Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Мембранные белки клеток иммунной системы 9
1.1.1. Мембранная форма CD4 протеина 11
1.1.2. Мембранная форма CD8 протеина 11
1.1.3. Мембранная форма CD22 протеина 12
1.1.4. Мембранная форма CD25 протеина 13
1.1.5. Мембранная форма CD71 протеина 14
1.1.6. Мембранная форма молекулы HLA II класса 15
1.1.7. Мембранная форма молекулы HLA I класса 15
1.1.8. Мембранная форма белка CD95 16
1.2. Противоопухолевый иммунитет 16
1.2.1. Опухолевые антигены 18
1.2.2. Механизмы ухода опухоли от иммунологического надзора 22
1.3. Растворимые формы мембранных белков клеток иммунной системы 24
1.3.1. Растворимая форма молекулы HLA I класса 27
1.3.2. Растворимая форма Fas (CD95) протеина 29
1.4. Роль CD95 протеина в механизме программируемой клеточной гибели 30
2. Материалы и методы 38
3. Результаты и обсуждение 50
3.1. Исследование сывороточного содержания белка sCD95 при неопластических процессах различной этиологии 50
3.2. Оценка уровня sCD95 протеина на разных стадиях опухолевого процесса при карциноме молочной железы 53
3.3. Уровень sCD95 протеина в сыворотке крови больных раком молочной железы при противоопухолевой терапии 63
3.4. Оценка уровня sHLA-I протеинов при опухолевых процессах различной этиологии 69
3.5. Оценка уровня sHLA-I при карциноме молочной железы 75
3.6. Иммунофенотип лимфоцитов периферической крови на разных стадиях карциномы молочной железы 84
3.7. Анализ взаимосвязи между мембранной, сывороточной экспрессией молекул CD95, HLA-I и уровнем опухолеспецифических белков при раке молочной железы 95
Заключение 102
Выводы 111
Список цитированной литературы 112
- Мембранная форма CD22 протеина
- Механизмы ухода опухоли от иммунологического надзора
- Исследование сывороточного содержания белка sCD95 при неопластических процессах различной этиологии
- Оценка уровня sHLA-I протеинов при опухолевых процессах различной этиологии
Мембранная форма CD22 протеина
Гликопротеин CD22 является поверхностным гликопротеином и входит в состав В-клеточного рецепторного комплекса (BCR). Внеклеточная часть CD22 содержит семь иммуноглобулинподобных доменов, два последних ответственны за соединение с сиалированными лигандами, экспрессируемыми на эпителиальных, эндотелиальных, В- и Т-клетках. Эндоплазматический хвост CD22 содержит 6 тирозиновых остатков, которые фосфорилируются при объединении в BCR [94]. Идентифицированы две изоформы CD22: белки с молекулярной массой 110 и 130 кДа, обозначенные как CD22a и CD22(3, соответственно. CD22a в отличии от CD22p содержит не 7 , а только 5 внеклеточных доменов.
CD22 экспрессируется на В-клетках и на раковых клетках, происходящих от В-клеток [128]. Связывая различные сигнальные молекулы, CD22 влияет на передачу сигнала от BCR. CD22 функционирует прежде всего как отрицательный регулятор передачи сигнала от BCR в клетки. Но есть данные о том, что CD22 может быть и положительным регулятором передачи сигнала (возможно в этом участвуют нефосфорилированные остатки тирозина в эндоцитоплазматическом хвосте) [94].
Одним из наиболее изученных поверхностных активационных антигенов лимфоцитов является белок CD25. Гликопротеин CD25 (IL-2R, Тас антиген) трансмембранный белок I класса с молекулярной массой 55 кДа (272 аминокислоты), N-концевая аминокислота смотрит во внеклеточное пространство, С-конец локализован в цитоплазме. Член суперсемейства CD25 рецептора [150]. Он представляет собой а цепь (низкоаффинную) рецептора к интерлейкину-2 (высокоаффинный рецептор состоит из а, (3 и у цепей- CD25, CD122 и CD132 антигенов, соответственно). CD25 также экспрессируется на лимфоцитах периферической крови и его экспрессия резко повышается на активированных Т-лимфоцитах под воздействием ФГА. На В-лимфоцитах экспрессия CD25 возрастает при стимуляции последних антителами против иммуноглобулинов класса М. Кроме этого, CD25 можно выявить на моноцитах/макрофагах после их стимуляции бактериальными липополисахаридами. Очень высокую экспрессию CD25 наблюдают у HTLV-I трансформированных линий Т-лимфоцитов [147]. CD25 протеин появляется на мембране клетки до начала синтеза ДНК и его условно относят к "ранним" активационным антигенам [65; 99]. 1.1.5. Мембранная форма CD71 протеина Белок CD71 (Т9, transferrin receptor) - мембранный гликопротеин II класса с молекулярной массой 90-95 кДа (760 аминокислот), представляющий собой гомодимер, связанный дисульфидными мостиками [133]. Он состоит из внеклеточного С-концевого участка (671 аминокислота), связывающего трансферрин, трансмембранного (28 аминокислот) домена и N-терминального внутриклеточного (61 аминокислота) хвоста, обеспечивающего эндоцитоз и рециркуляцию железа [53]. CD71 является рецептором трансферрина, при этом внеклеточный домен CD71 может одновременно связывать две молекулы сывороточного трасферрина, регулируя, таким образом, содержание ионов железа внутри клетки посредством рецептор-опосредуемого эндоцитоза. При этом железосодержащий белок трансферрин связывается с CD71 при нейтральном рН и интернализируется в цитоплазму, где равновесие сдвинуто в кислую сторону (рН около 5,0). При кислых значениях рН железо освобождается и транспортируется в цитоплазму. Свободный от железа апотрансферрин, связанный с CD71, при рН 5,0 возвращается на мембрану клетки, где при рН 7,4 теряет аффинитет к рецептору и возвращается в циркуляцию [144].
CD71 экспрессируется на эндотелии капилляров мозга и на всех пролиферирующих клетках. Плотность экспрессии отражает потребность клеток в железе. CD71 выявляется на лимфоцитах периферической крови, но экспрессия CD71 у неактивированных лимфоцитов низка и значительно возрастает в ответ на митогенную или антигенную стимуляцию на этапе пролиферации. Антитела против CD71 блокируют пролиферацию лимфоцитов [143]. Экспрессия рецептора к трансферрину следует по времени после экспрессии рецептора к интерлейкину-2 и необходима для клетки, чтобы препятствовать переходу из Gi в S-фазу, запуская, таким образом, синтез ДНК. CD71 протеин считается ранним активационным антигеном.
HLA-DR - молекула гистосовместимости II класса - является гетеродимером, состоящим из а и (3-цепей с молекулярной массой 33 кДа и 29 кДа, соответственно. Только в комплексе с продуктами HLA II класса антигены распознаются рецептором Т-хелперов. При этом вспомогательная молекула CD4 является лигандом молекулы HLA II класса ((3-цепи). HLA-DR экспрессируется на антигенпрезентирующих клетках (дендритных клетках, В-лимфоцитах, моноцитах/макрофагах) и некоторых других клетках. Экспрессия молекул HLA II класса активно регулируется у-интерфероном, который вызывает экспрессию последних на фибробластах, эпителиальных и эндотелиальных клетках [53]. У человека молекулы МНС II экспрессируются на активированных В-лимфоцитах и части активированных Т-хелперов.
Механизмы ухода опухоли от иммунологического надзора
Основная группа защитных приспособлений опухолевых клеток от действия иммунных реакций связана с затрудненным распознаванием опухолевых агентов. 1. Опухолевые клетки слабо экспрессируют или не экспрессируют совсем молекулы МНС I класса, необходимые для распознавания антигенных мембранных пептидов цитотоксическими CD8 Т-клетками. Однако утрата мембранных молекул Ї класса делает опухоли чувствительными к атаке NK-клеток. Оптимальным для опухолевых клеток является промежуточное "решение": утрата молекул МНС I класса только некоторых типов (например, HLA-A, наиболее часто используемых для презентации опухолевого антигенного пептида) при сохранности других типов молекул. 2. Опухоли не экспрессируют молекулы CD80 и CD86 (В7-1 и В7-2), распознаваемые корецептором CD28. Без сигнала, поступающего с корецептора, вместо активации развивается анергия Т-клетки. 3. В случае, если опухолевый антиген индуцирует образование антител, то последние не только не повреждают опухолевые клетки, а защищают их от действия иммунных Т-лимфоцитов. Элиминацию опухолевых антигенов осуществляют и клеточные и гуморальные факторы иммунной системы. Однако их роль в этом неоднозначна. Ведущее значение отводится системе клеточного иммунитета, в то время как специфические гуморальные факторы при определенных условиях оказывают протективный эффект по отношению к опухолям, способствуя их росту. Такое явление носит название иммунологического усиления [45]. 4. Феномен модуляции мембранных антигенов опухолевых клеток, суть которого состоит в том, что связывание антител с мембранным антигеном приводит к погружению образующегося комплекса внутрь клетки. При этом ресинтез мембранного антигена не происходит, пока в среде, окружающей клетку, присутствуют антитела. 5. Опухолевые клетки выделяют растворимые формы мембранных антигенов путем протеолитического отщепления с мембраны или синтеза секреторного варианта антигена. Растворимый антиген перехватывает специфические эффекторные факторы - связывает антитела, возможно блокирует цитотоксические клетки. 6. Гены опухолевых клеток мутируют, и в условиях появления специфических факторов (антител, цитотоксических клеток) отбираются варианты, несущие мутантные антигены, с которыми эти факторы не реагируют. Помимо механизмов "ускользания", связанных с маскировкой антигена и дефицитом сопутствующих молекул, существуют механизмы защиты опухолевых клеток, основанные на индукции иммуносупрессии. 7. Опухолевые клетки выделяют цитокины, многие из которых подавляют иммунный ответ и снижают активность сформировавшихся иммунных механизмов. Среди этих продуктов указанную функцию могут выполнять трансформирующие факторы роста а и Ь, ИЛ-10, простагландин Е2. 8. Формируется иммунологическая толерантность к опухолевму антигену. Это может быть периферический вариант толерантности. В его реализации, вероятнее всего, ведущую роль играют растворимые формы опухолевого антигена, индуцирующие низкодозную толерантность. 9. Активируются супрессорные клетки. Их природа неизвестна. Возможно это макрофаги и Т-лимфоциты, включая гипотетические вето-клетки. Однако современный взгляд на регуляцию иммунного ответа позволяет предположить, что роль супрессоров могут выполнять Тп2-клетки. Дело в том, что противоопухолевая защита, связанная с развитием цитотоксического ответа, зависит от активации ТЫ-клеток и контролируется ими. В таком случае их антогонисты ТЬ2-клетки могут выступать в качестве супрессоров. Частично роль Тп2-лимфоцитов берут на себя сами опухолевые клетки, вырабатывая цитокины, являющиеся характерными продуктами Тп2-клеток: ИЛ-10 и 6 [48]. Долгое время изучение экспрессии антигенов проводили, определяя их на мембране различных типов клеток. Очень часто синонимом термина "дифференцировочный антиген" выступает понятие "рецептор". Ситуация казалась настолько понятной, что в определении понятия "рецептор" даже заложено - это поверхностные молекулы клеток [15].
Однако в 1980 году впервые было показано, что поверхностные белки иммунокомпетентных клеток, при некоторых патологических состояниях, могут быть выявлены в сыворотке крови [54]. В дальнейших исследованиях удалось установить, что и у здорового человека можно выявить определенный уровень растворимых форм мембранных клеточных белков, и не только в крови, но и других биологических жидкостях. В норме содержание сывороточных форм дифференцировочных антигенов может колебаться от следовых количеств до нескольких сотен нанограмм в миллилитре крови, что позволяет при наличии соответствующих моноклональных антител выявить эти антигены с помощью иммуноферментного анализа. Растворимые формы поверхностных протеинов образуются двумя основными путями. Первый путь - протеолитическая обработка ("сбрасывание") первоначально связанных с мембраной белков. Данный механизм обозначается термином "шеддинг" (от английского "shed" - терять). Вторым путем является изначальный синтез в виде внеклеточной формы, который происходит за счет альтернативного сплайсинга информационной РНК, кодирующей данный белок. Растворимая молекула характеризуется отсутствием внутриклеточного и трансмембранных доменов и, как правило, имеет меньшую молекулярную массу, чем мембранная форма. Известны примеры, когда оба механизма участвуют в образовании растворимых форм. Так, растворимая форма рецептора интерлейкина-6 (CD126) может образовываться как за счет сплайсинга, так и за счет шеддинга. В тоже время растворимая форма рецептора фактора стволовых клеток (c-kit, CD1 17-антиген) появляется за счет последовательного включения альтернативного сплайсинга и протеолиза [26]. В этом случае за счет альтернативного сплайсинга в участок полипептидной цепи между внеклеточным и трансмембранным участком включается 4 добавочных аминокислоты, что делает молекулу CD1 17 антигена доступной в этом месте протеолитическому расщеплению, в результате чего образуется растворимая форма.
Исследование сывороточного содержания белка sCD95 при неопластических процессах различной этиологии
Физиологическим механизмом, уравновешивающим пролиферацию клеток, является апоптоз - программируемая клеточная гибель. Одним из основных клеточных рецепторов, через который в клетку проводится апоптотический сигнал, является белок CD95 (Fas-антиген).
Белок CD95 экспрессируется на многих типах клеток, в том числе на злокачественно трансформированных клетках и клетках иммунной системы, в частности, на активированных Т-лимфоцитах. Известна растворимая форма CD95 протеина, способная ингибировать апоптоз, связываясь с Fas-лигандом или вмешиваясь в формирование на мембране клетки функционально полноценного тримера молекулы CD95 [33]. Отклонения от физиологической концентрации sCD95 протеина могут приводить к модуляции апоптотических процессов, в том числе и при неоплазиях.
С помощью иммуноферментного метода с применением моноклональных антител к CD95 протеину нами определен сывороточный уровень этого белка при опухолевых процессах разной этиологии.
При лимфоцитарной лимфоме сывороточное содержание sCD95 повышалось в среднем на 31 %, однако, в сравнении с нормой различия не были статистически значимыми (Рис. 1).
Множественная миелома характеризовалась более выраженным повышением сывороточной концентрации sCD95 протеина. Если в норме его содержание равнялось 401,0±17,8 U/ml, то при множественной миеломе среднее содержание тестируемого белка увеличивалось до 845,2+247,4 U/ml. Несмотря на повышение средней концентрации sCD95 более чем вдвое, различия с нормой оставались статистически недостоверными вследствие широкого разброса индивидуальных концентраций sCD95 протеина. Вероятно, это связано как с показанной ранее индивидуальной вариабельностью данного показателя [31; 10], так и с гетерогенностью исследуемой группы больных, находящихся на разных стадиях прогрессирования неопластического процесса.
При хроническом лимфолейкозе средняя сывороточная концентрация sCD95 протеина увеличивалась по сравнению с контролем в 2,4 раза, достигая 952,0±222,1 U/ml (р 0,05). При лимфогранулематозе содержание sCD95 повышалось в 1,9 раза до величины 771,3±64,7 U/ml, повышение было статистически значимым. Исследование сывороточного уровня белка sCD95 при солидных опухолях также обнаружило его изменение в сравнении с нормой. Так, при раке желудка он возрастал до 682,0±53,0 U/ml, что в 1,7 раза выше донорских значений (р 0,05). Рак легкого сопровождался увеличением сывороточного содержания белка sCD95 в 1,4 раза. Однако различия с нормой оказались статистически недостоверными. Значительное увеличение сывороточного уровня sCD95 протеина было зарегистрировано также при раке молочной железы. В сравнении с нормой он увеличивался на 97 % и составил 788,9±167,3 U/ml.
Таким образом, онкогематологические заболевания разного происхождения (лимфоцитарная лимфома, множественная миелома, лимфогранулематоз, хронический лимфолейкоз) характеризуются повышенным сывороточным уровнем растворимого sCD95 протеина. При первых двух типах неопластических процессов он имел тенденцию к нарастанию, однако, статистически достоверно был повышен только у больных лимфогранулематозом и хроническим лимфолейкозом. Наши данные соответствовали результатам, полученным Munker R. и др., (1997) [107].
При солидных опухолях регистрировалась несколько иная картина. При раке желудка было выявлено статистически достоверное увеличение уровня белка sCD95. Аналогичные результаты были получены Аббассовой С.Г. и др. (1999) [1]. Однако у больных раком легкого содержание sCD95 протеина повышалось статистически не достоверно. Сывороточный уровень sCD95 значительно повышался также при карциноме молочной железы.
Полученные различия в уровне растворимой формы sCD95 протеина, несомненно, отражают особенности иммунных реакций, протекающих при различных формах опухолевых процессов. При этом всегда регистрировалось повышение или тенденция к повышению сывороточного содержания sCD95 протеина. Однако, представленные в данном разделе результаты не отражают динамики изменения концентрации этого белка на разных стадиях опухолевого процесса. В связи с этим мы проанализировали более детально сывороточный уровень тестируемых антигенов при одной из неоплазий - карциноме молочной железы.
Хорошо известно, что опухолевый рост является результатом дисбаланса между пролиферацией клеток и апоптозом [1]. В рамках концепции программированной клеточной гибели объясняются многие ключевые события канцерогенеза [42]. Апоптоз - это активный, физиологически естественный процесс саморазрушения клеток, вызываемый включением внутриклеточного молекулярного механизма запрограммированной гибели [149]. В механизмах апоптоза нормальных и измененных тканей активное участие принимает ряд факторов, среди которых выделяют ключевой рецептор апоптоза CD95 -гликопротеин из семейства рецептора фактора некроза опухоли [33].
В предыдущем разделе было показано, что при таком широко распространенном заболевании как карцинома молочной железы наблюдается одно из наиболее выраженных повышений сывороточного уровня белка sCD95. В связи с этим мы провели более детальное изучение характера изменений содержания этого белка в тканях больных раком молочной железы.
Выявлено, что у впервые направленных в стационар (первичных) больных независимо от стадии заболевания, средний сывороточный уровень sCD95 протеина достоверно превышал показатели контрольной группы здоровых доноров в 2,8 раза и соответствовал величине 1129,9±131,9 U/ml.
Проведено исследование сывороточного содержания белка sCD95 на разных стадиях карциномы молочной железы. Сывороточный уровень sCD95 статистически достоверно превышал контрольный уровень в 3 раза на I стадии и достигал 1197,7+450,1 U/ml. На II стадии неопластического процесса сывороточное содержание белка sCD95 было повышено в 2,1 раза.
Различия между средним содержанием в крови sCD95 протеина на I и на II стадиях неопластического процесса были статистически не значимыми, однако, достоверно превышали норму, равную 401,0+17,8 U/ml (Рис. 2).
Оценка уровня sHLA-I протеинов при опухолевых процессах различной этиологии
Состояние иммунной системы является одним из основных факторов, определяющих динамику развития злокачественных новообразований. Циготоксические Т-лимфоциты и NK-клетки являются центральными эффекторными звеньями в реализации противоопухолевого иммунитета. Их мишенью в обоих случаях служат молекулы гистосовместимости I класса. Показано, что в условиях in vitro растворимые белки гистосовместимости I класса обладают блокирующим действием на активность цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток [58; 161]. Это свидетельствует о существовании у растворимых молекул гистосовместимости 1 класса (sHLA-І) важной физиологической роли, связанной с регуляцией иммунного ответа на неопластический процесс. Отклонение сывороточного уровня sHLA-I от нормы на фоне развития опухоли может предполагать наличие регуляторных функций у этих молекул, образующихся путем шеддинга при межклеточных контактах между рецепторами Т-клеток и NK-клеток, с одной стороны, и клетками мишенями, с другой стороны.
В связи с вышеизложенным, нами с помощью иммуноферметного метода с применением моноклональных антител (см. Раздел 2) определен сывороточный уровень sHLA-I при ряде неоплазий.
Оценка сывороточного содержания sHLA-I у больных лимфоцитарной лимфомой показала, что его усредненный уровень превышает норму в 2,5 раза (Рис. 9). Если у здоровых доноров крови его содержание равнялось 1001,5±19,6 U/ml, то у тестированных больных оно составило 2502,3±643,3 U/ml (р 0,05). Сходные данные были получены ранее зарубежными исследователями [113]. Исследование сывороточной концентрации sHLA-I при множественной миеломе также показало повышенный по сравнению с контролем уровень этих белков (2887,0±903,1 U/ml против 1001,5±19,6 U/ml, р 0,05). При анализе изменений сывороточной концентрации sHLA-I у больных хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) также было установлено достоверное превышение контрольного уровня. Среднее содержание sHLA-I составило в этом случае 2127,0±393,0 U/ml, р 0,05. При лимфогранулематозе сывороточное содержание sHLA-I повышалось в 1,8 раза до величины 1752,8±490,0 U/ml. Однако, повышение не было статистически значимым, что, вероятно, явилось следствием нередко наблюдаемого широкого разброса индивидуальных уровней этого белка [31; 10]. При раке желудка уровень sHLA-I был достоверно выше, чем его содержание в контрольной группе. Сывороточное содержание sHLA-I составляло 2768,2+506,6 U/ml, что в 2,7 раза выше нормы (р 0,05). Сывороточное содержание sHLA-I было исследовано также при раке молочной железы. Уровень sHLA-I был повышен в 1,3 раза в сравнении с нормой, однако, различия были статистически не значимы и проявлялись лишь в виде тенденции к повышению. При раке легкого наблюдалось достоверное увеличение уровня sIILA-I в среднем в 2 раза (2071,0±270,8 U/ml, р 0,05). Наиболее вероятным источником повышенных концентраций sHLA-I при неоплазиях могут быть сами опухолевые клетки, с поверхности которых возможно протеолитическое отщепление (шеддинг) sHLA-1 после контакта с эффекторной С08-Т-клеткой или NK-клеткой. Увеличенный шеддинг может быть также следствием повышенного метаболизма злокачественно трансформированных клеток и направленного сбрасывания во внеклеточное пространство молекул гистосовместимости I класса. Известно, что опухолевые клетки характеризуются пониженным уровнем мембранной экспрессии молекул гистосовместимости I класса. Можно предположить, что одним из механизмов понижения экспрессии мембранных молекул HLA I класса является их повышенный шеддинг. В таком случае количество опухолевых клеток или опухолевая масса должны совпадать с уровнем sHLA-I в сыворотке крови. Чтобы проверить данное предположение в совместных исследованиях с А.К. Голенковым и др. мы проанализировали при ХЛЛ и множественной миеломе связь уровня sHLA-I с массой опухолевых клеток. Средняя масса опухолевых клеток у 8 обследованных больных хроническим лимфолейкозом соответствовала 15,3 баллам (см. раздел 2 "Материалы и методы"). В группу больных с массой опухоли больше среднего значения были включены трое больных. Массу опухоли меньше среднего значения имели 5 больных. Как следует из табл. 2, сывороточное содержание sHLA-I в первой группе больных в 2,9 раза превышало относительную концентрацию sHLA-I в сыворотке крови больных второй группы (р 0,05). При этом, как в первой, так и во второй группах сывороточный уровень sHLA-I превышал норму. Такие же результаты были получены при анализе сывороточного содержания sHLA-I при множественной миеломе. Средняя масса опухолевых клеток у 14 обследованных больных соответствовала в данном случае 11,1 балла. В группу с повышенной опухолевой массой вошло 5 больных (15,5 ±0,4 балла). Сывороточное содержание sHLA-I у них равнялась 3484+1057 U/ml, что в 2,4 раза больше, чем у 9 больных с опухолевой массой меньше среднего значения (р 0,05).
Проведенный анализ показал, что при хроническом лимфолейкозе и множественной миеломе уровень sHLA-1 повышается по мере нарастания опухолевой массы. Это является свидетельством того, что источником sHLA-I, по крайней мере, при таких неоплазиях, как хронический лимфолейкоз и множественная миелома являются опухолевые клетки.
![Роль эндогенной интоксикации в нарушении гомеостаза организма человека при хронических дерматозах [Электронный ресурс]](/i/i/4437/209768.png "Роль эндогенной интоксикации в нарушении гомеостаза организма человека при хронических дерматозах [Электронный ресурс] Анненкова Анна Борисовна")
