Введение к работе
Актуальность проблемы. Симпатическая нервная система (СНС) играет важную роль в регуляции тонуса сосудов и уровня артериального давления (АД). Морфологическое и функциональное созревание СНС у многих млекопитающих происходит только после рождения. У таких животных, как кролики, мыши, крысы и многие другие, формирование симпатической иннервации происходит лишь в раннем постнатальном периоде.
Формирование симпатической иннервации в разных органах происходит в разное время. Так, у крыс в сердце созревание иннервации происходит уже к концу первой недели жизни (Bareis, Slotkin, 1980), в то время как в сосудах формирование сплетения симпатических волокон заканчивается лишь к 30-дневному возрасту (Пуздрова, 2007; Todd, 1980; Sandow, Hill, 1999).
Регуляция гемодинамики у животных с незрелой СНС и взрослых животных значительно различается. Так, у крысят в первые дни после рождения уровень АД значительно ниже, чем у взрослых крыс (Bartolome et al., 1980; Mills, Smith, 1986; Kasparov, Paton, 1997). В первый месяц после рождения АД постепенно увеличивается (Kasparov, Paton, 1997). В этот же период существенно изменяется активность регуляторных систем: если в первые дни жизни крысят вклад СНС в регуляцию АД не выявляется, то к возрасту один месяц он довольно значителен (Mills, Smith, 1986). Одновременно с увеличением вклада СНС уменьшается влияние гормональных систем: надпочечниковой (Seidler, Slotkin, 1985) и ренин-ангиотензиновой (Wallace et al, 1980; Kasparov et al, 1998).
Известно, что СНС оказывает на сосуды не только кратковременные влияния, направленные на регуляцию их тонуса, но также и длительное трофическое влияние (Орбели, 1962). Результатом трофического влияния является изменение ростовых процессов в гладкомышечной ткани, пролиферация и дифференцировка гладкомышечных клеток (Damon, 2000; 2005), изменение их электрофизиологических и сократительных характеристик (Abel, Hermsmeyer, 1981;Bevan, 1984).
При некоторых заболеваниях сердечно-сосудистой системы, таких как эссенциальная (наследственная) артериальная гипертензия, функционирование СНС изменено уже в раннем возрасте - в период созревания СНС (Tucker, Johnson, 1984). Поэтому изучение участия СНС в регуляции гемодинамики в период раннего постнатального онтогенеза может быть важным для понимания механизмов развития патологий сердечно-сосудистой системы и разработки новых способов коррекции сократимости сосудов.
Сокращение гладкой мышцы регулируется двумя способами: зависимо от
9+
Са - в основном через киназу легких цепей миозина (КЛЦМ) или
9+
относительно независимо от Са - в основном через фосфатазу легких цепей миозина (ФЛЦМ). Сила сокращения определяется балансом активностей этих ферментов: при снижении активности ФЛЦМ сокращение может усиливаться
9+
без видимых изменений концентрации Са в цитоплазме (Воротников и др., 2002; 2009; Hirano, 2007). Ключевым ферментом сигнальных каскадов, приводящих к ингибированию ФЛЦМ, является Rho-киназа (Hirano, 2007).
Она ингибирует ФЛЦМ, что приводит к увеличению силы сокращения при данной концентрации Са в цитоплазме.
Формирование симпатической иннервации в онтогенезе сопровождается установлением ее трофического влияния на кровеносные сосуды. Это приводит к изменению механизмов регуляции сокращения сосудистой гладкой мышцы. В экспериментах in vitro показано, что сокращение изолированных сосудов 1-2-недельных крысят происходит при незначительном увеличении внутриклеточной концентрации Са , в то время как у взрослых крыс оно
9+
сильно зависит от Са (Пуздрова, 2007). Такое изменение сократительных характеристик коррелирует с изменением паттерна экспрессии регуляторных белков в гладкомышечных клетках сосудов. С возрастом количество белков,
9+
участвующих в Са -независимом сокращении (МАР-киназ, Rho-киназы),
9+
снижается, а содержание белков, обеспечивающих Са -зависимое сокращение (КЛЦМ, /г-кальдесмона), увеличивается (Пуздрова, 2007).
Так как экспрессия Rho-киназы в сосудах крысят выше, чем у взрослых крыс, то можно предположить, что вклад Rho-киназы в сокращение сосудов у крысят будет больше. Этот эффект должен проявляться как на уровне отдельных сосудов, так и на системном уровне, т.е. на уровне регуляции системного АД. Ряд данных литературы свидетельствует о том, что в условиях in vitro ингибиторы Rho-киназы действительно сильнее подавляют сокращение сосудов у животных в перинатальный период развития, чем у взрослых (Akopov et al., 1998; Ekman et al., 2005; Belik et al., 2006). Однако роль Rho-киназы в регуляции системной гемодинамики у крыс на стадии формирования симпатической иннервации сосудов ранее не исследовалась.
Таким образом, снижение экспрессии Rho-киназы совпадает по времени с созреванием симпатической иннервации сосудов. Представлялось интересным выяснить, связано ли оно с трофическим влиянием симпатических нервов. Если снижение экспрессии Rho-киназы в онтогенезе, действительно, обусловлено трофическим действием симпатических нервов, то нарушение развития симпатической иннервации должно приводить к увеличению экспрессии Rho-киназы у десимпатизированных крыс по сравнению с крысами с интактной СНС.
В настоящей работе была исследована роль Rho-киназы в регуляции системной гемодинамики у крыс на разных этапах созревания симпатической иннервации сосудов. Были использованы два подхода, которые позволили установить факт трофичеекго влияния симпатических нервов на экспрессию и функциональную активность Rho-киназы:
изучение роли Rho-киназы в регуляции гемодинамики при созревании СНС в ходе онтогенеза;
сравнение роли Rho-киназы в регуляции гемодинамики у взрослых крыс с интактной СНС и у крыс, у которых нарушали развитие СНС путем неонатальной десимпатизации.
Таким образом, в настоящей работе впервые исследовано участие Rho-киназы в сокращении сосудов у крыс с разной степенью развития симпатической иннервации как на уровне отдельных сосудов, так и на уровне целого организма.
Целью настоящей работы было изучение вклада Rho-киназы в регуляцию гемодинамики у крыс с разной степенью развития симпатической иннервации сосудов.
В работе были поставлены следующие задачи:
Проследить динамику изменений системного АД и частоты сердечных сокращений (ЧСС), а также оценить вклад СНС в формирование уровня АД у крыс с первой по 7-8 недели постнатального онтогенеза;
Исследовать влияние ингибиторов Rho-киназы на реакции сосудов при введении агониста аі-адренорецепторов метоксамина у крыс в возрасте одна, две и 4-5 недель в условиях in vivo и in vitro;
Сравнить уровень экспрессии Rho-киназы у неонатально десимпатизированных крыс и крыс с интактной СНС;
Исследовать эффекты ингибитора Rho-киназы на уровень АД и реакции сосудов на введение метоксамина у крыс с неонатальной десимпатизацией в условиях in vivo и in vitro.
Научная новизна работы. В настоящей работе впервые показано, что роль Rho-киназы в регуляции тонуса сосудов и уровня системного АД у крысят с незрелой симпатической иннервацией более значительна, чем у крыс, у которых симпатическая иннервация сосудов полностью сформирована. Также впервые обнаружены высокая экспрессия Rho-киназы и ее важная роль в регуляции гемодинамики у животных с неонатальной десимпатизацией.
Практическая значимость. Важно отметить, что у человека окончательное становление симпатической иннервации также происходит уже после рождения (Швалев и др., 1992). В связи с этим, такие лабораторные животные, как крысы, могут быть использованы в качестве экспериментальной модели для исследования основных закономерностей становления симпатической иннервации, а также специфических, обусловленных трофическим влиянием иннервации, процессов клеточной дифференцировки и роста органов-мишеней.
Результаты, полученные в настоящей работе, развивают имеющиеся представления о механизмах трофического действия симпатических нервов на кровеносные сосуды. Идентификация мишеней трофического действия СНС на гладкую мышцу сосудов представляется важной, т.к. известно, что активность СНС при некоторых заболеваниях сердечно-сосудистой системы (например, при гипертензии) изменяется. Это означает, что изменяется и уровень экспрессии белков, регулирующих сокращение гладкомышечных клеток сосудов, что может в дальнейшем приводить и к изменению функционирования гладкой мышцы сосудов. Следует отметить, что Rho-киназа рассматривается в настоящее время как одна их перспективных мишеней для фармакологической терапии нарушений сократимости гладкой мышцы сосудов. Более глубокое понимание механизмов, которые опосредуют длительные трофические эффекты симпатических нервов, дает возможность разработки новых, более избирательных, препаратов для коррекции тонуса сосудов и нарушений гемодинамики.
Основные положения, выносимые на защиту.
У новорожденных крыс активность Rho-киназы является важным механизмом, обеспечивающим сокращение сосудов и регуляцию уровня АД.
Снижение роли Rho-киназы в регуляции тонуса сосудов и уровня АД в ходе постнатального онтогенеза связано с трофическим влиянием симпатических нервов.
Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Ежегодной встрече Скандинавского физиологического общества «SPS 2008» (Финляндия, Оулу, 2008), XXXVII Европейской конференции по физиологии мышц «ЕМС 2008» (Великобритания, Оксфорд, 2008), IX Всероссийской научно-теоретической конференции «Физиологические механизмы адаптации растущего организма» (Россия, Казань, 2008), XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2009» (Россия, Москва, 2009), 6-м Конгрессе Международного сообщества наук об автономной нервной системе «ISAN 2009» (Австралия, Сидней, 2009), VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Россия, Санкт-Петербург, 2009), Объединенном съезде Скандинавского и Германского физиологического общества (Дания, Копенгаген, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 8 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения полученных данных, заключения и выводов. Список литературы включает 136 источников. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 36 рисунками.
