Содержание к диссертации
Перечень сокращений 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ТЕТРАХЛОРМЕТАНА. НАРУШЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ИММУНОГЕ
НЕЗА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 14
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 34
Объект исследования и применяемые препараты 34
Методы исследования 35
Сывороточная активность лизоцима 35
Тромбоцитарный катионный белок сыворотки крови 36
Определение фагоцитарно-метаболической активности нейтрофи-лов 37
Определение содержания лимфоцитов в органах системы иммунитета и циркулирующей крови 38
Исследование гуморального звена иммунного ответа 39
Оценка кооперации Т- и В- лимфоцитов ex vivo и in vitro 41
Исследование функции ТЫ- лимфоцитов 42
Изучение антителозависимой клеточной цитотоксичности 43
Оценка активности естественных клеток- киллеров 44
Исследование функции надпочечников, активности эстераз Т-клеток, моноцитов, макрофагов и перекисного окисления липидов 45
2.3. Методы статистической обработки результатов исследований ... 47
ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ТЕТРАХЛОРМЕТАНА НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ
МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ДОИММУННЫХ МЕХАНИЗМОВ ЗАЩИ
ТЫ ОТ ИНФЕКЦИЙ 48
3.1. Сывороточная активность лизоцима при остром действии ТХМ.... 48
Активность тромбоцитарного катионного белка в сыворотке крови 50
Фагоцитарная активность нейтрофилов 51
Резюме 55
ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ТЕТРАХЛОРМЕТАНА НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ
МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ СИСТЕМЫ ИММУНИТЕ
ТА 57
Изменение содержания лимфоцитов в органах системы иммунитета 57
Влияние ТХМ на тимусзависимый гуморальный иммунный ответ... 61
4.2.1. Оценка воздействия тетрахлорметана на антителообразование к ти-
мусзависимому антигену в динамике по титру антител в крови 61
4.2.2. Исследование действия острого отравления ТХМ на число антите-
лообразующих клеток в селезенке 63
Оценка влияния острого отравления ТХМ на число антителообра-зующих клеток в селезенке, синтезирующих IgG 65
Нарушение кооперации Т- и В- клеток в формировании антитело-образования ex vivo и in vitro 67
Влияние ТХМ на тимуснезависимый гуморальный иммунный ответ 70
Оценка влияния ТХМ на клеточный иммунный ответ 72
Изучение функции ТЫ- клеток 72
Изучение антителозависимой клеточной цитотоксичности 75
Воздействие острой интоксикации ТХМ на функцию естественных клеток-киллеров 77
Резюме 81
ГЛАВА 5. МЕХАНИЗМЫ НАРУШЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ИММУННОГО ГОМЕОСТАЗА ПРИ ОТРАВЛЕНИИ ТЕТРА-
ХЛОРМЕТАНОМ 83
5.1. Исследование редукции функции Thl- Тгі2-лимфоцитов и проду
цируемых ими цитокинов в супрессии иммунных реакций 83
5.2. Роль кортикостероидов и ПОЛ в супрессии иммунного ответа
при отравлении тетрахлорметаном 85
5.3. Оценка действия тетрахлорметана на активность ацетилхолинэс-
теразы Т-клеток 89
Резюме 91
ГЛАВА 6. КОРРЕКЦИЯ НАРУШЕНИЙ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУ
ЛЯЦИИ ИММУННОГО ГОМЕОСТАЗА ПРИ ОСТРОМ ОТРАВЛЕНИИ
ТЕТРАХЛОРМЕТАНОМ 92
6.1. Влияние антидотов, индукторов и ингибиторов Р-450-зависимых
монооксигеназ при отравлении тетрахлорметаном на фагоцитарно-
метаболическую активность нейтрофилов и параметры системы иммуни
тета 92
6.2. Исследование действие ингибитора Р-450-зависимых моноокси
геназ 2-диэтиламиноэтил-2,2-дифенилпропилацетата (SKF-525A) при ост
ром отравлении тетрахлорметаном на фагоцитарно-метаболическую ак
тивность нейтрофилов и иммунный ответ 96
6.3. Обоснование иммунокоррекции нарушений физиологической регу
ляции иммунного гомеостаза после острого отравления тетрахлорметаном 98
6.4. Влияние имунофана и полиоксидония на фагоцитарно-метаболи
ческую активность нейтрофилов и показатели иммунного ответа при ост
рой интоксикации тетрахлорметаном с применением антидотов 104
Резюме 107
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 109
ВЫВОДЫ 129
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 131
ЛИТЕРАТУРА 132
5 ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ
АЗКЦ - антителозависимая клеточная цитотоксичность АХЭ - ацетилхолинэстераза АОК - антителообразующие клетки АОС — антиоксидантная система
ГГАС — гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа ЕКК - естественные клетки-киллеры ЕЦ - естественная цитотоксичность ИКК - иммунокомпетентные клетки ИЛ-1 (2 и т.д.) - интерлейкин-1 (2 и т.д.) ИФН-у - у - интерферон
К-клетки - клетки-киллеры (лимфоциты, определяющие АЗКЦ) КС - кортикостерон МАН - малоновый диальдегид МС - микросомальная система
ОДЛТА - отрицательный двоичный логарифм титра антител ПОЛ - перекисное окисление липидов СПР — суммарная продукция радикалов ТКБ — тромбоцитарный катионный белок ТХМ - тетрахлорметан
ТЫ-(ТЬ2)-лимфоциты - Т-лимфоциты-хелперы типа 1 и 2 ФМАН - фагоцитарно-метаболическая активность нейтрофилов ЭК - эритроциты кур ЭБ - эритроциты барана
LD5o (ЛД5о) - средняя смертельная доза, вызывающая смертельный исход у 50% отравленных
SKF — 525 А — 2-диэтиламиноэтил - 2,2 - дифенилпропилацетат Vi-антиген (Vi-Ag) - тимуснезависимый антиген брюшнотифозной вакцины
Введение к работе
Актуальность темы. Исследование острого действия ксенобиотиков на доиммунные факторы защиты организма от инфекций (неспецифическую резистентность организма) и систему иммунитета и возможностей коррекции их нарушений при помощи перспективных иммуностимуляторов является одной из наиболее актуальных проблем физиологии, токсикологии и иммунологии [Смирнов B.C. и соавт., 2000; Забродский П.Ф. и соавт., 2007]. Это определяется применением в Вооруженных Силах Российской Федерации разнообразных токсикантов, возможными авариями на химических объектах, вероятностью террористических актов с применением высокотоксичных соединений, возрастанием интоксикаций различными соединениями, вызывающих постинтоксикационные иммунодефицитные состояния, различные инфекционные заболевания [Саватеев Н.В., Куценко С.А., 1982, 1993; Хаитов P.M. и соавт., 1995а; Забродский П.Ф. и соавт., 1998, 2002, 2007; Агапов В.И. и соавт., 2004; Miller К., 1985; Descotes J., 1986; Luster М. J. et al., 1987; Sullivan J. В., 1989; Kimber I., 1996; Manibusan M.K., et al, 2007].
Тетрахлорметан (TXM) широко используется в промышленности как растворитель масел, жиров, каучука, битумов и смол; для экстрагирования жиров и алкалоидов из костей и семян; при производстве фреонов; для чистки и обезжиривания одежды в быту и производственных условиях [Тиунов Л.А., 1990; Wernke M.J., Schell J.D., 2004]. В последние годы частота острых интоксикаций хлорированными углеводородами, в частности, ТХМ и показатель смертельных исходов от отравлений не уменьшаются [Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000; Забродский П.Ф. и соавт., 2007; Rusinski P., Kolasinski Z., 2003]. Несмотря на относительно небольшую частоту острых интоксикаций данными соединениями (до 5%), они характеризуются весьма высокой смертностью отравленных (20-96%) [Курашов О.В., Троце-вич В.А, 1992; Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000; Елькин А.И. и соавт., 2004]. Пациенты с отравлениями ТХМ составляют до 60% всех боль-
7 ных с токсическим поражением печени [Голиков С.Н. и соавт., 1986; Венгеровский А.И., Седых И.М., Саратиков А.С., 1993; Лим В.Г., 2006]. Особую опасность ТХМ может представлять при аварийных ситуациях на химических объектах, в частности, в процессе уничтожения химического оружия, когда в силу его высокой летучести ингаляционным отравлениям может подвергаться большое количество людей. Продукты термической деструкции ТХМ (данное соединение может быть использован для пожаротушения) образуют наряду с многочисленными токсикантами отравляющее вещество фосген. Нельзя исключить употребление ТХМ в качестве суррогата алкоголя или с суицидальными целями [Курашов О.В., Троцевич В.А., 1992; Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000; Лим В.Г., 2006; Забродский П.Ф.и соавт., 2007].
Одной из причин высокой смертности после острого отравления ТХМ [Кожемякин Л.А. и соавт., 1992; Лим В.Г., 2006] могут являться инфекционные осложнения и заболевания, связанные с формированием вторичного иммунодефицита. При этом влияние ТХМ на систему иммунитета нуждается в дальнейшем изучении [Лим В.Г., 2006; Забродский П.Ф.и соавт., 2002, 2007; Descotes J., 1986; Luster M.I. et al., 1987; Streets K.L., Wustefeld Т., 2001; Louis H. et al., 2003].
Изучение действия ТХМ на доиммунные факторы защиты организма и систему иммунитета имеют как теоретическое значение, раскрывая неизвестные механизмы регуляции неспецифической резистентности организма и иммуногенеза, так и практическое, позволяя проводить научно обоснованные профилактику и лечение возникающих при отравлениях данным токсикантом инфекционных, аллергических, аутоиммунных, онкологических и других заболеваний [Хаитов Р. М. и соавт., 1995; Ратькин А.В. и соавт., 2005; Забродский П.Ф., 1993, 2002, 2007; Loose L.D., 1985; Miller К., ,1985; Descotes J., 1986; Luster M. I. et al., 1987; Georgiev V. S, Yamaguuchi H., 1993; Kimber I., 1996; Popp W.,1996; Gobba F. et al., 1997; Plaa G.L., 2000; Sell S., 2000; Luster M.I., Simeonova P.P., 2001; Weber L.W. et al., 2003; Wernke M.J., Schell J.D.,
8 2004; Rosenberg Y.J., 2005; Masuda Y., 2006]. Следует отметить, что вопрос о медикаментозной коррекции нарушений иммунного гомеостаза под влиянием ТХМ в постинтоксикационном периоде до сих пор изучен недостаточно [Лим В.Г., 2006; Забродский П.Ф. и соавт., 2007].
Таким образом, учитывая достаточно широкое распространение и использование в промышленности, технике и быту ТХМ, высокую летальность при отравлении им, недостаточно изученные особенности его действия на физиологические механизмы регуляции системы иммунитета, следует заключить, что проблема изучения нарушения иммунного гомеостаза при остром отравлении ТХМ, обоснование фармакологической коррекции его нарушений в постинтоксикационный период важны как в теоретическом, так и в практическом отношении.
Цель исследования: изучить неспецифические и специфические защитные механизмы крови, характер и механизмы нарушения физиологической регуляции иммуногенеза при отравлении тетрахлорметаном и разработать обоснованные направления медикаментозной коррекции выявленных нарушений.
Задачи исследования:
1. Оценить действие тетрахлорметана на неспецифические защитные
механизмы крови.
Изучить влияние острой интоксикации тетрахлорметаном на содержание лимфоцитов в органах системы иммунитета.
Исследовать особенности влияния острой интоксикации тетрахлор метаном на гуморальный иммунный ответ и кооперацию Т- и В - лимфоцитов, определяющую тимусзависимое антителобразование.
Определить характер изменения клеточных иммунных реакций
(функции ТЫ-клеток, антителозависимой клеточной цитотоксичности, активности естественных клеток-киллеров) после воздействия тетрахлорметана.
5. Оценить роль ТЫ- и Тп2-лимфоцитов, нарушения функции коры
9 надпочечников, активности ацетилхолинэстеразы Т-лимфоцитов, перекисно-го окисления липидов в нарушении иммунного статуса под влиянием тетра-хлорметана.
6. Изучить влияние средств специфической терапии отравлений тетра-хлорметаном (а-токоферола ацетата и унитиола), ингибиторов и индукторов Р-450-зависимых монооксигеназ на реализацию его иммунотоксических эффектов и обосновать применение иммуностимуляторов для коррекции постинтоксикационного иммунодефицитного состояния.
Научная новизна. В экспериментах на животных проведена оценка иммунотоксических эффектов ТХМ и обосновано применение иммуномоду-ляторов для коррекции нарушений показателей системы иммунитета. Показано, что ингибиторы Р-450-зависимых монооксигеназ могут быть использованы для снижения супрессирующего действия ТХМ на показатели системы иммунитета. Проведена оценка особенностей нарушения физиологических механизмов иммуногенеза при остром воздействии ТХМ.
Острое воздействие ТХМ вызывает дозозависимое снижение доиммун-ных факторов защиты организма от инфекций: сывороточной активности лизоцима, тромбоцитарного катионного белка, фагоцитарно-метаболической активности полиморфноядерных лейкоцитов.
При остром отравлении ТХМ снижается содержание Т-лимфоцитов в тимусе и лимфоцитов в органах системы иммунитета.
Установлено, что острая интоксикация ТХМ в прямой зависимости от дозы более выраженно снижает Т-зависимые и Т-независимые гуморальные иммунные реакции в продуктивную фазу иммуногенеза по сравнению с индуктивной.
Показано, что ТХМ в прямой зависимости от концентрации снижает эффект кооперации лимфоцитов, поражая преимущественно Т-клетки.
Экспериментально выявлено, что острое отравление ТХМ снижает функцию Т-клеток, реакцию гиперчувствительности замедленного типа (функция Th 1 -лимфоцитов, моноцитов и макрофагов), характеризующую как
10 первичный, так и вторичный клеточный иммунный ответ. При остром воздействии ТХМ происходит дозозависимое уменьшение антителозависимои клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) преимущественно в продуктивной фазе иммуногенеза по сравнению с индуктивной фазой. Выявлено выраженное нарастание эффекта супрессии от индуктивной к продуктивной фазе иммунного ответа при остром отравлении ТХМ.
Действие ТХМ снижает активность естественных клеток-киллеров (ЕКК) в прямой зависимости от дозы. Редуцирующие эффекты ТХМ на функцию ЕКК in vitro прямо зависят от концентрации.
Впервые показано, что подострое отравление ТХМ в суммарной дозе 1,0 DL5o вызывает редукцию иммунных реакций, обусловленных активностью Тп2-лимфоцитов, в меньшей степени по сравнению с иммунным ответом, связанным с функцией ТЫ-клеток. Это доказано как исследованием показателей системы иммунитета, связанных с функцией лимфоцитов ТЫ- и Th2-типов, так и изучением содержания в крови у-интерферона (ИФН-у) и интер-лейкина - 4 (ИЛ-4).
Проведена оценка роли кортикостерона, ацетилхолинэстеразы (АХЭ) Т-клеток и перекисного окисления липидов (ПОЛ) в реализации иммунотокси-ческого эффекта ТХМ. Выявлена обратная корреляция между концентрацией кортикостерона в крови и иммунными реакциями при остром отравлении крыс ТХМ. Доказано, что иммуносупрессия, обусловленная действием ТХМ, прямо связана со снижением активности ацетилхолинэстеразы в Т-лимфоцитах тимуса и селезенки.
В экспериментальных исследованиях показано, что ТХМ инициирует ПОЛ, что проявляется снижением активности антиоксидантной системы (редукция каталазы и пероксидазы) и увеличением содержания малонового альдегида и суммарной продукции радикалов в плазме крови. Установлена соответственно отрицательная и положительная высокая степень корреляции активности антиоксидантных ферментов и продуктов ПОЛ с показателями системы иммунитета.
Изучено влияние на формирование постинтоксикационного иммуноде-фицитного состояния, вызванного ТХМ, средств специфической терапии (а-токоферола ацетата и унитиола) при отравлении данным соединением, индукторов (фенобарбитал, 2,4,6-трифенил-4Н-селенопиран) и ингибиторов (2-диэтиламиноэтил-2,2-дифенилпропилацетат-8КР-525А) Р-450-зависимых монооксигеназ и иммуностимуляторов в эквитерапевтических дозах: иму-нофана (20 мкг/кг) и полиоксидония (700 мкг/кг). Показано, что а-токоферола ацетат, унитиол, SKF-525A и иммуностимуляторы снижают им-мунотоксичность ТХМ, а индукторы монооксигеназных энзимов (фенобарбитал, 2,4,6-трифенил-4Н-селенопиран) увеличивают ее. Полиоксидоний и имунофан обладают выраженной иммуностимулирующей активностью и практически полностью восстанавливают показатели системы иммунитета при интоксикации ТХМ и применении средств специфической терапии - а-токоферола ацетата и унитиола. После интоксикации ТХМ в дозе 1,0 DL5o в условиях антидотной терапии в комбинации с полиоксидонием или имуно-фаном обеспечивает полное восстановление всех исследованных показателей иммунной системы.
Практическая значимость работы заключается в доказательстве того, что в результате острой и подострой интоксикации ТХМ формирование иммунодефицитного состояния сопровождается преимущественным поражением Thl -лимфоцитов, а применение в качестве антидота ТХМ а-токоферола ацетата или унитиола уменьшает иммунотоксичность токсиканта. Ингибиторы Р-450-зависимых монооксигеназ, а также иммуностимуляторы имунофан и поликсидоний могут быть использованы для восстановления показателей доиммунной защиты организма и системы иммунитета после острого отравления ТХМ.
Положения, выносимые на защиту
1. Острая интоксикация тетрахлорметаном вызывает дозозависимое снижение доиммунных факторов защиты организма от инфекций: сыворо-
12 точной активности лизоцима, тромбоцитарного катионного белка, фагоцитарно-метаболической активности полиморфноядерных лейкоцитов.
После острого и подострого отравления тетрахлорметаном снижается содержание Т- и В-лимфоцитов в органах системы иммунитета, Т-зависимое и Т-независимое антителообразование преимущественно в индуктивной фазе антителогенеза по сравнению с продуктивным периодом антителогенеза. При этом в большей степени поражаются ТЫ-лимфоциты по сравнению с Тп2-клетками.
Острая интоксикация тетрахлорметаном уменьшает функцию Thl-лимфоцитов, антителозависимую клеточную цитотоксичность и активность естественных клеток-киллеров.
Нарушение физиологической регуляции иммунного гомеостаза при действии тетрахлорметана связано с иммуносупрессивным эффектом кор-тикостерона вследствие постинтоксикационной стресс-реакции (активация гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы), инициацией перекисного окисления липидов и ингибированием ацетилхолинэстеразы Т-лимфоцитов.
Применение а-токоферола ацетата, унитиола (средств специфической терации отравлений тетрахлорметаном) в комбинации с иммуностимуляторами имунофаном и полиоксидонием восстанавливает показатели иммунного статуса после отравления тетрахлорметаном.
Апробация и реализация работы, публикации
Результаты исследований доложены на Всероссийской конференции молодых ученых «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006); V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2007); II Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 2009); межвузовской научно-практической конференции «Новые технологии в медицине» (Саратов, 2008); заседаниях секции прикладных проблем безопасности хранения и уничтожения химического оружия По-
13 волжского отделения АВН (2006, 2007, 2008, 2009); совместных научных конференциях кафедр нормальной физиологии ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет Росздрава»; технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ ГОУ ВПО «Саратовский военный институт биологической и химической безопасности», токсикологии и медицинской защиты ГОУ ВПО «Саратовский военно-медицинский институт МО РФ» (2006, 2007, 2008, 2009); научно-практических конференциях ГОУ ВПО «Саратовский военно-медицинский институт Министерства обороны Российской Федерации (2006, 2007, 2008) и внедрены в педагогический процесс кафедр нормальной физиологии ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет Росздрава» и технологии уничтожения химического оружия и токсичных веществ ГОУ ВПО «Саратовский военный институт биологической и химической безопасности» По теме диссертации опубликовано 10 работ.
Объем и структура работы
Диссертационная работа изложена на 158 страницах машинописи (включая таблицы и список литературы), состоит из обзора литературы (глава 1); материалов и методов исследований (глава 2); собственных экспериментальных и клинических исследований (главы 3-6); заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 13 рисунками. Библиографический указатель включает 241 источник отечественной и зарубежной литературы.
