Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 12
2.1. Анатомическая организация базального крупноклеточного ядра 12
2.1.1. Морфологическая и медиаторная характеристика нейронов базального крупноклеточного ядра 14
2.1.2. Медиаторная сенситивность нейронов базального крупноклеточного ядра 15
2.1.3 Проекции базального крупноклеточного ядра 17
2.1.4. Афферентные проекции к нейронам базального крупноклеточного ядра 22
2.2. Электрофизиологические свойства нейронов базального крупноклеточного ядра 27
2.3. Связь активности нейронов базального крупноклеточного ядра с корковой активацией 29
2.4. Активность нейронов базального крупноклеточного ядра 36
2.5. Участие базального крупноклеточного ядра в когнитивных процессах 37
2.5.1. Нарушения когнитивных функций, связанные с разрушением базального крупноклеточного ядра 37
2.5.2. Изменения нейронной активности базального крупноклеточного ядра, связанные с обучением 41
2.5.3. Участие нейронов базального крупноклеточного ядра в пластичности коры головного мозга 43
2.6. Нарушения центральной холинергической системы 49
3. Методика 52
3.1. Операция по вживлению и установке регистрирующих и стимулирующих электродов 52
3.2. Аппаратура и регистрация 55
3.3. Регистрация электроэнцефалограммы и нейронной активности при различных уровнях бодрствования кролика 58
3.4. Выработка пищевого условного рефлекса с болевой коррекцией 58
3.5.Формирование условнорефлекторного переключения 60
3.6. Реализация парадигмы "пассивный одд-болл" 60
3.7.0бработка данных 63
3.8. Физиологический и гистологический контроль локализации регистрирующих микроэлектродов 65
4. Результаты исследований 68
4.1. Характеристика спонтанной активности нейронов базального крупноклеточного ядра 68
4.2. Связь активности нейронов базального крупноклеточного ядра с электроэнцефалографической активностью коры больших полушарий мозга 68
4.2.1. Корреляция частоты разряда нейронов базального крупноклеточного ядра с мощностью дельта-диапазона электроэнцефалограммы 69
4.3. Активность нейронов базального крупноклеточного ядра в ответ на предъявление индифферентных звуковых стимулов 77
4.3.1. Реактивность нейронов базального крупноклеточного ядра к звуковым стимулам 78
4.3.2. Зависимость выраженности ответа нейронов базального крупноклеточного ядра от высоты предъявляемого стимула 80
4.3.3. Зависимость выраженности Р300 от высоты предъявляемого стимула 82
4.4. Суммарная активность коры головного мозга и активность нейронов базального крупноклеточного ядра при выработке классического оборонительного условного рефлекса 85
4.4.1. Суммарная активность коры головного мозга при выработке классического оборонительного условного рефлекса 85
4.4.2. Активность нейронов базального крупноклеточного ядра при выработке классического оборонительного условного рефлекса 86
4.5. Суммарная активность коры головного мозга и активность нейронов базального крупноклеточного ядра при реализации инструментального условного рефлекса 88
4.5.1. Реактивность нейронов базального крупноклеточного ядра к условному стимулу при реализации инструментального условного рефлекса 89
4.5.2. Суммарная активность коры головного мозга активность нейронов базального крупноклеточного ядра при выполнении и пропуске инструментальной реакции 91
4.6. Суммарная активность коры головного мозга и активность нейронов базального крупноклеточного ядра при условнорефлекторном переключении 93
4.6.1. Суммарная активность коры головного мозга при условнорефлекторном переключении 93
4.6.2. Активность нейронов базального крупноклеточного ядра при условнорефлекторном переключении 94
4.6.3. Активность нейронов базального крупноклеточного ядра при правильном и ошибочном выполнении инструментальной реакции 96
4.7. Суммарная активность коры головного мозга и активность нейронов базального крупноклеточного ядра при реализации парадигмы "пассивный одд-болли 98
4.7.1. Электроэнцефалографическая активность коры больших полушарий мозга при реализации парадигмы "пассивный одд-болл"... 98
4.7.2. Р300 при реализации парадигмы "пассивный одд-болл" 99
4.7.3. Фоновая активность нейронов базального крупноклеточного ядра при реализации парадигмы "пассивный одд-болл" 103
4.7.4. Вызванная активность нейронов базального крупноклеточного ядра при реализации парадигмы "пассивный одд-болл" 104
4.7.5. Сонаправленность изменений нейронной активности и амплитуды РЗОО 110
5. Обсуждение 112
6. Выводы 126
Список литературы 128
- Медиаторная сенситивность нейронов базального крупноклеточного ядра
- Нарушения когнитивных функций, связанные с разрушением базального крупноклеточного ядра
- Операция по вживлению и установке регистрирующих и стимулирующих электродов
- Корреляция частоты разряда нейронов базального крупноклеточного ядра с мощностью дельта-диапазона электроэнцефалограммы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение структурных и медиаторных механизмов головного мозга, лежащих в основе условнорефлекторного обучения и связанных с ним явлений активации и внимания, представляет одно из центральных направлений современной нейрофизиологии. В контексте данной проблемы значительный интерес представляет холинергическая нейромодуляторная система основания конечного мозга, к которой принадлежит базальное крупноклеточное ядро (БКЯ), nucl. basalis magnocellularis. БКЯ (базальное ядро Мейнерта у человека) является основным источником холинергической афферентации в кору больших полушарий мозга и миндалину (Mesulam et. al., 1983). В свою очередь на нейронах БКЯ сходятся проекции от различных структур, включая проекции от ряда зон коры головного мозга, амигдалярного комплекса, гипоталамуса и из ствола мозга (Mesulam et al., 1983; Zaborszky et al., 1997; Detari et al., 1999; Gasbarri et al., 1999; Smiley et al., 1999). Источники проекций к БКЯ не являются первичными сенсорными и моторными областями, но содержат зоны конвергенции и интеграции сенсорной, моторной и висцеральной информации.
Первое описание структуры ядра было сделано в конце 19-го века Теодором Мейнертом, а изучение функций ядра началось с работ М. ДеЛонга, который в 1971 г. (DeLong, 1971) описал у обезьян клетки на нижней границе бледного шара, разряд которых был связан не с движением, а с подкреплением. С тех пор многие исследователи проявили интерес к данному ядру. Была показана определяющая роль БКЯ, рассматриваемого как наиболее ростральная часть ретикулярной формации, в процессе активации коры головного мозга и цикле сон/бодрствование (Szymusiak, McGinty, 1986; Detari, Vanderwolf, 1987; Buzsaki, Gage, 1991). В настоящее время считается общепризнанным, что БКЯ принимает участие также и в когнитивных процессах, хотя специфичность этого участия все еще остается неясной.
Особый интерес исследователей к базальному ядру Мейнерта связан также с дегенеративными процессами в нем при болезни Альцгеимера (Дамулин и др., 1999). Важно, что глубина когнитивных нарушений, возникающих при болезни Альцгеимера, положительно коррелирует со степенью поражения холинергических нейронов данного ядра (Sahakian et al., 1993). Поражения базального ядра наблюдаются и при ряде других заболеваний, таких как паркинсонизм, различные деменции, хотя поражения в этих структурах являются скорее вторичными процессами (Яхно и др., 2003).
Подавляющее большинство исследований, направленных на выявление участия БКЯ в процессах обучения, памяти и внимания, были проведены либо с помощью разрушения или временного выключения ядра, либо с помощью измерения концентрации выделившегося ацетилхолина методом микродиализа (Voytko, 1996; Everitt, Robbins, 1997; Sarter, Bruno, 2000; Himmelheber et al., 2001). Оба эти метода имеют низкое временное разрешение и не позволяют провести сравнение между различными реализациями в одном эксперименте; они также не дают возможность выделить тонические и фазические механизмы участия этих структур в обучении и внимании. Тем не менее результаты этих работ указывают на критическую роль холинергических нейронов БКЯ для выработки сложных форм условных рефлексов, в то время как простые формы обучения похоже не требуют участия БКЯ.
Микроэлектродные исследования активности нейронов, в свою очередь, показали, что реакции нейронов БКЯ в основном возникают при предъявлении биологически значимых безусловных стимулов (Richardson, DeLong, 1986; Сторожук, Зинюк, 1989), при предъявлении условных стимулов (УС) после выработки условного рефлекса (УР) - как классического, так и инструментального (Rigdon, Pirch, 1986; Сторожук, Зинюк, 1989; Richardson, DeLong, 1991; Pirch, 1993; Whalen et al., 1994; Maho et al., 1995), а также в ответ на новые, неожиданные для животного стимулы, реакции на которые быстро угасают по мере их повторения (Richardson, DeLong, 1986; Santos- Benitez et al., 1995).
P. Ричардсон и M. ДеЛонг (Richardson, DeLong, 1991b) предположили, что основное участие БКЯ в простом условнорефлекторном обучении осуществляется за счет модулирующего действия ацетилхолина на нейроны коры головного мозга. Было показано, что аппликация ацетилхолина может облегчать возбудимость (вероятность ответа на приходящий стимул) и реактивность (силу ответа) кортикальных нейронов (Woody et al., 1978; Brown, 1983). Кроме того, аппликация ацетилхолина или стимуляция БКЯ, совпадающие во времени с внешним стимулом, ведут к усилению коркового нейронного ответа и вызванного потенциала на этот стимул (Кругликов и др., 1977; Копытова и др., 1979; Tremblay et al., 1990; Bakin, Weinberger, 1996).
Анализ всей совокупности полученных данных привел ряд исследователей к представлению, что активность нейронов БКЯ вероятно связана не столько с обучением и памятью, сколько с процессами внимания, позволяющими организму выделять значимые сигналы из шума и оптимально распределять ресурсы обработки информации (Voytko, 1996; Everitt, Robbins, 1997; Sarter, Bruno, 2000). Эта гипотеза объясняет нарушение выполнения различных сложных межмодальных и пространственных дифференцировок при сохранности простых форм обучения и других форм поведения (Muir et al., 1994; Chiba et al., 1995; Turchi, Sarter, 1997). Однако эксперименты, демонстрирующие непосредственную связь нейронов БКЯ с процессами активации коры больших полушарий мозга и внимания, в настоящее время отсутствуют.
Основываясь на данных научной литературы, теоретических и экспериментальных представлениях о функциях БКЯ, мы провели исследования активности нейронов при разных формах условнорефлекторной деятельности и при реализации парадигмы необычного стимула совместно с изучением ЭЭГ коры больших полушарий, а также когнитивного компонента вызванных потенциалов (ВП) - Р300.
Целью данной работы является комплексное электрофизиологическое исследование участия БКЯ в процессах активации коры головного мозга, условнорефлекторной деятельности, а также в механизмах внимания.
Задачи исследования:
1. Изучение связи активности нейронов БКЯ с активацией коры больших полушарий мозга.
2. Изучение реактивных свойств нейронов БКЯ, ЭЭГ и вызванных потенциалов коры головного мозга при предъявлении звуковых стимулов разной высоты.
3. Изучение реактивных и пластических свойств нейронов БКЯ и ВП при выработке классического оборонительного условного рефлекса.
4. Изучение реактивных и пластических свойств нейронов БКЯ и ЭЭГ при выработке и реализации инструментального пищевого условного рефлекса.
5. Изучение реактивных и пластических свойств нейронов БКЯ и ЭЭГ при выработке и реализации условнорефлекторного переключения однородных инструментальных условных рефлексов.
6. Изучение реактивных и пластических свойств нейронов БКЯ, ЭЭГ и ВП при реализации парадигмы "пассивный одд-болл" (парадигмы необычного стимула).
Научная новизна работы. Впервые исследована фоновая и вызванная активность нейронов БКЯ при выработке и реализации пищевого инструментального рефлекса и условнорефлекторного переключения (УРП) в условиях свободного поведения животных.
Впервые активность нейронов БКЯ изучена одновременно с выделением проекционных холинергических нейронов и локальных интернейронов. При этом впервые достоверно показано, что предположительно холинергические нейроны отвечают на УС возбудительной реакцией.
Показано, что нейроны, проявившие отрицательную корреляцию частоты их разряда с мощностью дельта-диапазона ЭЭГ и имеющие активационный тип ответа на УС (предположительно холинергические нейроны), наиболее реактивны и пластичны при условнорефлекторной деятельности.
Впервые проанализирована активность нейронов БКЯ одновременно при двух УР, при этом показано, что подавляющее число нейронов (70%) одновременно вовлечено в реализацию обоих рефлексов.
Впервые проанализирована фоновая и вызванная активность нейронов БКЯ при пропуске инструментальных реакций и при выполнении ошибочных инструментальных реакций. При этом полученные нами результаты показывают, что если невыполнение инструментальной реакции сопровождается пониженным выделением ацетилхолина, то выполнение ошибочной реакции - наоборот, повышенным.
Впервые изучена активность нейронов базального крупноклеточного ядра при реализации парадигмы "пассивный одд-болл" (парадигмы необычного стимула) и последующей переделке значимости стимулов. Впервые нейронная активность БКЯ исследована одновременно с регистрацией позднего позитивного компонента Р300 вызванных слуховых потенциалов в лобных и теменных проекциях коры больших полушарий.
Впервые показано, что как амплитуда нейронных ответов в БКЯ, так и латентный период и амплитуда волны Р300 обнаруживают сходную зависимость от степени значимости и новизны стимулов. Впервые обнаружено, что после смены вероятности предъявления стимула происходит соответствующая перестройка реакций нейронов БКЯ на стимул параллельно с соответствующими изменениями амплитуды и латентносте РЗОО.
Медиаторная сенситивность нейронов базального крупноклеточного ядра
М. ДеЛонг (DeLong, 1971) впервые описал «пограничные нейроны» на вентральной границе бледного шара обезьян, которые имели регулярный разряд без каких-либо изменений во время движений. Позже предположили, что эти нейроны относятся к холинергическим нейронам безымянной субстанции (включая БКЯ), расположенной более вентрально. И. Ламур (Lamour et al., 1986) там же описал (у крыс под наркозом) нейроны, половина из которых имела тонический и очень регулярный разряд и не изменяла его в течение часов. Эти клетки не имели ритмических вспышек активности даже в ответ на умеренную тактильную стимуляцию.
Более поздние электрофизиологические исследования показали, что нейроны базального крупноклеточного ядра отвечают на предъявление подкрепляющего или аверсивного стимула, а некоторые на оба типа стимулов (Richardson, DeLong, 1991а; Maho et al.., 1995; Detari et al., 1999). И. Занг с коллегами (Zhang et al., 2002) показали, что 72% клеток БКЯ отвечают на вредящие механические раздражители, причем большинство этих клеток также отвечают на термические, химические и электрические воздействия. На крысах, находящихся в состоянии наркоза, также было показано увеличение разряда клеток БКЯ в ответ на щипание хвоста (Detari, Vanderwolf, 1987). Некоторые авторы выделили среди клеток БКЯ сенсорные и моторно-двигательные KneTKH(Santos-Benitez at all, 1995).
Кроме того, Розенблед С. и Нилссон О. (Rosenblad, Nilsson, 1993) зарегистрировали примерно 90%-е увеличение выделения АХ из БКЯ в новую кору крыс в ответ на сенсорную стимуляцию (хендлинг) и иммобилизационный стресс.
Интересные данные получили М. Бартон с соавторами (Burton et al., 1975), которые показали, что нейроны базального ядра не только отвечают на вид или запах пищи, а еще и то, что этот ответ находится в сильной зависимости от состояния голода. Основываясь на данных, что облась Ch4 по Мезуламу получает проекции из лимбической и паралимбической области мозга (Mesulam et al., 1983), они предположили, что таким образом БКЯ может влиять на поведение животного в соответствии с превалирующим эмоциональным и мотивационным статусом. В ряде работ также показано, что клетки БКЯ отвечают на новые и неожиданные стимулы (Santos-Benitez at all, 1995; Masuda et al., 1997). Таким образом, клетки БКЯ отвечают на эмоционально значимые стимулы, и их ответ зависит от текущего контекста и функционального состояния животного. В отличие от роли базального крупноклеточного ядра в процессе активации коры головного мозга и цикле сон/бодрствование его роль в когнитивных процессах, таких как обучение, память и внимание, до сих пор остается неясной.
Большинство работ, посвященных выявлению роли БКЯ в когнитивных процессах, были проведены с разрушение ОКМ и отдельно БКЯ. Результаты, полученные в таких работах, не всегда позволяют однозначно ответить на поставленный вопрос и порой бывают противоречивы. Более ранние работы были проведены с использованием электролитического разрушения или возбуждающих агентов (таблица 1). Результаты показали, что при этом происходит нарушение выполнения задач на пространственную память (Dubois et al., 1985; Nakamura, Ishihara, 1990; O connell et al., 1994; Wellman, Pelleymounter, 1999; Nieto-Escamez et al., 2002; Power, McGaugh, 2002), условнорефлекторную дифференцировку (Butt, Hodge, 1995; Wilson, Cook, 1995), нарушение пассивного и активного избегания (Nakamura, Ishihara, 1990; O connell et al., 1994; Pascual, Gonzalez, 1995; Chen, Shen, 2002; Power, McGaugh, 2002; Vale-Martinez et al., 2002) и др.
На основе этих данных было сделано предположение, что БКЯ играет ведущую роль в процессах обучения и памяти. Однако, Б. Эверитт и Т. Роббинс (Everitt, Robbins, 1997) предположили, что многие из выявленных нарушений связаны с разрушением не только холинергических нейронов БКЯ, но и нехолинергических, а также из-за разрушения структур, окружающих БКЯ. Так, по их мнению, пассивное избегание вероятнее всего было связано с разрушением холинергических связей с миндалиной. А нарушение пространственного обучения при неспецифическом разрушении БКЯ скорее всего связано с потерей паллидальных клеток. Последующие работы показали, что при разрушении с помощью иботеновой кислоты в большей степени страдают парвальбумин содержащие нейроны, большинство из которых является ГАМКергическими, а не холинергические клетки (Burk, Sarter, 2001).
Для более селективного разрушения холинергических нейронов был выбран 192 IgG-сапорин, блокатор рибосомальной активности, связанный с иммуноглобулином к фактору роста р75. Такое разрушение выявило, что в основном не происходит нарушений поведения в простых задачах, таких как Т-образный и радиальный лабиринт, пассивного избегания и простых дифференцировках (таблица 2), а страдают более сложные формы научения -сложные дифференцировки на комплексные раздражители (Chiba et al., 1999; Butt et al., 2002) и множественные пространственные дифференцировки (Leanza et al., 1996; McGaughy J., et al, 2002; Risbrough V., et al., 2002; Lehmann et al., 2003). С. Врен и P. Вилей (Wrenn, Wiley, 1998) выявили, что нарушение выполнения простых задач все же происходит, но только при очень высокой степени разрушения (порядка 75-85%), а так же при внутрижелудочковом введении 192 IgG-сапорина. Так внутрижелудочковое введение приводило к большим нарушениям, чем введение непосредственно в базальное ядро (Berger-Sweeney et al., 1994). Было показано, что при этом также происходит разрушение клеток Пуркинье мозжечка (Leanza et al., 1996; Waite et al., 1995; Berger-Sweeney et al., 1994).
Нарушения когнитивных функций, связанные с разрушением базального крупноклеточного ядра
Д. Реканзоне и др. (Recanzone et al., 1993) нашли, что присутствие естественных значимых стимулов может изменить тонотопическую организацию первичной слуховой коры у взрослых приматов. Аналогичные изменения были выявлены и в соматосенсорной коре (Allard et al., 1991). В лаборатории Вайнбергера Н. (Bakin, Weinberger, 1990; Weinberger, 1998; Miasnikov et al., 2001) было показано, что условнорефлекторное обучение со звуковым УС вызывает изменения в частотных рецептивных полях нейронов слуховой коры. При этом происходит высоко селективное увеличение ответов нейронов на УС и уменьшение на все звуковые стимулы другой частоты. В слуховой коре было обнаружено высоко селективное увеличение частоты разряда нейронов на звуковой условный стимул, связанный с положительным или отрицательным безусловным стимулом (Maho et al., 1995).
Похожие изменения в коре были обнаружены, если вместо подкрепления использовали стимуляцию БКЯ. При одновременном раздражении БКЯ и кожной стимуляции 60% нейронов соматосенсорной коры кошек показывали увеличенный ответ на те же кожные стимулы. Этот эффект мог длиться более часа (Tremblay et al., 1990). Ряд авторов (Bakin, Weinberger, 1996; Bjordahl et al., 1998; Kilgard, Merzenich, 1998; Miasnikov et al., 2001) показали, что электрическая стимуляция базального ядра, сочетаемая со звуковым стимулом, приводит к значительным преобразованиям в первичной слуховой коре у взрослых крыс. Рецептивные поля сужаются, расширяются или не изменяются в зависимости от специфических параметров используемого звукового стимула. В целом, когда сенсорную стимуляцию сочетают со стимуляцией БКЯ, происходит длительное облегчение ответов кортикальных нейронов на эти стимулы (Maho et al., 1995; Bakin, Weinberger, 1996). Аналогичный результат был получен, когда сенсорную стимуляцию заменили ионофоретической аппликацией глутамата (Tremblay et al., 1990).
В работах по разрушению БКЯ было показано, что при этом кортикальные условные ответы уменьшаются. Причем подавление ответа наблюдалось и при унилатеральном, и при билатеральном разрушении (Pirch, 1993).
Важно отметить, что в некоторых из описанных работ происходящие кортикальные изменения были чувствительны к холинергическим агонистам и антагонистам. Так, например, центральное введение холинергических антагонистов в работе П. Уолена (Whalen et al., 1994) значительно уменьшало реакцию корковых клеток на подкрепляемый стимул. Кортикальные условные ответы на УС также были подавлены после микроинъекции атропина в регистрируемую область (Rigdon, Pirch, 1986). Аппликация атропина во время стимуляции БКЯ и кожи, согласно работе Н. Тремблея с соавторами (Tremblay et al., 1990), блокировала развитие длительного облегчения ответов кортикальных клеток. Тогда как аппликация атропина после завершения сочетаний такого действия не оказывала. Наблюдалось нарушение пластических изменений слуховой коры на фоне атропина при сочетании звуковых тонов и стимуляции БКЯ (Miasnikov et al., 2001).
В поддержку гипотезы о ведущей роли АХ в кортикальной пластичности выступают работы с его непосредственной аппликацией. Реактивностью к АХ обладает большая часть нейронов новой коры, в работах Б.И. Котляра с соавторами (Котляр и др., 1986) показано, что такие нейроны вообще составляют 100%. АХ, апплицированный непосредственно на кортикальные нейроны, увеличивал частоту разряда 11 - 55% регистрируемых клеток, реже АХ уменьшал частоту разряда нейронов (Krnjevic, Phillis, 1963; Кругликов и др., 1977; Lamour et al., 1988; Metherate et al., 1988).
Кроме этого, сочетание сенсорной стимуляции с аппликацией АХ вызывает облегчение ответа на эти стимулы (Кругликов и др., 1977; Копытова и др., 1979). Ламур И. с соавторами (Lamour et al., 1988) показали, что одновременная подача АХ и соматическая стимуляция, кроме изменения в силе ответа клеток коры (количестве импульсов на стимул), также вызывали расширение или сужение рецептивных полей. Эти изменения носили длительный характер (в 27% клеток), если АХ подавали на фоне возбужденных глутаматом или соматической стимуляцией клеток, в некоторых случаях превышая 5 минут. А изолированная аппликация АХ подобного эффекта не вызывала. Похожие результаты были получены Р. Ричардсоном и М. ДеЛонгом (Richardson, DeLong, 1991b). В данной работе АХ вызывал длительные модулирующие эффекты у 20-50% клеток, длящиеся час и более, при аппликации его на нейроны моторной, соматосенсорной и зрительной коры, которые были активированы. У части нейронов при этом наблюдалось уменьшение силы ответов. Важно отметить, что подобные длительные изменения происходили только при действии АХ на фоне предварительной активации клеток. Причем холинергическое облегчение ответов, наблюдаемое в экспериментальных условиях, могло быть неселективным, т.е. на все стимулы, при аппликации АХ и внутриклеточной стимуляции нейрона. Аппликация же АХ и стимуляция отдельных возбуждающих входов приводили к более селективному облегчению ответов, только на некоторые стимулы (Richardson, DeLong, 1991b). Гусев П.А. и Мясников А.А. (Гусев, Мясников, 1994) наблюдали изменение реактивности к глутамату после совместной аппликации его и АХ на нейроны сенсомоторной коры. Эти изменения зависели от временной задержки предъявления АХ относительно начала действия глутамата.
Как упомянуто выше, увеличение возбудимости кортикальных нейронов появляется как результат действия АХ на ряд ионных токов. Так, АХ блокирует М-ток (Brown, 1983), который является калиевым током, препятствующим деполяризации мембраны от потенциала покоя. Поэтому АХ будет повышать вероятность разряда нейрона в ответ на приходящий деполяризующий импульс. Другим эффектом АХ является увеличение входного сопротивления кортикальных и гиппокампальных нейронов (Woody et al., 1978). Входное сопротивление увеличивается, главным образом, за счет блокады АХ медленного калиевого тока утечки. Такое уменьшение тока утечки может также незначительно деполяризовать нейрон. Оба свойства этого тока способствуют увеличению нейронной возбудимости. Влияние АХ на калий - зависимый кальциевый ток, через его подавление, выражается в уменьшении автогиперполяризации и, как следствие, в усилении неирональнои реактивности. Все происходящие изменения при аппликации АХ могут длиться несколько минут.
Операция по вживлению и установке регистрирующих и стимулирующих электродов
Операцию проводили под нембуталовым наркозом из расчета 55 мг на килограмм веса кролика. На все время операции кролика фиксировали в стереотаксическом аппарате. В области разреза на голове подкожно вводили 2% раствор новокаина. Для последующего доступа к БКЯ в точке с координатами А = -1 —2 , L = 4-5 (Fifkova, Marsala, 1967) просверливали трепанационное отверстие диаметром 4 мм, сохраняя твердую мозговую оболочку. С помощью стереотаксиса над ним устанавливали опору микроманипулятора для микроэлектрода и приклеивали ее к черепу акрилоксидом. Регистрируемое полушарие выбиралось в случайном порядке: для 8 кроликов это было правое полушарие мозга, а для 9 - левое.
Микроэлектроды для записи экстраклеточной активности нейронов изготавливали из вольфрамовой проволоки толщиной 130 мкм, электролитически заточенной в концентрированном растворе KN02 и покрытой винифлексовым лаком. Диаметр кончика таких электродов составлял 1-3 мкм, а их сопротивление синусоидальному переменному току частотой 1КГц было в пределах 2-10 МОм. Во время опыта микроэлектроды опускали вручную поворотом кольца манипулятора конструкции В.А. Коршунова (Коршунов, 1984). Минимальный шаг манипулятора соответствовал примерно 5 мкм продвижения электрода. Запись нейронной активности вели из области 13-15 мм ниже уровня брегмы. Конструкция манипулятора позволяла менять точку погружения микроэлектрода в пределах трепанационного отверстия.
Для регистрации ЭЭГ коры при выработке УР и УРП макроэлектроды погружали с помощью стереотаксиса в лобную и височную кору. Координаты погружения представлены в таблице 3. Использовали нихромовые электроды, электролитически заточенные в 20% растворе соляной кислоты и покрытые винифлексовым лаком кроме 0,5 мм участка от регистрирующего кончика электрода.
Для регистрации ЭЭГ и ВП при реализации парадигмы "пассивный одц-болл" макроэлектроды погружали в кость на глубину 1,5 мм над лобной, латерально-теменной и центрально-теменной (область брегмы - место пересечения коронарного и сагиттального швов) областями коры (таблица 3). Использовали серебряные электроды диаметром 400 мкм в тефлоновой изоляции, зачищенные от изоляции на 1-5 мм от регистрирующего кончика.
Все макроэлектроды приклеивали к кости фосфатцементом и/или акрилоксидом (быстротвердеющей акриловой пластмассой). Электрод для заземления, аналогичный активным, размещали над задней теменной корой, а референтный электрод - в носовой кости. Все ЭЭГ-электроды располагали унилатерально на той же стороне черепа, на которой делали трепанационное отверстие для доступа к БКЯ.
Съемные электроды для подачи электрокожного раздражения (ЭКР) представляли собой клипсы с двумя медными контактными пластинами и штырем. Электроды закрепляли на ухе кролика, пропуская штырь сквозь отверстие в ушах, благодаря чему животное не могло сбросить электроды. Перфорацию проводили в верхней трети ушной раковины в районе внешнего края, наименее богатого кровеносными сосудами. Для местной анестезии использовали 2-процентный раствор новокаина. Для 5 кроликов использовали другой принцип электрической стимуляции ушей. По две стальные проволочки в тефлоновой изоляции, зачищенные на 1 мм от стимулирующего кончика, с помощью полой иглы подкожно вводили вдоль внешних сторон ушных раковин кролика от их основания примерно на 2/3 длины. Проволочки располагали так, чтобы их неизолированные участки находились на расстоянии не менее 1 см друг от друга.
Во время инструментальной условнорефлекторной деятельности производили регистрацию миограммы при инструментальном движении ухом. Для регистрации миограммы к мышцам около основания ушей подводили под кожей изолированные нихромовые проволочки, зачищенные от изоляции на 1 мм от кончика.
Все проводники припаивали к 12-контактному разъему, который укрепляли на голове животного. Из акрилоксида формировали платформу, закрывающую макроэлектроды и все соединительные контакты.
Раневые поверхности обрабатывали стрептоцидом, и края кожи сшивали впереди и позади платформы. В конце операции внутримышечно вводили 500000 Ед раствора бициллина-5. Послеоперационный период занимал 7-9 дней, в течение которого животные содержались в своих клетках и получали полноценное питание.
Эксперименты проводили в экранированной свето- и звукоизолированной камере. Управление экспериментом и регистрацию информации проводили на компьютере Pentium с платой ввода - вывода аналоговой и цифровой информации L-305 фирмы "L-card", находящегося вне камеры, с помощью программы "Emerald Spike" (автор - Б.В.Чернышев) (рис. 2).
Во время опыта к разъему на голове кролика присоединяли многожильный гибкий экранированный провод. Непосредственно около головы животного были расположены повторители для сигналов с микро- и макроэлектродов.
ЭЭГ регистрировали из лобной и височной коры биполярно между соседними участками коры или монополярно от одного из отведений лобной, латерально-теменной и центрально-теменной коры относительно референтного электрода. Сигнал с ЭЭГ макроэлектродов поступал на предусилитель, и с него - на электроэнцефалограф ЭЭГП4-02 или усилитель биопотенциалов. После чего он подавался на вход АЦП, расположенного на плате ввода-вывода L-305 в компьютере. Полоса пропускания электроэнцефалографа была установлена 1 - 80 Гц для биполярной регистрации. Полосу пропускания при монополярной регистрации ЭЭГ и ВП ограничивали до 70 Гц. Постоянная времени составляла 1,6 с, частота оцифровки 512 Гц, эпоха анализа 6 с.
Сигнал с микроэлектрода поступал на предусилитель и далее на усилитель биопотенциалов, а с него на вход АЦП. Полоса пропускания канала регистрации спайковой активности составляла 300 - 1000 Гц.
Корреляция частоты разряда нейронов базального крупноклеточного ядра с мощностью дельта-диапазона электроэнцефалограммы
Хорошо известно, что функциональное состояние организма находит свое отражение в ЭЭГ активности коры и подкорковых образований (Котляр, Зубова, Тимофеева, 1969; Котляр, Тимофеева, 1970; Buzsaki, Gage, 1991; Тимофеева и др., 1999). Показателями активации головного мозга служат различные параметры ЭЭГ, такие как: мощность частотного спектра ЭЭГ, диапазон основных ритмов ЭЭГ, доминирующая частота. В целом ряде работ (Whalen et al., 1994; Тимофеева и др., 1999) было показано, что существуют корреляционные отношения скорости разряда нейронов различных структур с уровнем активности корковой и подкорковой ЭЭГ. В данной работе проведено изучение корреляции частоты разряда нейронов БКЯ с мощностью дельта-диапазона ЭЭГ лобной и височной коры с целью выявления скоррелированности и корректности данных показателей для оценки функционального состояния животного, а также определения критериев, дающих возможность выделять нейроны холинергической природы.
Нами была зарегистрирована частота разряда 295 нейронов с одновременной регистрацией ЭЭГ лобной и височной коры и 116 нейронов с одновременной записью ЭЭГ только лобной коры при различных функциональных состояниях кролика: от глубокого дельта сна до спокойного бодрствования.
Чтобы оценить степень взаимодействия БКЯ с двумя разнесенными областями коры больших полушарий, мы вычисляли корреляцию между активностью зарегистрированных нейронов БКЯ и мощностью дельта-диапазона ЭЭГ с помощью метода ранговой корреляции Спирмэна. Из 295 нейронов, зарегистрированных одновременно с ЭЭГ обеих исследуемых областей коры, достоверную корреляцию (р 0,05) частоты разряда нейронов с мощностью дельта-диапазонов ЭЭГ лобной коры проявили 186 нейронов (63,1%) и 175 нейронов (59,3%) проявили корреляцию с мощностью дельта-диапазонов ЭЭГ височной коры. На основании достоверности и знака корреляции частоты разряда нейрона с мощностью дельта-диапазона ЭЭГ все зарегистрированные нами нейроны были разденены на три группы: 1) нейроны, проявившие достоверную отрицательную корреляцию; 2) нейроны, проявившие достоверную положительную корреляцию и 3) нейроны, не проявившие достоверной корреляции ("нулевая корреляция"). Примеры записей спонтанного разряда нейронов с отрицательной и положительной корреляцией приведены на рис. 4-5. Одновременная регистрация ЭЭГ лобной и височной коры позволила нам оценить согласованность корреляции активности нейронов БКЯ с активностью этих разнесенных участков коры. Активность 151 (51,2%) нейрона достоверно была связана с мощностью дельта-диапазона ЭЭГ обеих областей коры. При этом 114 (38,6%) нейронов имели отрицательную корреляцию частоты их разряда с мощностью дельта-диапазона ЭЭГ этих областей коры (рис. 6А); 36 (12,2%) - положительную и у 1 нейрона обнаружена корреляция разного знака с ЭЭГ височной и лобной коры. Активность 35 нейронов (11,9%) была связана с мощностью дельта-диапазона ЭЭГ только лобной коры (26 нейронов (8,8%) проявили отрицательную корреляцию и 9 (3,1%) - положительную), а активность 24 (8,1%) нейронов - только височной коры (15; 5,1% и 9; 3,1% соответственно). Оставшиеся 85 (28,8%) нейронов не проявили достоверной корреляции их активности ни с одной из двух областей коры (рис. 6А).
Таким образом, активность большей части зарегистрированных нейронов (235 нейрона, 79,7%) была одинаково связана как с уровнем активности лобной, так и височной областей коры. При этом число нейронов, проявивших достоверную корреляцию частоты их разряда с мощностью дельта-диапазона ЭЭГ лобной коры, оказалось больше, чем число нейронов, проявивших такую связь с ЭЭГ височной коры (рис. 6Б). Кроме того, в преобладающем числе случаев зависимость между частотой разряда нейрона и мощностью дельта-диапазона ЭЭГ коры имела отрицательный характер, т.е. большинство нейронов разряжалось с большей частотой во время бодрствования кролика.
Учитывая большую согласованность в корреляции активности обеих областей коры с уровнем активности нейронов БКЯ и более выраженную связь нейронов с активностью лобной коры, чем с височной, для дальнейшей работы мы использовали показатели активности только лобной коры. Из всей совокупности зарегистрированных нами нейронов 252 (61,3% из 411 зарегистрированных) проявили достоверную связь между частотой их разряда и мощностью дельта-диапазонов ЭЭГ лобной коры. Эта связь имела отрицательный характер для 179 нейронов (43,5%), т. е. нейроны чаще разряжались во время бодрствования кролика, а для 73 нейронов (17,8%) такая связь была положительной, т.е. нейроны чаще разряжались во время сна кролика. Активность 159 нейронов (38,7%) не была связана с уровнем активности лобной коры больших полушарий мозга.
