Содержание к диссертации
Введение 4
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Внутриклеточный метаболизм цАМФ 7
1.1.1. G-белок сопряженные рецепторы и G-белки 8
1.1.1.1 Рецепторы серотонина 11
Аденилатциклазы 12
Фосфодиэстеразы 14
1.2. Внутриклеточные мишени цАМФ 16
Стуктура цАМФ-связывающих белков 17
цАМФ-зависимая протеинкиназа А 18
Каналы активируемые циклическими нуклеотидами 20
Семейство EPAC/cAMP-GEF 21
Белки CRP/CAP 24
1.3. Фармакологические агенты, направленно действующие на компоненты
цАМФ сигнального пути 25
Аналоги цАМФ 25
Ингибиторы, направленные на каталитическую субъединицу протеинкиназы А 27
1.4. Физиологические функции цАМФ 28
1.4.1. Регуляция протеинкиназой А функционирования органов и
внутриклеточных процессов 28
Регуляция метаболизма в адипоцитах 28
Регуляция иммунного ответа 29
Передача сигнала цАМФ в ядро и регуляция экспресии генов 30
Регуляция сердечной деятельности у млекопитающих 31
Регуляция сердечной деятельности у моллюсков 33
Регуляция сократимости гладких мышц. Пример взаимодействия между цАМФ- и цГМФ- сигнальными путями 34
1.4.2. Роль белков Ерас в проявлении действия цАМФ на клетки 38
Опосредованная белками Ерас цАМФ-зависимая регуляция функционирования ионных каналов .' 38
Роль белков Ерас в регуляции внутриклеточных Са2+-сигналов...40
Процессы ионного транспорта регулируемые белками Ерас 42
1.4.2.4. Ерас связывает выработку цАМФ со стимуляцией экзоцитоза 43
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 47
Выделение изолированной аорты и измерение силы изометрического сокращения сосудов 47
Измерение амплитуды сокращений изолированного сердца виноградной улитки Н. pomatia 49
Измерение активности аденилатциклазы в препаратах мембраны сердца виноградной улитки 51
2.4. Измерение агрегации тромбоцитов по методу Борна 54
2.4.1. Получение плазмы крови, обогащенной тромбоцитами (PRP -
platelet rich plasma) ; 54
2.4.2.Измерение агрегации тромбоцитов 54
2.5. Измерение концентрации цитоплазматического кальция с помощью
флуоресцентного зонда фура-2 55
2.5.1.Выделение гладкомышечных клеток из аорты крысы 55
Криоконсервация гладкомышечных клеток, выделенных из аорты крысы 57
Подготовка стекол для экспериментов с гладкомышечными клетками из аорты крысы 58
Измерение концентрации цитоплазматического кальция с помощью флуоресцентного зонда фура-2 58
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 60
3.1. Исследование механизмов расслабления сосудов под действием
цАМФ 60
Влияние на сократимость изолированной аорты вазоактивных агонистов 60
Влияние форсколина и аналогов цАМФ, активирующих белки Ерас и протеинкиназу А, на сократимость изолированной аорты крысы 61
Исследование влияния цАМФ на повышение концентрации кальция в гладкомышечных клетках сосудов под действием серотонина 69
Регуляция сократимости сердца виноградной улитки H.pomatia. Исследование механизмов действия цАМФ 70
цАМФ зависимые механизмы регуляции сердечной сократимости71 3.3.1.1. Исследование роли протеинкиназы А и белков Ерас в проявлении активирующего действия цАМФ на сократимость сердца 73
Активация сокращения сердца улитки серотонином через рецепторы, не сопряженные с аденилатциклазой 74
цАМФ независимый механизм регуляции сократимости сердца улитки 76
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 83
ВЫВОДЫ ..87
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 88
Благодарности: 89
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 90
Введение к работе
Актуальность проблемы. цАМФ был открыт в конце 50-х годов прошлого века как вторичный посредник, передающий сигналы в клетке от множества гормонов, неиротрансмиттеров, простагландинов, ряда других субстанций, которые активируют аденилатциклазу. До недавнего времени считалось, что универсальным механизмом действия цАМФ является активация протеинкиназы А. Помимо протеинкиназы А в сетчатке, нейронах, некоторых других клетках и тканях функционируют ионные каналы плазматической мембраны, связывающие цАМФ. В 1998 г. были обнаружены новые внутриклеточные мишени цАМФ - белки Epacl и Ерас2 (Exchange Proteins Activated by с AMP). Они широко распространены в организме и, по крайней, мере один из этих белков, Epacl, выявлен во всех исследованных тканях. Связывая цАМФ, белки Ерас взаимодействуют с низкомолекулярными G-белками RaplA/2B и стимулируют замещение ГДФ на ГТФ в их регуляторном центре, поэтому их обозначают также как сАМР-GEF (guanine nucleotide exchange factor). Белки Rap активируют протеинкиназу B-Raf, которая, в свою очередь, активирует протеинкиназный каскад MEK/Erk. Несколько позднее было установлено, что помимо Rap, белки Ерас активируют специфичную к фосфоинозитидам фосфолипазу С-є, Кдтр-каналы, влияют на функционирование хлорных каналов [Holz, 2006]. В кардиомиоцитах мыши выявлен макромолекулярный комплекс Epacl с рианодиновыми рецепторами, каркасным белком гпАКАР, протеинкиназой А и фосфодиэстеразой цАМФ [Pare et al., 2005].
Изучение роли белков Ерас в регуляции цАМФ-зависимых физиологических процессов находится на начальной стадии. Показано, что, наряду с протеинкиназой А, белки Ерас активируют секрецию, влияют на межклеточные взаимодействия, процессы дифференцировки и апоптоза, принимают участие в регуляции ионных каналов и передачи сигнала в синапсе [Holz et al., 2006]. цАМФ играет ключевую роль в регуляции работы
сердца и всей сердечно-сосудистой системы, вызывая расслабление кровеносных сосудов [Kotlikoff and Kamm, 1996] и стимуляцию сократимости сердца [Kammerer et al., 2003]. Доказано, что в реализации этих эффектов цАМФ участвует протеинкиназа А, однако роль белков Ерас в проявлении действия цАМФ на сосуды и сердце не исследовалась.
Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению механизмов цАМФ-зависимой регуляции сократимости сосудов и сердца и выяснению роли белков Ерас в проявлении действия цАМФ на эти органы. В работы были поставлены следующие задачи:
Определить, участвуют ли белки Ерас в цАМФ-зависимой регуляции сосудистого тонуса.
Оценить специфичность действия аналогов цАМФ, использованных для активации белков Ерас.
Исследовать влияние цАМФ на кальциевый обмен в культивируемых гладкомышечных клетках аорты крысы.
Оценить роль белков Ерас и протеинкиназы А в цАМФ-опосредованной регуляции сократимости сердца, используя в качестве модели изолированное сердце виноградной улитки Helix pomatia.
Исследовать на модели изолированного сердца виноградной улитки цАМФ-независимые пути активации сердечной сократимости.
Научная новизна и практическая значимость работы. Установлено, что расслабление аорты крысы, вызванное цАМФ, опосредовано активацией не только протеинкиназы А, но и белков Ерас. Показано, что одним из механизмов цАМФ-индуцированного расслабления кровеносных сосудов является подавление повышения концентрации ионов кальция в цитоплазме гладкомышечных клеток в ответ на вазоконстрикторные стимулы.
Показано, что подавление под влиянием цАМФ агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, опосредовано протеинкиназой А без участия белков Ерас.
Обнаружено, что активаторы белков Ерас и протеинкиназы А увеличивают амплитуду вызванного серотонином сокращения сердца виноградной улитки Helix pomatia. Это свидетельствует об участии данных мишеней цАМФ в регуляции сократимости сердца. Установлено, что активация сократимости сердца виноградной улитки H.pomatia, вызванная серотонином, опосредована двумя видами рецепторов. Рецепторы одного вида сопряжены с аденилатциклазой и повышают уровень цАМФ. Второй вид подобен 5НТз-рецепторам, относящимся к типу ионотропных рецепторов. Через них серотонин активирует сердце виноградной улитки по цАМФ-независимому механизму.
Установлено, что цАМФ-независимый механизм реализуется при активации сокращений сердца виноградной улитки тромбином. Полученные данные свидетельствуют, что тромбин активирует в сердце улитки рецепторы,, гомологичные активируемым протеазами рецепторам 1-го и 4-го типов млекопитающих.
Проведенные исследования расширяют представления о биохимических основах работы сердечно-сосудистой системы. Они создают предпосылки для более детального изучения механизмов действия на сосуды и сердце гормонов и нейротрансмиттеров, связывающихся с рецепторами, активирующими аденилатциклазу. Полученные результаты могут иметь значение при разработке научно обоснованных подходов к лечению сердечнососудистых заболеваний, поскольку многие фармакологические препараты, влияющие на сердце и сосуды, оказывают свое действие через систему обмена цАМФ.
Публикация и апробация работы. По теме диссертации опубликованы 2 статьи. Результаты диссертации были представлены на 13-м международном совещании по эволюционной физиологии (СПб, 2006), на Международной конференции по простым нервным системам (Казань, 2006) и на конференциях молодых ученых ИБР РАН (2005,2006).
