Введение к работе
Актуальность проблемы. Гладкая мышца стенки артериальных сосудов обеспечивает изменение их тонуса и, следовательно, регуляцию кровоснабжения органов и уровня системного артериального давления. В раннем постнатальном онтогенезе в системе кровообращения происходят значительные изменения, которые связаны как с активностью регуляторных систем, так и с сократительными характеристиками гладкомышечных клеток сосудов. Нарушение сбалансированности этих процессов ведет к развитию различных сердечно-сосудистых патологий (Wettschureck, Offermanns, 2002).
Динамика процессов возрастных изменений кровообращения различается у разных видов млекопитающих и коррелирует с темпом общего созревания организма. Удобной экспериментальной моделью таких изменений в организме человека являются крысы: по степени зрелости систем организма новорожденный крысенок сходен с недоношенным (рожденным на 7-8 месяце беременности) ребенком. Изучение механизмов регуляции кровообращения у новорожденных крысят позволяет понять, как происходят соответствующие изменения в организме человека, а также моделировать различные патологические процессы и разрабатывать новые способы их коррекции.
В отличие от поперечно-полосатой, в гладкой мышце в основном реализуется миозиновыи тип регуляции сокращения. Это означает, что для выполнения своей моторной функции (взаимодействия с актином) гладкомышечный миозин должен быть предварительно активирован путем фосфорилирования остатка Ser регуляторных легких цепей (ЛЦМ). Такое фосфорилирование осуществляется киназой легких цепей миозина (КЛЦМ), которая активируется комплексом Са -кальмодулин при повышении
9+ 9+
концентрации внутриклеточного Са ([Са ]i) (Hartshorne, 1998; Ito et al., 2004; Somlyo, Somlyo, 2003). Противоположным по функции ферментом является фосфатаза легких цепей миозина (ФЛЦМ), ее каталитическая активность обеспечивает расслабление гладкой мышцы. Сила сокращения гладких мышц во многом зависит от уровня фосфорилирования миозина в клетке, т.е. от баланса активностей КЛЦМ и ФЛЦМ. Важно, что многие сократительные стимулы (активация рецепторов, сопряженных с G-белками, деполяризация наружной мембраны и др.) могут сдвигать этот баланс в сторону фосфорилирования, в основном за счет подавления активности ФЛЦМ (Somlyo, Somlyo, 2003; Hirano, 2007; Ratz 2005). В результате ингибирования ФЛЦМ количество фосфорилированных ЛЦМ возрастает при неизменной активности
9+
КЛЦМ. Следовательно, при той же [Са ]і развивается большее сокращение, такой феномен получил название Са -сенситизации или увеличения чувствительности сократительного аппарата к Са (Horowitz et al., 1996).
ФЛЦМ может ингибироваться вследствие активации внутриклеточных сигнальных каскадов, включающих Rho-киназу и/или протеинкиназу С (Somlyo, Somlyo, 2003), причем вклад этих путей в гладкой мышце разных сосудов может существенно различаться. Например, в артериях брыжейки
Са -чувствительность сокращения регулируется в основном протеинкиназой С (Budzyn et al., 2006), а в хвостовой артерии - Rho-киназой (Mueed et al., 2004).
На данный момент установлено, что Са -чувствительность сократительного аппарата гладкой мышцы сосудов у млекопитающих в раннем постнатальном периоде или на поздних этапах эмбрионального развития выше, чем у взрослых (Akopov et al, 1997; Akopov et al, 1998; Bruce, Nixon, 1997; Ekman et al., 2005; Sandoval et al., 2007; Пуздрова, 2007). Такое повышение
9+
Са -чувствительности коррелирует с увеличением степени фосфорилирования ЛЦМ (Sandoval et al., 2007), то есть оно связано с ингибированием ФЛЦМ. Однако механизмы этого явления исследованы крайне слабо. Некоторые авторы полагают, что высокая Са -чувствительность сокращения развивающейся гладкой мышцы обеспечивается активностью Rho-киназы (Akopov et al, 1998; Belik et al, 2005; Ekman et al., 2005), другие же связывают ее с активностью протеинкиназы С (Su et al., 2003).
В данной работе впервые проведено систематическое исследование механизмов повышения Са -чувствительности артериальных сосудов у крыс в возрасте 5-10 дней по сравнению с взрослыми животными. В качестве объекта исследования была выбрана подкожная артерия - ветвь бедренной артерии, приносящая кровь к плюсне и стопе. Подкожная артерия является сосудом мышечного типа, такие артерии играют роль в регуляции общего периферического сопротивления и уровня системного артериального давления. Предыдущие исследования Са -чувствительности сокращения сосудов в развивающемся организме проводились в основном для артерий головного мозга (Akopov et al., 1998) или легких (Belik et al., 2005), которые отличаются от артерий многих других органов по характеру иннервации и другим регуляторным характеристикам (Морман, Хеллер, 2000).
В наших экспериментах проводилась одновременная регистрация двух
9+
параметров - силы сокращения и [Са ]і, в отличие от предыдущих работ, где измерялась только сила сокращения сосудов (Belik et al., 2005; Ekman et al., 2005). Такой подход позволил нам адекватно оценить изменения Са -чувствительности сократительного аппарата сосудов под действием ингибиторов Rho-киназы и протеинкиназы С. Важно, что исследование роли этих сигнальных киназ проводилось нами в артериях с интактной, а не пермеабилизированной, как ранее (Akopov et al., 1998), гладкой мышцей, что важно для сохранения в клетках ключевых регуляторных белков.
Наконец, в данной работе впервые исследовано сайт-специфическое фосфорилирование основной мишени Rho-киназы - MYPT (регуляторной субъединицы ФЛЦМ) в сосудах взрослых и новорожденных животных. Такой подход позволил нам оценить базальную активность Rho-киназы и ее изменения при активирующих воздействиях, что оказалось очень важным для интерпретации результатов, полученных при исследовании функциональных характеристик гладкой мышцы сосудов.
Целью данной работы являлось сравнительное исследование участия Rho-киназы и протеинкиназы С в регуляции сокращения подкожной артерии у новорожденных (в возрасте 5-10 дней) и взрослых (в возрасте 2,5 - 3,5 мес.) крыс.
В работе решались следующие задачи:
исследовать вклад Rho-киназы и протеинкиназы С в сокращение сосудов новорожденных и взрослых крыс при активации аі-адренорецепторов;
исследовать участие Rho-киназы и протеинкиназы С в сокращении сосоудов новорожденных и взрослых крыс при деполяризации гладкой мышцы;
оценить при этих воздействиях активность Rho-киназы в гладкой мышце новорожденных и взрослых крыс по изменению фосфорилирования регуляторной субъединицы ФЛЦМ (MYPT) по сайтам Thr696 и Thr850.
Научная новизна работы.
Впервые исследованы механизмы регуляции Са -чувствительности сокращения гладкой мышцы для периферических артерий большого круга кровообращения новорожденных крыс, у которых динамика созревания гладкой мышцы сосудов сходна с таковой у человека. Исследование проведено на сосуде с интактной гладкой мышцей, что имеет несомненное преимущество, поскольку пермеабилизация гладкомышечных клеток сопряжена с изменением их белкового состава. Полученные результаты однозначно свидетельствуют о ведущей роли Rho-киназы в регуляции сокращения сосудов новорожденных крыс как при активации аі-адренорецепторов, так и при К -деполяризации.
Впервые установлено, что весомый вклад Rho-киназы в регуляцию сокращения сосудов новорожденных крыс проявляется в увеличении степени сайт-специфического фосфорилирования регуляторной субъединицы ФЛЦМ -
9+
MYPT. Такой комплексный анализ участия Rho-киназы в регуляции Са -чувствительности гладкой мышцы сосудов новорожденных и взрослых крыс, как в данной работе, ранее не проводился.
- Впервые показано, что в гладкой мышце новорожденных крыс активация
_|_ -Л_|_
Rho-киназы при К -деполяризации не зависит от изменения [Са ]і.
- С использованием двух взаимодополняющих подходов - селективной
блокады каналов и их активации К -деполяризацией - установлено, что в
сосудах взрослых крыс Rho-киназа регулирует активность Са каналов L-типа.
Практическая значимость работы. Значимость работы для фундаментальной и практической медицины обусловлена необходимостью разработки новых способов коррекции гипертонуса кровеносных сосудов при различных регуляторных расстройствах. Как известно, у преждевременно рожденных детей существует высокий риск развития артериальной гипертензии как в первые дни и месяцы после рождения (Fanaroff, Fanaroff, 2006), так и на более отдаленных этапах постнатального онтогенеза (Johansson et. al., 2005). В данной работе обнаружены существенные различия механизмов регуляции сокращения сосудов у новорожденных и взрослых животных, что говорит о необходимости использования разных подходов для коррекции сосудистых нарушений на
разных этапах постнатального онтогенеза. Основываясь на полученных в данной работе результатах, можно предположить, что для коррекции тонуса развивающейся гладкой мышцы нужно использовать фармакологические препараты, действие которых направлено на сигнальные пути, регулирующие Са -чувствительность сокращения, тогда как в зрелой гладкой мышце вероятной мишенью для терапии является Са -зависимый путь сокращения.
Основные положения, выносимые на защиту.
Высокая Са -чувствительность сократительного аппарата гладкой мышцы артериальных сосудов на ранних этапах постнатального онтогенеза в основном обусловлена высокой активностью Rho-киназы; вклад протеинкиназы С намного меньше.
В раннем постнатальном периоде Rho-киназа регулирует в основном Са -чувствительность сокращения гладкой мышцы сосудов, тогда как во взрослом организме она может влиять и на Са -гомеостаз гладкомышечных клеток путем активации потенциалзависимых Са каналов L-типа.
Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (Пущино, 2006, 2010); на Международной конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы» (Донецк-Славянск, Украина, 2007); на XX съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); на V и VII Всероссийских конференциях с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2007, 2009), на XXXVII Европейской мышечной конференции (Оксфорд, Великобритания, 2008), на Ежегодном съезде Скандинавского физиологического общества 2008 (Оулу, Финляндия, 2008), на IX Всероссийской научно-теоретической конференции «Физиологические механизмы адаптации растущего организма» (Казань, 2008); на XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2009" (Москва, 2009); на VI Конгрессе международного общества по автономной нервной системе (Сидней, Австралия, 2009); на Съезде Немецкого и Скандинавского физиологических обществ (Копенгаген, Дания, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликована 1 статья и 15 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения полученных данных, заключения и выводов. Список литературы включает 155 источников. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 34 рисунками.
