Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
I 1, Роль воды в организме. Закономерности взаимодействия воды с тканевыми и клеточными структурами 11
! .2. Жидкостные пространства организма. Механизмы обмена внут ренней среды 19
1.3. Проблема гипергидратации организма 34
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 40
2.1. Материал исследования 40
2.2. Методы исследования 42
2.2.1. Определение водных показателей эритроцитов и цельной крови 42
2.2.2. Методы исследования реологических свойств крови и гематологических параметров 44
2.2.3. Биохимические методы исследования крови 47
2.3. Статистическая обработка результатов 48
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 49
3.1. Состояние гидратации, отдельные гематологические, реологические и биохимические показатели цельной крови и эритроцитов в гр\ппе контроля .'. 49
3.2. Состояние гидратации, отдельные гематологические, реологические и биохимические показатели цельной крови и эритроцитов при одно кратном введении 10% водной нагрузки 52
З.З.Состояние гидратации, отдельные гематологические, реологические и биохимические показатели цельной крови и эритроцитов при длительном регулярном введении водной нагрузки 59
ЗАСостояние гидратации, отдельные гематологические, реологические и биохимические показатели цельной крови и эритроцитов при дли тельной водной нагрузке в сочетании с введением десмопрессина 65
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 72
4.1. Состояние водного баланса и реологические свойства крови при однократном введении 10% водной нагрузки 72
4.2. Сосгояние водного баланса и реологические свойства крови при длительном регулярном введении водной нагрузки 79
4.3. Состояние водного баланса и реологические свойства крови при длительном регулярном введении водной нагрузки в сочетании с дес-мопрессином 82
Выводы 90
Литература 92
- Жидкостные пространства организма. Механизмы обмена внут ренней среды
- Методы исследования реологических свойств крови и гематологических параметров
- Состояние гидратации, отдельные гематологические, реологические и биохимические показатели цельной крови и эритроцитов при одно кратном введении 10% водной нагрузки
- Сосгояние водного баланса и реологические свойства крови при длительном регулярном введении водной нагрузки
Введение к работе
Актуальность исследования
Согласно данным литературы, организм млекопитающих в целом и его отдельные системы обладают достаточно большим запасом резервных возможностей препятствующих развитию гипергидратации. Способность почек выводить воду настолько велика, что в норме вызвать патологическое состояние простым вливанием воды в желудок практически невозможно [42, 77]. Однако целый ряд заболеваний, с которыми приходится сталкиваться клиницистам, а также различного рода измененные состояния организма, сопровождаются нарушением почечной экскреции воды и сдвигом водного баланса организма [51, 95, 96, 107, 115]. Задержка воды и снижение осмоляль-ности жидких сред организма приводит к тяжелым, нередко необратимым осложнениям. Гипоосмотическая гипергидратация, является одним из наиболее опасных состояний, связанных с водным дисбалансом, сопровождающаяся увеличением объема циркулирующей крови, снижением концентрации электролитов в плазме и развитием прогрессирующего набухания клеток, особенно опасного для клеток ЦНС [16,102,125]. Нарушение процессов гидратации и изменение водного баланса в тканях организма всегда является весьма серьезной проблемой и решение ее невозможно без анализа адаптационных и компенсаторных механизмов, выяснение которых в клинике затруднено. В связи с этим особый интерес представляют экспериментальные исследования. Водная нагрузка разного объема является широко применяемым тестом при оценке функциональной возможности почек [48, 49, 104, 115], а также при изучении морфо-функциональных изменений, возникающих в ответ на гипергидратацию тканей вне воздействий на их метаболизм патогенных агентов (гипоксия, травма, воспаление и т.д.) как правило, обуславливающих развитие того или иного вида отека [30,32, 102].
Водный баланс организма тесно связан с системой кровообращения. Гемодинамические параметры, состав и свойства крови в микрососудах оп- ределяют не только характер ее течения, по и силы, управляющие переносом воды и веществ через эндотелий капилляров [18, 70]. Одним из важных факторов, существенным образом влияющим на капиллярное гидростатическое давление и на баланс жидкости между микрососудисгым руслом и тканью является вязкость крови [166]. К настоящему времени накоплен значительный объем данных, показывающий важную роль изменения реологических свойств крови как в условиях нормы, так и при наличии патологического процесса в организме [52, 105], Оптимизация текучести крови при воздействии на организм экстремальных условий служит адаптивной реакцией, увеличивающей резервные возможности системы кровообращения и организма в целом [31, 101, 119]. С другой стороны, повышение вязкости крови при патологии приводит к ухудшению ее транспортных возможностей, появлению тканевой гипоксии, метаболическим сдвигам, что в известной степени определяет прогноз и характер течения основного заболевания [36, 64, 136, 176, 211]. Анализ литературных данных показал, что большинство патологических состояний, сопровождающихся значительными нарушениями реологических свойств крови, также сопровождаются существенными сдвигами водного баланса организма.
Другим, не менее важным аспектом проблемы изучения водного гомео-стаза является исследование состояния воды в организме. В настоящее время накоплено большое количество экспериментальных фактов, свидетельствующих об особых свойствах воды в живых объектах. Свободная и связанная вода различаются не только по своим физико-химическим свойствам, но и по физиологическому значению [8, 23, 45]. Однако в литературе имеются лишь немногочисленные сведения о состоянии воды в тканях, о соотношении ее фракций и их роли в норме, и, особенно, при патологии [85, 98, 113]. В этом плане исследование гидратации цельной крови и эритроцитов может иметь особое значение при изменении водного баланса организма. Ото обусловлено, с одной стороны тем, что кровь, как интегрирующая среда организма всегда отражает происходящие в нем изменения [90, 159, 160]. С другой сторо-
7 ны, состояние воды во многом определяет функциональное состояние самой крови и ее клеток, поскольку от степени и характера гидратации будут во многом зависеть их способность выполнять важнейшие физиологические функции, связанные с транспортом кислорода, массопереносом и др. [22,79]
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось комплексное исследование состояния гидратации и реологических свойств крови при экспериментальном изменении водного баланса организма.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
Изучить состояние гидратации цельной крови, ее клеточного сектора, биохимических и реологических характеристик, а также выявить закономерности общей гидратации и изменений в содержании отдельных водных фракций эритроцитов в зависимости от их возраста при срочной реакции организма на однократную водную нагрузку большого объема.
Исследовать влияние длительного регулярного воздействия водной нагрузки большого объема на гематологические, биохимические и реологические свойства крови, а также на динамику общей гидратации и преобразование отдельных водных фракций разных по возрасту эритроцитов.
Выявить особенности изменений свойств цельной крови и эритроцитов под влиянием длительной регулярной водной нагрузки в сочетании с введением - десмопрессина.
4. Проанализировать особенности изменения реологических свойств крови в зависимости от условий введения водной нагрузки.
Научная новизна
Впервые проведено комплексное исследование состояния гидратации цельной крови и эритроцитов при нескольких вариантах изменения водного баланса организма. На основе результатов, полученных с помощью метода
8 динамической десорбции, дана количественная оценка различных форм воды, содержащихся в крови и разделенных по возрасту эритроцитах. Установлены особенности изменения общей гидратации и перераспределения водных фракций молодых, зрелых и старых эритроцитов при гипоосмотических воздействиях разного характера.
Получены новые данные об особенностях реологических перестроек крови в зависимости от условий введения водной нагрузки в организм. Зафиксированы значительные изменения в реологии крови, сопровождающиеся усилением агрегации клеток, повышением содержания фибриногена, повышением вязкости плазмы и снижением гематокритного показателя в условиях напряжения осморегулирующей системы организма, вызванного длительной водной нагрузкой в сочетании с введением - десмопрессина.
Теоретическая и практическая значимость
Проведение сравнительного анализа гидратации эритроцитов в норме и при изменении водного баланса организма с учетом возрастного аспекта представляет важное направление исследований в рамках фундаментальной проблемы взаимодействия воды с биологическими структурами. Полученные в работе данные имеют определенное значение для выяснения механизмов адаптации клеток к различного рода стрессорным воздействиям, а также особенностей адаптационных реакций клеток в зависимости от их функционального состояния и интенсивности обменных процессов.
Разработанный и примененный в работе комплекс экспериментальных ги-пергидратационных воздействий позволяет получить выраженные реакции организма животных, сходные с наблюдаемыми в клинике при ситуациях, связанных с объемными и гипоосмотическими искусственно вызванными сдвигами, а также при различного рода патологиях, сопровождающихся изменениями водно-электролитного баланса, в патогенезе которых значительная роль отводится повышенной концентрации АДГ. Это позволяет исполь- зовать данные экспериментальные модели для изучения адаптационныч и компенсаторных механизмов при подобною рода нарушениях.
Основные положения, выносимые на защиту
При экспериментальном изменении водного баланса организма посредством водной нагрузки эритроциты реагируют не только изменением в содержании общей воды, но и значительным перераспределением водных фракций. Степень изменений зависит от функционального состояния клеток, а также от характера экспериментальных воздействий.
При срочной реакции на однократную водную нагрузку, а также при ее длительном регулярном воздействии с сохранением осморе гули ру юте и способности почек, перестройки реологических свойств крови имеют адаптационное значение с антигипоксической направленностью.
Значительные нарушения реологических свойств крови и их негативное влияние на кислородтранспортную функцию при длительном введении водной нагрузки с исключением процесса мочевыделения из осморегу-ляторных реакций организма посредством введения агониста АДГ являются следствием компенсаторных реакций, в том числе, направленных на предотвращение резких сдвигов водно-электролитного баланса мозга.
Апробация работы
Материалы работы были доложены и обсуждены на: ВТОРОЙ ВСЕРОССИЙСКОЙ НАУЧНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ «Клиническая гемоста-зиология и гемореология в сердечно- сосудистой хирургии» (Москва, 2005); Между нар. конференции «Гемореология в микро- и макроциркуляции» (Ярославль, 2005); 1 Съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005); Международной научной конференции «Актуальные проблемы адаптации организма в норме и патологии» (Ярославль, 2005);.Четвертой Российской конференции (с международным участием) «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005).
10 Объем и структура работы Диссертация изложена на 121 страницах машинописного текста н состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием методов исследования, четырех глав с изложением полученных результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 175 отечественных и 136 зарубежных источников- Работа иллюстрирована 24 таблицами и 17 рисунками.
Жидкостные пространства организма. Механизмы обмена внут ренней среды
Клетка является основной функциональной единицей человеческого организма. Для выполнения специфических физиологических задач клетками необходима устойчивая среда обитания, включая стабильное обеспечение питательными веществами и постоянное выведение продуктов метаболизма. Все жидкости организма являются разбавленными водными растворами различных веществ. Тщательное регулирование количества жидкости способствует сохранению стабильности внутренней среды [16].
В поддержание условий жизнедеятельности клеток в составе многоклеточного организма и обеспечении их разнообразных специфических функций важнейшую роль играет система кровообращения. Обмен между кровью и клетками - строго регулируемый процесс, поскольку в нормальных условиях . его интенсивность должна соответствовать функциональной активности клеточных ансамблей, формирующих рабочие единицы органов. Система микроциркуляции, обеспечивающая условия этого обмена, обычно, как система организменного уровня, имеющая представительства во всех органах [81]. На уровне тканей осуществляется перераспределение потоков крови в капиллярной сети, перенос воды и веществ через стенки обменных сосудов и в среде, которая «омывает» клетки. Эта межклеточная среда представлена, чаще всего, компонентами соединительной ткани, в которой располагаются микрососуды. Соединительная ткань служит универсальным посредником между кровью и клетками, тем более что и сами микрососуды являются компонентами соединительной ткани [81, 143].
Исследование микроциркуляторной гемодинамики должно предусмаї-рнвать ее конечную задачу - обеспечение условий трансмурального переноса воды и веществ через эндотелий капилляров и их доставку к клеткам. Удобной теоретической базой, в рамках которой можно систематизировать весь массив экспериментальных данных и представлений, является так называемая, четырехкомпартментная модель [311]. Ее формулировка включает систему взаимодействующих жидкостных «отсеков» - компартментов, позволяющая анализировать распределение сил (давлений, концентраций), которое определяет эффективность массопереноса между компартментами. В качестве последних обсуждаются, обычно, компартмент крови (плазмы), интерсти-циальное пространство, компартмент лимфы и клеточный компартмент, который обменивается необходимыми веществами и продуктами метаболизма с окружающим клетки интерстицием.
Структура и размеры жидкостных секторов организма, то есть пространств, заполненных жидкостью и разделенных клеточными мембранами, к настоящему времени достаточно хорошо изучены [18]. Принято различать два основных водных сектора - клеточный и неклеточный, подразделяющиеся в свою очередь на подкомпоненты.
Внутриклеточная вода
Внутриклеточная вода составляет 70% всей воды организма [77, 94], и может быть обозначена по отдельным органам: печеночная, мышечная и другие. Прямое измерение содержания внутриклеточной воды в отдельных ор-іанах, а тем более общего содержимого внутриклеточных жидкостей всего тела невозможно. Поэтому об объеме внутриклеточной жидкости принято судить по разности между общим объемом жидкости тела и объемом внекле-шчной жидкости [94].
Для единой трактовки проблемы клеточной воды необходимо учитывать некоторые свойства, присущие всем клеткам. В качестве такого общего свойства можно рассматривать способность клеточных структур образовывать поверхности раздела фаз, которыми богата биологическая система и которые обусловливают наличие компартментов. Свойства жидкости вблизи поверхности изменяются, а их аномалии могут служить тестом на наличие поверхностно измененных жидких слоев, в частности слоев воды [23]. Упорядоченная вода может принимать участие во внутриклеточных процессах, как на уровне ультраструктуры, так и молекулярной организации, облегчая перенос свободных радикалов и протонов в биохимических реакциях [165], участвуя в процессе мышечного сокращения, в частности в скольжении нитей [140], а также в процессах транспорта веществ внутри клетки и через клеточную мембрану [158].
Значительные различия в количественном распределении электролитов между внутри- и внеклеточными жидкостями является основным условием функциональной активности клетки [69]. Во внутриклеточной жидкости более высокие концентрации ионов калия, магния, фосфатов и сульфата, в сравнительно меньших концентрациях присутствуют катионы натрия и кальция. Эти различия поддерживаются вопреки тенденции к выравниванию концентраций и являются необходимым условием метаболической активности клетки. Основную роль в регуляции внутриклеточного объема жидкости и ее химического состава играет клеточная мембрана [28].
Поддержание постоянного объёма внутриклеточной среды на фоне внеклеточных и внутриклеточных колебаний осмотического давления - проблема первостепенной важности, с которой сталкиваются все клетки [118]. Большинство клеток отвечают набуханием или сморщиванием на активацию специфических метаболических и транспортных процессов, которые приводят объём клетки к норме [117]. Вода находится в термодинамическом рав 22 новесии относительно клеточной мембраны. Другими словами, осмотическая концентрация цитоплазматической и внеклеточной жидкости в нормальных условиях равны. Изменение концентрации растворенного вещества в той или иной среде создают осмотический градиент. Поскольку мембрана клетки легко проницаема для воды, создание любого такого градиента немедленно приведет к потоку воды из клетки или в неё, чтобы восстановить нарушенное осмотическое равновесие. Поскольку мембраны клеток животных не могут создавать или поддерживать осмотический градиент, при изменении равновесия клетки либо набухают, либо сморщиваются. На изменения объёма клетки реагируют путем активации механизмов, которые регулируют их объём. Процесс, в результате которого набухшая или сморщенная клетка возвращается к нормальному объёму называется, соответственно, регулируемое уменьшение и регулируемое увеличение объёма [146]. Объём клетки может регулироваться только в результате захвата или выброса осмотически активных веществ. В большинстве своём - это неорганические ионы, например, натрий, калий и хлор, также это могут быть органические молекулы небольшою размера, которые называются органическими осмолитами [217].
Методы исследования реологических свойств крови и гематологических параметров
Разделение эритроцитов по возрасгу
Для разделения эритроцитов на субпополяции молодых, зрелых и старых клеток использовали метод J. Murphy [264], основанный на различии в плотностях эритроцитов разного возраста. Капилляры, заполненные концен-трированной клеточной суспензией центрифугировали в течение 15 минут при 12 OOOg. При разделении исходили из того, что верхняя часть эритроци-тарного столбика (10%) занята менее плотными молодыми эритроцитами. Тот же объем в нижней части приходится на долю старых, более ппотных клеток. Среднюю часть составляют зрелые клетки.
Определение гематокрити о го показателя
Гематокритный показатель (Hct) определяли общепринятым методом: цельной кровью заполняли гематокритные капилляры и цен грифу гировали в течение 7 минут при 12 OOOg. Определение внJкости цельной крови, плазмы и концеїіфііроиан-ных эрнтроцитарных суспензий
Для исследования вязкости цельной крови, плазмы и концентрированных эрнтроцитарных суспензий (концентрированные суспензии получали путем центрифугирования крови в течение 15 минут при lOOOg и тщательного отделения от плазмы) применяли капиллярный вискозиметр, предложенный Copley et al. [207]. Вязкость определялась путем оценки времени тока известного объема жидкости под влиянием приложенного давления в горизонтальном капилляре с радиусом рабочей части порядка 0,3мм и термостатированном при 37С. Особенности конструкции вискозиметра позволяют наблюдать неньютоновское поведение исследуемых образцов крови и клеточных суспензий. Измерения проводили при давлениях 10 (BKi) и 100 (BKi) мм вод. ст. Для расчета вязкости крови использовали формулу [207]:
Используя значения вязкости и гематокритного показателя расчитывали индекс Het/BKt отражающий согласно J. Stoltz [291] реологическую эффективность доставки кислорода к тканям. Определение концентрации гемоглобина цельной крови
Концентрацию гемоглобина цельной крови определяли циапмспемої-лобиновым методом с использованием набора реагентов ООО «Агаг- Мед».
Определение концентрации эритроцитов в крови
Количество эритроцитов в объеме крови определяли с помощью подсчета клеток в камере Горяева.
Расчет средней концентрации гемоглобина в эритроцитах
Величину средней концентрации гемоглобина в эритроцитах рассчитывали из данных концентрации гемоглобина цельной крови НЬ (г/л) и геча-токритного показателя (Hct) по формуле:
Расчет среднего содержания гемоглобина в эритроцитах
Величину среднего содержания гемоглобина в эритроцитах рассчитывали из данных концентрации гемоглобина цельной крови НЬ (г/л) и количества клеток (NROC) по формуле:
ССГЭ=1Г пг Расчет среднего объема эритроцитов
Расчет среднего объема эритроцитов производили по формуле:
Hct Эр= "лГ мкм) где; Hct - объем фракции клеток л/л, Ньс - количество эритроцитов. Определение степени аїрегации эритроцитов
Степень агрегации эритроцитов определяли с помощью автоматического агрегометра эритроцитов типа МА 1, разработанного на основе метода И. Schmid-Schonbein (Myrenne, Германия).
Измерение проводили после регулировки прибора (оценка собственного светопропускания блока вращающийся конус - неподвижная плоскость). Образец крови (20 мкл) подвергали вращению со скоростью сдвига 600 с . После остановки степень агрегации определялась автоматически для двух интервалов времени - 5 и Юс. Затем степень агрегации определяли при низкой скорости сдвига Зс"1 для тех же интервалов времени.
Определение содержания общего белка плазмы крови
Содержание общего белка плазмы крови определяли биуретовым методом с использованием набора реагентов ООО «Агат - Мед»,
Определение содержания альбумина плазмы крови
Содержание альбумина плазмы крови определяли по реакции с бром-крезоловым зеленым с использованием набора реагентов ООО «Агат - Мед».
Определение содержания фибриногена плазмы крови
Для оценки содержание фибриногена плазмы использовали метод Рут-берга [134]. Принцип метода заключается в свертывании известного объема цитратной плазмы раствором хлорида кальция с последующим взвешиванием сгустка. При взвешивании использовали весы типа R160P (Sartorius, Германия). Определение концентрации натрия плазмы крови
Концентрацию натрия плазмы крови определяли колориметрическим методом с использованием набора реагентов ООО «Ольвекс Диагностик)м» [69].
Определение содержания гликозаминогликанов в сьшороіке крови
Для определения содержания гликозаминогликанов в сыворотке крови использовали реакцию с карбазолом [53]. В ходе определения сыворотку предварительно депротеинизировали хлорной кислотой в конечной концентрации 0,62 моль/л. Осаждение гликозаминогликанов проводили фосфорно-вольфрамовой кислотой в конечной концентрации 1,27%.
Состояние гидратации, отдельные гематологические, реологические и биохимические показатели цельной крови и эритроцитов при одно кратном введении 10% водной нагрузки
Сосгояние водного баланса и реологические свойства крови при длительном регулярном введении водной нагрузки
Исследование состава и свойств периферической крови крыс выявило достаточно выраженные изменения при данном экспериментальном воздействии, состоящие в падении гематокрити ого показателя, снижении концентрации гемоглобина и эритроцитов. Отмечены также качественные изменения эритроцитов, а именно изменение их среднего объема и средней концентрации гемоглобина (Табл. 7).Результатом разведения плазмы при введении водной нагрузки стало значительное снижение концентраций общего белка. Отмечено резкое снижение величины осмоляльности плазмы (Табл. 8).Анализ виекозимегрических данных выявил закономерное снижение величин вязкости плазмы. Отмечено значительное снижение величин вязкости цельной крови как при высоких, так и при низких напряжениях сдвига. Вязкость концентрированных эритроцитарных суспензий различий с группой интактных животных различий не имела. Выявлено статистически шачимое повышение индекса Het/BKtj характеризующего реологическую эффективность доставки кислорода в ткани. (Табл. 9).
При исследовании способности эритроцитов к агрегации особых различий с группой контроля не выявлено. Исключение составляет некоторое повышение агрегатообразования при высокой скорости сдвига и времени экспозиции равном 10с (Табл. 10).
Изучение водного баланса разных по возрасту популяций эритроцитов позволило установить некоторые особенности гидратации клеток в контроле и при экспериментальном воздействии в процессе старения. В целом, отмечена выраженная возрастная дегидратация клеток, сохраняющаяся и в группе экспериментальных животных. Возрастная зависимость отмечена также и в содержании разных по степени связанности водных фракций. При экспериментальном воздействии степень изменения содержания общей воды была неодинакова у молодых, зрелых и старых эритроцитов. При анализе содержания водных фракций наблюдалось выраженное увеличение степени связанности воды у всех возрастных популяций.
При длительном введении водной нагрузки со стороны периферической крови были отмечены особенности изменений по сравнению с первым вариантом экспериментальных воздействий. Снижение гематокритного показателя в данном случае, обусловлено, не снижением концентрации клеток, а изменением их объема. В свою очередь, уменьшение объема клеток стало причиной повышения средней концентрации гемоглобина в эритроцитах. В величине среднего содержания гемоглобина достоверных различий не выявлено (Табл. 13). Анализ биохимических показателей крови выявил повышение содержания белков и значительное возрастание величины осмолярности плазмы (Табл. 14).При анализе данных вискозиметрии также, как и при первом варианте нагрузки, отмечено значительное снижение вязкостных характеристик, несмотря на противоположную направленность концентрационных изменений плазмы, качественных характеристик эритроцитов, а также некоторое возрастание показателей агрегации (Табл. 16). Следствием выявленных реологических перестроек стало заметное повышение индекса Het/BK, характеризующего реологическую эффективность доставки кислорода в ткани (Табл. 15).
