Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Антитела к эндогенным соединениям и их физиологическая роль 9
1.2 Содержание и роль аутоантител при патологии 13
1.2.1 Содержание и роль аутоантител при аутоиммунной патологии 13
1.2.2 Содержание и роль аутоантител при заболеваниях неаутоиммунной природы 21
1.3 Факторы, влияющие на содержание аутоантител 29
1.3.1 Содержание аутоантител в зависимости от пола и физиологического состояния организма 29
1.3.2 Влияние факторов внешней среды на содержание аутоантител 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 39
2.1 Общая характеристика обследованных лиц 39
2.2. Методы исследования показателей иммунного гомеостаза и математической обработки результатов 43
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 52
3.1 Содержание аутоантител и особенности иммунологической реактивности у практически здоровых людей 52
3.2 Содержание аутоантител и особенности иммунологической реактивности у больных 69
3.3 Взаимосвязи изучаемых аутоантител с иммунологическими показателями периферической крови 94
Заключение 110
Выводы 123
Практические рекомендации 124
Список литературы 125
Приложение 148
- Антитела к эндогенным соединениям и их физиологическая роль
- Содержание аутоантител в зависимости от пола и физиологического состояния организма
- Методы исследования показателей иммунного гомеостаза и математической обработки результатов
- Содержание аутоантител и особенности иммунологической реактивности у практически здоровых людей
Введение к работе
Актуальность исследования. Изучение аутоантител является актуальной задачей современной иммунологии. Несмотря на то, что антитела к эндогенным антигенам известны уже давно [26,159,192], долгое время обнаружение в сыворотке антител к собственным структурам организма считалось признаком аутоиммунного расстройства.
Многочисленные данные литературы о наличии аутоантител и их концентрациях касаются преимущественно материалов обследования больных аутоиммунными заболеваниями. Они свидетельствуют о довольно широких пределах частоты выявления аутоантител при наличии явно выраженных проявлений аутоиммунных процессов [32,42,79,80,82,83,95,180]. Появление аутоантител в большинстве случаев рассматривается как срыв в работе механизмов, ответственных в норме за иммунологическую толерантность к аутологичным структурам. Вместе с тем установлено, что наличие в организме аутоантител не является фактором, достаточным для запуска аутоиммунного процесса [34,38,100,115,165]. Появляются отдельные сведения о нарастании уровня некоторых аутоантител при онкологических, инфекционных, аллергических заболеваниях [13,33,60,113,125,141,152, 189,217] и приема лекарственных препаратов [23,146]. Научные публикации, касающиеся исследований содержания аутоантител у практически здоровых людей, немногочисленны и носят предположительный характер. Показано увеличение содержания аутоантител при стрессе, физических нагрузках, перегрузках, в период полового созревания, при нормальном течении беременности и при климаксе, при воздействии малых доз радиации [12,37,38,39,52,53,68,108]. Вопрос о разграничении нормы и патологии содержания аутоантител, их спектра и концентраций остается открытым; физиологическая роль аутоантител в регуляции гомеостаза не установлена.
Все вышеизложенное определило цель и задачи настоящего исследования.
5 Цель и задачи исследования. Цель работы - установить содержание и
физиологическую значимость аутоантител в регуляции иммунного гомеостаза
у жителей Севера Европейской территории РФ.
Для достижения поставленной цели определены следующие задачи:
Установить содержание и частоту регистрации повышенных уровней аутоантител (аутоантител к двухспиральной ДНК, нуклеопротеидам, тромбоцитам, аутогемагглютинины, аутолейкоагглютинины) у практически здоровых жителей Севера Европейской территории РФ.
Изучить зависимость частоты выявления и концентрации аутоантител в сыворотке крови практически здоровых лиц от сезона года.
Определить различия в содержании изучаемых в работе аутоантител от возраста и пола.
Выявить особенности иммунологической реактивности формирования аутосенсибилизации.
Положения, выносимые на защиту.
1. У жителей Севера Европейской территории РФ определяется
широкий спектр аутоантител различной специфичности, регистрируется более
высокий уровень средних концентраций и частота повышенного их
содержания.
2. Средние концентрации и частота регистрации аномально высоких
концентраций аутоантител нарастают в зимний период с периода
биологических сумерек в ноябре, достигая максимума в феврале, и снижаются
в мае, в период восстановления естественной солнечной активности.
3. Уровень содержания и частота регистрации повышенных
концентраций аутоантител увеличивается с возрастом, наиболее значимое
нарастание содержания аутоантител регистрируется с 60 лет вне зависимости
от пола.
4. Повышение уровня аутоантител выше пределов нормального
содержания происходит на фоне реакций со стороны провоспалительных
цитокинов и подавления процессов активизации, дифференцировки и апоптоза иммунокомпетентных клеток.
5. Регуляторная роль аутоантител по элиминации устаревших клеток и продуктов их распада осуществляется с активизацией системы комплемента, а также пролиферации и дифференцировки системы моноцитов.
Научная новизна исследования. Впервые установлен спектр, содержание и частота регистрации повышенных концентраций аутоантител по специфичности у жителей Севера Европейской территории РФ. Определена зависимость содержания аутоантител от сезона и фотопериодичности, выявлено повышение концентраций аутоантител в период окончания биологических сумерек. Впервые установлена возрастная динамика содержания и спектра аутоантител. Выявлено, что повышение уровней и раширение спектра содержания аутоантител происходит при подавлении уровня Т- и В-клеточной пролиферации и дифференцировки. Впервые дана сравнительная характеристика содержания аутоантител у практически здоровых лиц и лиц с аутоиммунной патологией, аллергическими, онкологическими, хроническими воспалительными заболеваниями и в раннем послеоперационном периоде.
Впервые установлен механизм участия аутоантител в процессах утилизации продуктов некробиоза за счет активации системы комплемента классическим и альтернативным путем, а также пролиферации и дифференцировки моноцитов.
Научно-практическая значимость исследования. Установленные физиологические пределы содержания различных по специфичности аутоантител, могут быть использованы для оценки результатов исследования и дифференциальной диагностики аутоиммунных процессов.
Полученные сведения о весенне-осеннем сезонном изменении уровня аутоантител являются основанием для организации лечебно-профилактических мероприятий по профилактике экологически зависимых иммунодефицитов, сезонных обострений заболеваний на основе сорбционной
7 терапии и стимуляции процессов дифференцировки иммунокомпетентных
клеток.
Выявленные взаимосвязи между содержанием аутоантител и ЦИК могут быть использованы в качестве скринингового диагностического критерия аутосенсибилизации.
Полученные данные могут быть использованы в научных исследованиях в области иммунологии, экологической медицины, клинической медицины, при решении вопросов экологического районирования, а также - в учебном процессе медицинских академий или университетов на кафедрах биологии, микробиологии с курсом иммунологии, клинической иммунологии, внутренних болезней.
Результаты исследования используются врачами медицинской компании «Биокор» при проведении дифференциальной диагностики заболеваний и в качестве критерия эффективности лечебно-профилактических мероприятий (акт внедрения от 20.04.2004г.).
Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004г); II Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергологии (Москва, 14 - 17 мая, 2004 г.); на III съезде иммунологов России (Екатеринбург, 31 мая - 4 июня, 2004 г.); на симпозиуме с международным участием «Проблемы адаптации человека к экологическим и социальным условиям Севера» (Сыктывкар, 1- 3 июня, 2004 г.); на XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова, (Екатеринбург, 19 — 24 сентября, 2004 г.); доложены на VIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2004» (Санкт-Петербург, 27-30 сентября 2004 г.).
Данная работа выполнена в Институте физиологии природных адаптации УрО РАН (г. Архангельск) в соответствии с планом НИР (номер государственной регистрации 01.2.00101811).
По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.
8 Структура и объём работы. Диссертация изложена на 149 страницах
машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и
практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 35 таблицами и 15
рисунками, включает 2 приложения. Библиография содержит 113
отечественных и 107 зарубежных публикаций.
Антитела к эндогенным соединениям и их физиологическая роль
Несмотря на то, что антитела к эндогенным антигенам известны уже давно, долгое время обнаружение в сыворотке антител к собственным структурам организма считалось признаком аутоиммунного расстройства. Однако с развитием различных иммунологических методов выявления аутоантител, наиболее чувствительный и употребимый из которых твердофазный иммуноферментный анализ, а также благодаря использованию аффинной хроматографии для обогащения специфических антител в нормальных сыворотках человека и животных были обнаружены антитела практически ко всем группам эндогенных антигенов. Исследования последних лет показывают, что любое воздействие на организм, сопровождаемое изменением содержания эндогенных медиаторов, вызывает увеличение содержания антител к данным соединениям [66,88,159,192].
Все многообразие известных в настоящее время аутоантител условно можно разделить на 3 группы. Первую группу составляют антитела, которые содержаться в относительно высокой концентрации в нормальной сыворотке и могут быть легко выявлены без предварительного обогащения. Эти антитела обладают, как правило, узкой специфичностью и способны различать близкие по структуре детерминанты, например углеводные маркеры групп крови. Антитела данной группы представлены преимущественно IgM. К ним можно отнести изоагглютинины, антиэритроцитарные антитела [49], антитела к аутологичным IgG [155] и IgA [174].
Для антител второй группы характерны невысокое содержание в сыворотке и полиспецифичность. Выявление их стало возможным главным образом с развитием иммуноферментных методов. Круг этих антител достаточно широк и постоянно растет в результате исследований последних лет. К настоящему времени описано около 200 аутоантител. Обнаружены антитела как к высокомолекулярным антигенам, например ДНК [181,204], к нуклеотидам [126,187], белкам цитоскелета [213], сывороточному альбумину [77], мембранным белкам (например, цитохрому С) [158], к белкам сыворотки крови [158,202], ферментам [122,151,203], гормонам [133,172,196,213], рецепторам [132,135,169], пептидам [116,167], так и низкомолекулярным соединениям (например, фосфолипидам, фосфотидной кислоте, серотонину, ганглиозидам, динитрофенолу) [131,185,207]. К третьей группе относятся антиидиотипические антитела. Необходимо отметить, что в настоящее время исследования антител к эндогенным соединениям в основном развиваются в двух направлениях. Одно из них связано с выявлением повышенных концентраций аутоантител, проявляющих патогенное действие при различных аутоиммунных расстройствах [10,83,90,100,158,117]. Другое направление касается непосредственно изучения естественных, или природных аутоантител в норме и при различных заболеваниях, не относящихся к аутоиммунным, и характеризующихся прежде всего нарушением метаболизма соответствующего аутоантигена [63,77,85,88,96,121]. Они отличаются от аутоантител, ассоциированных с аутоиммунными заболеваниями своей полиреактивностью, более низкой авидностью к аутоантигенам, принадлежат, как правило, к IgM - изотопу и кодируются немутировавшими зародышевыми V-генами. Такого рода аутоантитела, рассматриваются рядом исследователей как ранний предвестник аутоиммунных нарушений, сохраняющий на определенном промежутке времени своего рода «нейтралитет», необходимый для сохранения равновесия между состоянием здоровья и аутоиммунной патологией [100,115,184,214]. В тоже время авторы не отрицают, что повышенное содержание таких аутоантител может явиться одним из признаков аутоиммунного заболевания [156,216]. Так, считают, что аутоантитела к ДНК и фосфолипидам при СКВ являются аутоантителами, что отражает патологическую природу таких аутоантител в отличие от естественных антител к ДНК и фосфолипидам, обнаруживаемых у здоровых лиц [78]. Как видно деление такого рода очень условно. Существующие мнения, что следует различать естественные или природные, нормальные или защитные антитела, свободные и скрытые, агрессоры и свидетели, что патологическое значение имеют только термостабильные аутоантитела, не однозначны [3,77,88,90,96,107]. Исследования, проведенные в отделе экологической иммунологии ИФПА УроРАН проф. Л.К.Добродеевой не установили какие-либо различия свойств антител в зависимости от вида и условий постановки реакций. При этом установлено, что влияние аутоантител определяется, в первую очередь, их излишней концентрацией [39]. Установлено, что превышение физиологического барьера содержания аутоантител приводит к повреждению аналогичных структур путем антителозависимого лизиса, который в свою очередь вызывает каскад реакций различного воспалительного характера. Изменение границ толерантности к своим собственным структурам вне зависимости от механизмов формирования этого процесса ведет к последствиям, именуемым аутоиммунными [37,39,82,140]. Расширение предела физиологического отклонения делает грань между физиологической реакцией и патологией хрупкой, прозрачной. Чем дальше заходит процесс, тем выше концентрация аутоантител, тем шире и разнообразнее их спектр [35,38].
Один из аспектов вопроса о физиологической роли антител были подробно освещены С. Бойденом еще в 1966 году [137]. Автор рассматривал их как «узнающие факторы». Считают, что функция первичного узнавания следует из самой природы антител. Опосредованное первичное узнавание является эффекторной функцией создания барьера на пути чужеродных агентов, прежде всего бактерий и вирусов: антителозависимый лизис, осуществляемый киллерами или системой комплемента, вирус-нейтрализация, опсонизация и активация компонентов комплемента, вызывающих положительный хемотаксис макрофагов. В то же время первичное узнавание квалифицируют и как индукторную функцию, поскольку осуществление перечисленных выше эффекторных функций необходимо главным образом для стимуляции макрофагальной активности по отношению к чужеродным антигенам и индукции «вторичного» узнавания, т.е. собственного иммунного ответа [34,170,208]. Еще в I960 году П.Грабар высказал мнение [26,159], которое поддерживается и другими исследователями [34,82,83,89,115], о том, что аутоантитела способствуют связыванию и удалению из организма продуктов клеточного метаболизма, и что аутоантитела имеют широкое значение как белки, транспортирующие любые метаболиты. Представление о роли аутоантител в выведении из организма стареющих, балластных белков было подтверждено обнаружением естественных анти-альбуминовых антител [202], а также аутоантител к гликозилированному альбумину [40], поскольку известно, что увеличение гликозилирования белков отражает процесс их старения [77].
Не исключают, что аутоантитела, обнаруживаемые в норме, могут играть гомеостатическую функцию (например, обнаружение аутоантител к Т3-трийодтиронину у лиц с бессимптомным увеличением щитовидной железы, или антитела к фосфолипидам, которые были выявлены и в нормальных сыворотках) [ 186,207].
Таким образом, выделяют следующие функции аутоантител: первичного узнавания, патогенетическую и гомеостатическую [34,77,137,159,207,202]. Предполагают, что потенциально аутоантитела могут выполнять все 3 функции, но в зависимости от физиологического состояния организма и изменения его антигенного состава проявляется преимущественно одна из них. Кроме того, разные виды аутоантител (по специфичности, принадлежности к классам иммуноглобулинов) могут различаться и видом функциональной активности [64].
Содержание аутоантител в зависимости от пола и физиологического состояния организма
организма В организме всегда есть клетки, вырабатывающие антитела [26,34]. Известно, что уровень содержания аутоантител может колебаться в широких пределах и зависеть от физиологических состояний организма. Показано увеличение содержания аутоантител при стрессе, физических нагрузках, перегрузках [50,106,107], в период полового созревания, беременности, климаксе [12,34,37,61,68]. В литературе имеются единичные сведения, что в различные периоды онтогенеза в сыворотке крови у здоровых людей наблюдается повышение уровня содержания аутоантител в раннем возрасте от 1 до 10 лет [51,176]. Ряд авторов отмечается повышение уровня аутоантител к собственным антигенам у женщин при беременности, в послеродовом периоде и у их новорожденных детей, а также детей грудного возраста [51,176]. Недавние исследования, проведенные в Казанском университете, выявили достоверное повышение уровня содержания аутоантител к РНК в сыворотках крови женщин на сроке беременности 20-40 недель (1,55±0,13отн.ед.), рожениц, резус изоиммунизированных (1,60±0,12отн ед.), а также повышение аутоантител к двухспиральной ДНК в сыворотке крови новорожденных детей (2,28±0,96 и 1,66±0,17отн.ед.), по сравнению с группой здоровых взрослых доноров [12].
Обследование в возрастной динамике 1240 детей, родившихся и постоянно живущих на Севере, выявило возрастную динамику повышенных уровней аутоантител [37,38]. Постепенное (с возрастом) накопление высоких, больше чем в норме, аутогемагглютининов и лейкоагглютининов 3,48±0,11% касается младшей возрастной группы (5-6 лет), 5,62±0,13% детей 10-12 лет и выше у подростков (10-14 лет) 17,57±0,18% (р 0,01) [39]. Показанная динамика дает четкое представление об активизации аутосенсибилизации в подростковом периоде.
В нескольких популяционных исследованиях было показано, что в старших возрастных группах повышается число случаев выявления наиболее распространенных аутоантител (антител к тиреоглобулину и антигену париетальных клеток, антинуклеарных антител) [56,72,165]. Причем наибольшее содержание аутоантител отмечалось у пожилых людей старше 60 лет и уменьшалось на седьмой декаде жизни, что объясняли более высокой смертность тех, у кого содержание аутоантител было повышено [165]. В возрасте до 60 лет отмечалось повышение частоты антинуклеарных аутоантител в группе носителей аутоантител к тканям щитовидной железы и желудка. Зависимость частоты появления аутоантител от возраста объясняют результатом эндогенных возрастных изменений иммунной системы и/или результатом кумуляции влияния вредных факторов внешней среды на протяжении жизни [56,69]. Существуют ряд гипотез о том, что начало старения связано с иммунной недостаточностью [69], которая предполагает, что старение является последствием каскада событий, начавшихся с инволюции тимуса [130]. Другие исследователи полагают, что у пожилых людей нарушается механизм апоптоза лимфоцитов, в результате этого активированные лимфоциты и клетки памяти не уничтожаются, тогда как заселение иммунной системы недифференцированными лимфоцитами блокируется [216]. R.Attanasio с соавт. на модели у здоровых бабуинов в возрасте, соответствующем половине жизненного цикла данных животных, показали, что продукция антиядерных антител, антиклеточных антител и естественных аутоантител постепенно и значительно возрастает с возрастом, без увеличения концентрации сывороточных иммуноглобулинов или уровней избирательных маркеров иммунной дисрегуляции, т.е. в отсутствие распознаваемых патологических состояний стареющей иммунной системы [119]. По данным А.А. Зайнуллина с соавторами, при исследовании аутоантител к нуклеиновым кислотам в возрастной группе 16-60 лет, не обнаружено различий от генеральной совокупности ни в одной возрастной группе. Установлено также, что резус принадлежность и различия в группах крови не влияют на уровень содержания аутоантител к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых людей [12].
Большая часть аутоиммунных заболеваний поражает женшин: соотношение 2:1 для рассеянного склероза, 3:1 для ревматоидного артрита и 9:1 для системной красной волчанки. К иммунологическим причинам, приводящим к такой диспропорции, относят субпопуляции Т-хелперов ТН1 и ТН2, уровень гуморального ответа на антигены, половые гормоны, гормоны желез внутренней секреции, беременность, генетические факторы, сцепленные с ГКГС [218]. Так показано, что частота обнаружения антиядерных антител (АЯА) у здоровых людей зависит от пола и возраста. У лиц моложе 40 лет АЯА выявляются в 1-3% случаев, а у лиц старше 60 лет — в 16-25% случаев. У женщин АЯА выявляются в среднем в 5 раз чаще, чем у мужчин. Частота выявления АЯА также существенно повышается у родственников больных аутоиммунными заболеваниями - 9-51% [80]. Однако, исследования содержания аутоантител к основному белку миелина, аутоантител к РНК, тромбоцитам, ряду органоспецифических атоантител не выявили половых различий [148,170,218].
Антинуклеарные аутоантитела во всех возрастных группах чаще встречаются у курящих мужчин, чем у бросивших курить, а у бывших курильщиков чаще, чем у тех, кто никогда не курил [56]. В зарубежной литературе практически нет данных об уровнях содержания аутоантител в сыворотках здоровых людей в популяции. В отечественной литературе представлены данные А.А.Зайнуллина с соавт., исследовавших пороговые уровни содержания аутоантител к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых доноров Татарстана. Уровень содержания аутоантител к ДНК находится в пределах 0,53-2,20отн.ед., средний уровень составляет 1,00±0,02отн.ед., среднее содержание аутоантител к РНК составляет 0,95±0,01отн.ед. При этом у 35% здоровых доноров обнаружен высокий уровень содержания аутоантител к нативной ДНК, у 42% к двухспиральной ДНК и у 14% - аутоантитела к РНК [12]. Содержание аутоантител к двухспиральной ДНК у здоровых доноров, по данным О.Н.Панченко с соавторами, по IgM составляет - 0,69±0,07отн.ед., по IgG 0,85±0,06отн.ед [88]. Частота положительных реакций, выявляющих антитела к двухспиральной ДНК у здоровых мужчин в возрасте 41-60лет, жителей г.Архангельска, составила 26,44±4,76%, аутоантител к кардиолипину 17,05±4,01%, которые сопровождались повышенными концентрациями ЦИК (8,96%), TNF-a (26,14%), IL-2 (31,32%) [54]. В.Б.Гервазиева с соавт. исследовали содержание IgG-антител к основному белку миелина (ОБМ) в 450 сыворотках здоровых людей от 6 месяцев до 70 лет. Антитела выявлены в 64% сывороток, средний уровень при этом составил 23,3±7,5мкг/мл и не превышал нормативных содержаний. При анализе возрастной динамики была выявлена тенденция к повышению уровня аутоантител с возрастом, что позволило выделить две возрастные группы с достоверно различающимся содержанием IgG-антитела к ОБМ. В первой группе (лица от 5 месяцев до Плет) уровень аутоантител составил 16,7±1,5мкг/мл, во второй группе (от 12 до 70 лет) - 29,9±3,0мкг/мл [24].
Методы исследования показателей иммунного гомеостаза и математической обработки результатов
Определение показателей иммунного гомеостаза проведено в лаборатории экологической иммунологии (завлабораторией - д.м.н., профессор Л.К. Добродеева) института физиологии природных адаптации УрО РАН г.Архангельска.
Комплекс иммунологического обследования включал: - определение лейкоцитограммы (абсолютного и относительного содержания в периферической крови лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов, эозинофилов); - исследование лимфоцитов: определяли фенотипы Т-лимфоцитов и В лимфоцитов, лимфоциты с рецептором СД5+ (общая популяция Т лимфоцитов), СДЗ+ (зрелые Т-лимфоциты), СД4+ (хелперы, индукторы), СД8+ (цитотоксические Т-лимфоциты), СД7+ (клетки с рецепторами, отражающими лимфопролиферацию), СД16+ (естественные киллеры), СД25+ (Т-лимфоциты с рецепторами к интерлейкину-2), CD 23+ (рецептор активированных В лимфоцитов, рецептор для IgE), СД71+ (Т-лимфоциты с рецептором к трансферрину), HLA DR+ (Т-лимфоциты, активированные через рецептор к сублокусу Главного комплекса гистосовместимости класса II), СД95+(клетки с рецепторами к фактору некроза опухоли, отражающие процессы апаптоза), СД22+(В-лимфоциты). Исследовали лимфоцитограмму: процентное содержание малых, средних, и больших лимфоцитов, функциональную способность лимфоцитов в реакции бласттрансформации (спонтанной, индуцированной ФГА и коканавалином); - исследование моноцитов: определяли моноцитограмму (процентное содержание промоноцитов, моноцитов и полиморфноядерных клеток), индекс пролиферации и дифференцировки моноцитов; - исследование нейтрофильных лейкоцитов: определяли фагоцитирующую способность нейтрофилов; - исследование белков сыворотки крови: определяли белки системы комплемента (СЗ,С4), пропердин - фактор В; транспортные белки и белки острой фазы трансферрин, церулоплазмин; - определение содержания некоторых цитокинов: интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2 (IL-2), фактор некроза опухолей - альфа (TNFa); - определение содержания раково-эмбрионального антигена (РЭА); -определение содержания сывороточных иммуноглобулинов А, М, G, Е и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК); - определение уровней аутоантител к двуспиральной ДНК, нуклеопротеидам, к тромбоцитам, аутогемагглютининов, аутолейкоагглютининов. Кровь у исследуемых лиц бралась из локтевой вены (10 мл) утром, 9-10 часов утра, натощак. Для определения содержания лейкоцитов крови стерильным стеклянным капилляром набирали 0,008 мл крови и смешивали её с 0,1 мл 10% раствора уксусной кислоты, полученную взвесь тщательно перемешивали и заполняли камеру Горяева. Подсчитывали общее количество лейкоцитов с применением объектива х20 и окуляра х7 в 20 больших квадратах камеры Горяева и определяли по формуле абсолютное содержание клеток в 1 мл крови. Количество клеток лейкоцитограммы (лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов, эозинофилов) подсчитывали в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе при иммерсионном увеличении объектива х90 и окуляра х7. Для регистрации клеток использовали клавишные лабораторные счётчики. Производили подсчёт 100 клеток. Данные анализа лейкоформулы выражали в процентах. Абсолютное содержание клеток лейкоцитограммы определяли подсчётом процентного содержания от общего количества лимфоцитов. Для получения лейкоцитарной взвеси 5-10 мл венозной крови, взятой в асептических условиях в пробирку с гепарином из расчёта 20 ЕД на 1,0 мл крови, выдерживали при комнатной температуре в течение 1,5 часов для оседания эритроцитов, после чего плазму с элементами белой крови отсасывали в стерильную пробирку и центрифугировали 5 минут при 1000 об. в минуту. Надосадочную жидкость удаляли и вместо неё наливали раствор Хенкса без ионов кальция и магния в том же объёме. После смывания со дна и стенок пробирки проводили дважды дополнительное центрифугирование отмытых форм. Осадок клеток ресуспензировали в среде 199 с 10% бычьей сывороткой. Получение отдельных популяций лейкоцитов основано на различиях удельной массы лейкоцитов разных популяций. В качестве градиента плотности использовали водный раствор фикола с добавление верографина. Принцип метода состоит в том, что суспензию клеток помещают сверху градиента и центрифугируют. В результате те клетки, которые имеют плотность больше, чем градиент, проходят через него и скапливаются на дне пробирки, в то время как все остальные остаются над градиентом. Использование градиента позволяет разделять сумму лейкоцитов на отдельные популяции: моноцитоядерные клетки и гранулоциты.
Субпопуляции лимфоцитов определяли методом непрямой иммунопероксидазной реакции с применением моноклональных антител (НПЦ МедБиоСпектр г. Москва). Выделение мононуклеаров из периферической крови производили по методу А.Воушп [138]. После выделения в градиенте фикол-верогафин 0,5 мл лейкоцитов наносили каплю на предметное стекло и помещали на 20 мин. в холодильник при t =40С. По завершении инкубации остатки жидкости высушивали при комнатной температуре. На высушенную каплю наносили 20 мкл 3% раствора перекиси водорода на 10 мин для блокады эндогенной пероксидазы. Каплю промывали 5 раз в 100 мкл физиологического раствора и наносили 20 мкл хорошо перемешанного раствора моноклональных антител, инкубировали в течение часа при комнатной температуре под чашкой Петри на влажной бумаге. Промывали препараты 5 раз в 100 мкл физиологического раствора и наносили 20 мкл хорошо перемешанного пероксидазного конъюгата, инкубировали до появления коричневого окрашивания при комнатной температуре. Ядра клеток докрашивали гематоксилином или раствором бриллиантового зелёного. После высушивания образцов добавляли 20 мкл 50% глицерина и считали число клеток с коричневой зернистостью при объективе х90 окуляре хЮ.
Содержание аутоантител и особенности иммунологической реактивности у практически здоровых людей
Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов проводили с помощью тест-набора химической компании «Реакомплекс» (г. Чита). Метод основан на нефелометрии различной растворимости мономеров иммуноглобулинов в составе иммунных комплексов в среде полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000). В пробирку набирали 5-6мл венозной крови без антикоагулянтов и инкубировали в термостате при t=+37C в течение 2 часов для отделения сыворотки. Полученную сыворотку разводили (0,2 мл сыворотки и 0,4 мл боратного буфера). В контрольную пробирку вносили 0,2 мл разведённой сыворотки и 1,8 мл боратного буфера. В опытную пробирку -0,2 мл разведённой сыворотки и 1,8 мл ПЭГ. Обе пробирки выдерживали при комнатной температуре 2 часа. Фотометрически при длине волн 440 нм определяли процент пропускания по шкале «Т», используя кювету с длиной оптического пути 5,0253. Результаты учитывали, взяв пропускание контрольной пробы за 100%. Калибровочной кривой определяли концентрацию ЦИК в г/л.
Содержание интерлейкина-1, интерлейкина-2, TNF-a определяли методом «конкурентного» иммуноферментного анализа реактивами ВСМ Diagnostics, «СУТІММІЖЕ sciences INC» и CytElisa производства США с оценкой результатов на фотометре серии Мультискан производства Финляндии и регистрацией в нг/мл, с реактивами «Biosource» и оценкой результатов в пг/мл. Количественное содержание в сыворотке крови раково-эмбрионального антигена (РЭА) проводили твердофазным «неконкурентным» методом, основанным на прямой «сэндвич» технологии с помощью иммуноферментного набора фирмы ВСМ Diagnostics (США) и «Can Ag» (Швейцария). Результаты регистрировались в нг/мл.
Для выявления антител к двухспиральной ДНК и нуклепротеидам применяли метод иммуноферментного анализа с использованием набора ENA Profile фирмы Bio-Rad (США). Bio-Rad Anti-ds DNA Test основан на твердофазовом иммуносорбентном анализе, при котором аналит является показателем цветной реакции конъюгата фермента. Для анализа используются планшеты, лунки которых покрыты специально спирализованной двухспиральной ДНК. ДНК является сильно заряженной молекулой, благодаря чему может неспецифически связываться с другими иммуноглобулинами при добавлении к анти-DNA антителам. При добавлении разбавленной сыворотки в ячейки анти-ds DNA связываются с антигеном. После инкубирования и отмывки в каждую ячейку вносится субстрат ТМБ. Наличие коньюгата анти-ds DNA/DNA приводит к образованию изменения окраски. Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству анти-ds ДНК, находящемуся в исходном образце. Набор стандартов, калиброванных по первому. Уровни аутоантител к двухспиральной ДНК, нуклеопротеидам согласно предложенным концентрациям в образцах используемых наборов, регистрировались в МЕ/мл (аутоантитела к ДНК до 50МЕ/мл, к нуклеопротеидам до 1 МЕ/мл).
Сывороточные аутоантитела к лейкоцитам и эритроцитам определяли в реакциях леикоагглютинации и гемагглютинации, для постановки которых использовали 0,1 мл 2 % взвеси в физиологическом растворе соответствующих аутоклеток. Исследуемые сыворотки подогревали 30 мин. при 56, готовили двукратные их разведения сывороткой группы АВ.
Для постановки гемагглютинации к каждому объёму сыворотки (0,1 мл) добавляли 0,1 мл 1% взвеси аутоэритроцитов и оставляли при комнатной температуре на 2 часа. В реакции лейкоагглютинации к исследуемой сыворотке в объёме 0,2 мл добавляли 0,1 мл суспензии лейкоцитов, инкубировали 90 минут при 37С, затем добавляли 0,1мл 1% раствора уксусной кислоты для растворения эритроцитов. Результаты гемагглютинации и лейкоагглютинации учитывали в толстой капле.
Аутоантитела к тромбоцитам, аутогемагглютинины, лейкоагглютинины, определяли в разведениях (1/5, 1/20, 1/40, 1/80, 1/60и т.д.), титры которых регистрировались в log2.
Статистический анализ. Результаты исследования обработаны с помощью пакетов программ по статистической обработке данных Microsoft Excel, SPSS (версия 11) for Windows. Числовые характеристики представлены в виде средняя арифметическая ± ошибка средней, стандартного отклонения, как медиана и интерквартильные ранги при распределении, отличающемся от нормального. Распределение показателей признавалось нормальным, если имелось примерное равенство средних значений, примерная симметричность минимальных и максимальных значений относительно среднего значения, коэффициенты ассиметрии и эксцесса не превышали 2 по абсолютной величине. Достоверность различий между группами определяли по критерию t Стьюдента (с поправкой Бонферрони при множественном сравнении) и с использованием непараметрических тестов - % , Mann-Whitney Test и Kruskal-Wallis Test. Применялся однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. Статистическая достоверность присваивалась при значении р 0,05. Проводился корреляционный анализ с определением коээфициентов линейной корреляции Пирсона, непараметрического коэффициента ранговой корреляции Спирмена, а также однофакторный и многофакторный регрессионный анализ.
