - чего остаются-в канальцевои жидкости и удерживают воду с растворёнными в ней веществами. Так как проксимальный каналец является единственным участком реабсорбции белка, то представляло интерес выяснить влияние осмотических диуретиков на выведение белка почкой у практически здоровых животных.
Выбор в качестве осмотического диуретика PEG позволил использовать этот жидкий полимер для стимуляции мочеотделения без введения больших объёмов жидкости (Наточин, Шахматова, 1970), что требуется при инфузии раствора маннитола. Глицерин вызывает осмотический диурез при пероральном введении (Lorimeretal., 1989).
Введение глицерина и PEG привело к зависимому от дозы повышению диуреза и выведения осмотически активных веществ (табл. 2). Инфузия 40% раствора PEG (7.5 мл/кг) и введение 50% глицерина (6.4 мл/кг) вызвали практически равное увеличение диуреза - в 4-5 раз по сравнению с исходным уровнем.
Салурез характеризуется снижением реабсорбции электролитов (главным образом, ионов натрия) в дистальных отделах нефрона (Reeves, Andreoli, 2008). Развитие салуреза происходит при действии петлевых и тиазидных диуретиков (Okusa, Ellison, 2008). Согласно современным представлениям белки, оставшиеся в канальцевой жидкости, поступающей в дистальные отделы нефрона, уже не подвергаются реабсорбции и без изменений удаляются с мочой. С другой стороны известно, что в толстом восходящем отделе петли Генле происходит секреция белка Тамма-Хорсфалла (Serafini-Cessi et al., 2003). Поэтому представляло интерес оценить выведение белка при развитии салуреза, то есть при. функциональной нагрузке на дистальный отдел нефрона.
Развитие салуреза моделировали введением петлевого диуретика фуросемида. По данным литературы у крыс максимальный диуретический эффект развивается при введении-фуросемида в дозе 10 мг на кг массы тела (Christensen et al., 1987). В табл.3 приведены данные, характеризующие функцию почек крыс после введения 5 и 10 мг/кг фуросемида.
После инъекции 10 мг/кг фуросемида в течение первых 30 мин диурез достиг максимальных значений,1 а затем стал постепенно снижаться до исходного уровня (рис 6). Мочеотделение, вызванное инъекцией фуросемида, по сравнению с контролем за 2 ч опыта возросло в 8.4 раза (табл: 3). Фуросемид значительно увеличил экскрецию осмотически активных веществ, ионов нария и калия (табл. 3), динамика изменений и величина клиренса осмотически активных веществ полностью повторяли изменения диуреза (рис. 6). Одновременно с этим фуросемид усиливал выделение осмотически свободной воды, что было наиболее выражено на максимуме его диуретического и салуретического эффекта (рис. 6). В течение первого часа эксперимента средняя скорость клубочковой фильтрации оставалась на уровне, характерном для контрольной группы, а затем начинала снижаться.
Ранее было показано, что AVT (Гао Цзе, Наточин, 2004) и ряд его аналогов (Наточин и др., 2007; Канашкина и др., 2007) в определённом диапазоне доз подавляют реабсорбцию ионов натрия и калия в почке крыс (Наточин и др., 2008) и вызывают развитие салуреза. Представляло интерес выяснить, измененяется ли выведение белков почкой крыс при салурезе, вызванном не диуретиками (фуросемидом), а одним из наиболее сильных натрийуретических аналогов AVT (1d-AVT). После введения крысам 0.5 мкг/кг 1d-AVT увеличивался диурез в 4-5 раза по сравнению с контролем (табл. 4, рис. 9), что было обусловлено повышением экскреции ионов натрия и калия со связанной с ними водой. 1d-AVT привёл к значительному росту экскреции и клиренса осмотически активных веществ, в то же время он усилил реабсорбцию осмотически свободной воды (рис. 9) и увеличил скорость клубочковой фильтрации (р 0.05).
Для исключения завышения показателя экскреции белка за счёт его вымывания из нижележащих отделов моче выделительной системы при росте диуреза была проведена серия экспериментов с двукратным введением 1 d-AVT. Показано, что при повторном введении 1 d-AVT оказывает менее выраженное салуретическое действие — вторая инъекция препарата вызвала меньший прирост мочеотделения и экскреции ионов натрия с мочой по сравнению с первым введением.
