Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Строение и реактивная перестройка периферического миелинового нервного волокна 12
1.1.1. История становления представлений о реактивной перестройке нервного волокна 12
1.1.2. Миелиновые насечки Шмидта-Лантермана 13
1.1.3. Реактивные неспецифические изменения миелиновых насечек Шмидта-Лантермана 18
1.1.4. Перехват Ранвье 19
1.1.5. Реактивные изменения перехвата Ранвье 22
1.1.6. Перикарион шванновской клетки 24
1.1.7. Реактивные изменения перикариона шванновской клетки 26
1.1.8. Осевой цилиндр 27
1.1.8.1. Цитоскелет осевого цилиндра 29
1.1.9. Реактивная перестройка осевого цилиндра 37
1.2. Нейроно-глиальные взаимоотношения 40
1.3. Осмотические процессы в нервной ткани 47
2. Материал и методы исследования 52
2.1. Объект исследования 52
2.2. Методика выделения одиночных живых нервных волокон... 54
2.3. Методика исследования живых нервных волокон в гиптонической среде 56
2.4. Методика исследования нервных волокон под воздействием агентов, деполимеризующих цитоскелет 56
2.5. Методика электронно-микроскопических исследований 57
2.6 Методика исследования нервных волокон в безводных средах 58
2.7. Количественный анализ материала 60
2.7.1. Прижизненный количественный анализ 60
2.7.2. Ультраструктурный анализ плотности распределения цитоскелетных структур
2.8. Установка для компьютерной фазовоконтрастной микроскопии с цейтраферной видеосъёмкой 62
Результаты 64
3.1. Реактивная перестройка интактного живого миелинового волокна при его переживании 64
3.2. Неспецифическая реактивная перестройка нервного волокна в гипотонической среде.. 87
3.3. Изменения миелинового волокна при воздействии механической травмы 100
3.3.1. Прижизненные исследования реактивных изменений при механической травме 100
3.3.2. Электронная микроскопия плотности распределения цитоскелетных структур при механической травме 106
3.4 Влияние ингибиторов деполимеризации цитоскелета на развитие реактивной перестройки миелинового нервного волокна 121
3.5. Исследование реактивной перестройки в безводных средах 140
3.5.1. Реактивная перестройка волокна в среде вазелинового масла 140
3.5.2. Реакция волокна в среде перфтордекалина 144
Обсуждение результатов 150
Выводы 162
Список литературы
- Реактивные неспецифические изменения миелиновых насечек Шмидта-Лантермана
- Методика исследования живых нервных волокон в гиптонической среде
- Установка для компьютерной фазовоконтрастной микроскопии с цейтраферной видеосъёмкой
- Электронная микроскопия плотности распределения цитоскелетных структур при механической травме
Введение к работе
Актуальность работы. Миелиновое нервное волокно - это уникальный симбиоз отростка нейрона и глиальной клетки, характеризующийся сложными структурными и функциональными взаимодействиями. Современная литература пополняется всё новыми фактами о видах нейроно-глиальных взаимоотношений в различных отделах нервной системы. Но до сих пор периферическое миелиновое волокно и присущие ему формы коммуникации остаются не до конца изученными.
Одним из видов взаимодействия аксона и шванновской клетки является реактивная перестройка миелинового нервного волокна, которая представляет собой третью промежуточную форму состояния нервного волокна между его нормальным состоянием и дегенерацией. Реактивные изменения миелинового волокна однотипны при нарушении гомеостаза под действием факторов внешней среды и при различных заболеваниях периферической нервной системы (, , 1991; , , et al., 2012). Следовательно, подробное изучение механизмов реактивной перестройки миелинового нервного волокна является актуальной проблемой.
Поскольку предыдущими исследователями (Robertson, 1958,б; Trapp, Kidd, 2004; Scherer, Arroyo, Peles, 2004) основное внимание уделялось строению миелинового волокна в статике, до сих пор остается под вопросом, каким образом в динамике при реактивной перестройке связаны между собой структурные изменения аксона и шванновской клетки, какую роль они играют в обеспечении неэлектрической функции проводника. Дополнительные исследования требуются для понимания, за счёт каких процессов происходят эти структурные изменения миелинового нервного волокна. Этим мало изученным проблемам посвящена данная диссертационная работа.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось функциональное исследование механизмов реактивной перестройки миелинового нервного волокна и выяснение взаимоотношения осевого цилиндра с миелиновыми структурами глиальной клетки при нарушении гомеостаза под действием факторов внешней среды.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить процесс реактивной структурной кинетики живого миелинового нервного волокна в растворе Рингера.
2. Исследовать взаимозависимость перестройки аксона и миелиновых структур шванновской клетки при изменении тоничности внешней среды.
3. Изучить нейроно-глиальные взаимоотношения структур волокна при его механическом повреждении.
4. Электронно-микроскопически определить плотность распределения цитоскелетных белковых структур реактивно изменённой аксоплазмы.
5. Исследовать процесс передачи жидкой фракции аксоплазмы между аксоном и глией при реактивной перестройке в водных и безводных средах.
6. Определить возможность регуляции интенсивности реактивной перестройки путём изменения осмотического давления аксоплазмы.
Научная новизна исследования. Проведённые исследования впервые на живых миелиновых волокнах выявили комплекс ранних, обратимых, реактивных изменений структурных компонентов волокна и продемонстрировали их взаимозависимость. Впервые представлена полная кинетика функционального значимого процесса обратимых изменений волокна. В работе подробно изучены неизвестные ранее процессы, приводящие к изменению структуры миелиновых насечек, а также выявлены и подробно рассмотрены причины, так называемой, "ретракции миелина" в области перехвата Ранвье. Доказано, что функционально значимая варикозная деформация аксона зависит не от набухания, а от его множественного локального сужения при неизменности диаметра волокна. Путём морфометрических исследований впервые показано, что увеличение объёма насечек Шмидта-Лантермана, набухание перехватов Ранвье и перикарионов шванновской клетки связано с транслокацией водной фракции аксоплазмы в структуры миелиновой оболочки. Таким образом, продемонстрирован новый тип функциональных глио-нейрональных взаимоотношений.
Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение диссертации состоит, прежде всего, в том, что в работе впервые на живых нервных волокнах рассматриваются новые функциональные механизмы нейроно-глиального взаимодействия. Продемонстрирован взаимосвязанный комплекс всех элементов миелинового волокна, зависимость структурной перестройки сателлитной шванновской клетки от геометрических, пространственных изменений аксона. Впервые выявлен механизм реактивной перестройки, который заключается в транслокации водной фракции аксоплазмы в глиоплазму шванновской клетки, причём показано, что этот процесс протекает и при полном отсутствии внешней воды, в безводных средах. Изменение геометрических параметров миелинового волокна при обратимой реактивной перестройке также имеет большое значение для понимания его электрофизиологических процессов (, , , 1977; Shrager, Chiu, Ritchie et al., 1987).
Работа имеет большое практическое значение поскольку, изучение выявленных новых механизмов глио-нейрональных взаимоотношений в нервной системе определяет направление фармакологического поиска средств терапевтического вмешательства. Практически важным представляются результаты опытов, которые демонстрируют, что развитие реактивных изменений миелиновых волокон, а, следовательно, начальный этап их патологии можно затормозить при увеличении осмотического давления коллоида аксоплазмы за счёт деполимеризации его цитоскелета. Структурная диагностика реактивных изменений биопсийного материала может помочь уточнить прогноз и диагноз ряда заболеваний.
Положения, выносимые на защиту.
-
В периферическом миелиновом нервном волокне существует такой тип взаимодействия между аксоном и шванновской клеткой как ранняя, обратимая, неспецифическая реактивная перестройка.
-
Структурные изменения затрагивают все компоненты миелинового нервного волокна и обеспечиваются транслокацией водной фракции из аксона в цитоплазму шванновской клетки.
-
Частично ингибировать реактивную перестройку миелинового волокна возможно с помощью увеличения осмотического давления коллоида аксоплазмы при диссоциации основных цитоскелетных белков.
Апробация материалов диссертации. Результаты работы были представлены на: 1. Межинститутской конференции молодых ученых, посвященной 100-летию академика В.Н. Черниговского, «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды» (Санкт-Петербург – Колтуши, 2007); 2. VI Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 50-летию открытия А.М. Уголевым мембранного пищеварения, «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2008); 3. Научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2008); 4. Конференции молодых учёных, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И. П. Павлова РАН, «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды» (Санкт-Петербург – Колтуши, 2010); 5. II Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2011); 6. VIII Международном междисциплинарном конгрессе "Нейронаука для медицины и психологии" (Судак, 2012); 7. VIII Всероссийской конференции с международным участием, посвящённой 220-летию со дня рождения академика К.М. Бэра, «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 научные статьи в журналах из списка ВАК, 1 статья в академическом сборнике и 7 тезисов.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, пяти глав с изложением экспериментальных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 217 страниц. Из них– 82 рисунка, 8 схем и 2 таблицы. Список литературы включает 371 источник: 34 отечественных и 337 зарубежных.
Реактивные неспецифические изменения миелиновых насечек Шмидта-Лантермана
Миелиновые насечки были одновременно описаны Х.Д. Шмидтом и А. Дж. Лантерманом в 1874 году (Webster, 1965). Несмотря на то, что открыты они были давно, нередко наличие насечек считали артефактом (Feigin, Budzilovich,1980). Основные данные о строении миелиновых насечек нормального периферического миелинового волокна были получены с помощью светового и электронного микроскопов. Под световым фазовоконтрастным микроскопом насечки (схема 1, а) выглядят как симметричные косые полоски с обеих сторон миелиновой оболочки (Esmond, Smith, 1958; Webster, 1965). миелиновые насечки Шмидта-Лантермана ./-п-7...;.;..... ; миелиновая оболочка . осевой цилиндр а миелиновая оболочка островки с цитоплазмой расщепление основной шванновской клетки плотной линии осевой цилиндр Схема. 1. Строение миелиновых насечек Шмидта-Лантермана периферического миелинового волокна при световой (а) и электронной (б) микроскопии. Схема совмещает представления о строении насечки в литературе и результатов собственных исследований.
На волокнах, фиксированных осмиевой кислотой, насечки выявляются как воронкообразные щели, пересекающие миелиновую оболочку (Питере, Палей, Уэбстер, 1972). Неизменённые насечки миелинового волокна в связи с их небольшим размером описываются как "закрытые" (Williams, Hall, 1971).
С помощью электронного микроскопа было выяснено, что насечка представляет собой винтообразный цитоплазматический шванновский канал. Он косо пересекает миелиновую оболочку от поверхностных слоев шванновской клетки вплоть до аксона под углом 9 к оси волокна (Yin, Kidd, Nave et al., 2008; Velde, McDonald, Boukhedimi et al., 2011).
Насечка формируется в процессе миелинизации как участок с невытесненной глиоплазмой (Li, 2008). У эмбриона человека насечки начинают формироваться на 15-17-й неделе пренатального этапа развития (Isaev, Chuchkov, Yarygin, 1990,6).
В спиральном канале насечки были обнаружены микрофиламенты (Tricaud, Perrinricaud, Bruses et al., 2005; Kun, Canclini, Rosso et al., 2012), гладкий эндоплазматический ретикулум (Robertson, 1958,a).
В отличие от других участков миелинового волокна, насечки вместе с паранодальными петлями перехвата представляют собой область некомпактного миелина (Berger, Gupta, 2006). Морфометрические исследования F. Buchthal, F. Carlsen и F. Behse (1987) показали, что у человека на одно междоузлие крупного волокна приходится 35 насечек, на одно междоузлие тонких волокон - 8 насечек. Было выявлено, что число насечек в междоузлии у молодых людей пропорционально диаметру волокна, а у пожилых людей не зависит от диаметра (Isaev, Chuchkov, Yarygin, 1990,а,б). При этом отмечается, что насечек у пожилых людей вдвое больше, чем у молодых. Известны данные ряда других авторов о нестабильности количества насечек в междоузлии. После ремиелинизации и регенерации волокна отмечается укорочение интернодов и сокращение длины между насечками примерно на 20 % для всех диаметров волокна (Cooper, Kidman, 1984). Увеличение числа насечек при малом диаметре волокна наблюдается у мышей с мутацией основного белка миелина (МВР), который либо отсутствует, либо плохо выражен (Gould, Byrd, Barbarese, 1995). По данным С. Smith-Slatas и Е. Barbarese (2000), белок МВР управляет числом насечек посредством взаимодействия с коннексином-32 и MAG. Увеличение числа насечек наблюдается у мышей с мутацией по признаку сульфатид (галактоцереброзид) (Hoshi, Suzuki, Hayashi, 2007). Увеличение числа насечек выявлено при сверхэкспрессии белка HSPB1, которое, как предполагается, участвует в развитии наследственной моторной невропатии (Strivastava, Renusch, Naiman et al., 2012). M.N. Ghabriel и G. Alt (1979) обращали внимание на то, что многие исследователи путают увеличение числа насечек с увеличением их выраженности, связанного с набуханием.
На данный момент известно, что насечки - это особенность строения периферического волокна (Hoshi, Suzuki, Hayashi et al., 2007). Существуют данные о том, что в центральной нервной системе иногда встречаются подобные насечкам изолированные островки цитоплазмы шванновской клетки между расщеплёнными участками основной плотной линии (Питере, Палей, Уэбстер, 1972; Rosenbluth, Stoffel, Schiff, 1996). Предполагается, что формирование насечек определяется белком периферического компактного миелина Ро. При замене белка центрального компактного миелина PLP (proteolipid protein) на Ро возможно образование насечки в ЦНС (Yin, Kidd, Nave et al., 2008).
Как известно, во время процесса миелинизации происходит спиральное наслоение дупликатуры мембраны шванновской клетки (мезаксона). Контактирование мембраны образует "промежуточную плотную линию", а соединение внутренних цитоплазматических поверхностей мембраны формирует "основную плотную линию". Сближение и слияние плотных линий весьма напоминают организацию плотных мембранных контактов, гигантских контактов (Sotnikov, Mayorov, Honny, 1989). Ряд авторов также отмечают в областях образования промежуточных и плотных линий специализированные мембранные контакты (в зонах мезаксона, насечек и паранодальной области) (Mugnaini, Schnapp, 1974; Sandri, Van Buren, Akert, 1977). Некоторые авторы с помощью световой микроскопии фиксированных препаратов ошибочно пытаются идентифицировать насечки с конусами Гольджи, которые отсутствуют на живых препаратах, но появляются как части артефициальной нейрокератиновой сети после фиксации формалином (Poliak, Matlis, Ullmer et al., 2002; Alanne, Pummi, Heape et al., 2009; Terada, Saitoh, Ohno et al., 2012).
До сих пор нет единого мнения о функции насечки миелинового волокна. Но многие авторы сходятся во мнении, что насечки играют важную роль в глио-нейрональных взаимоотношениях (Gould, Byrd, Barbarese, 1995). По данным ряда авторов; насечка функционирует как канал для транспорта небольших молекул, где частицы могут транспортироваться между аксоном и шванновской клеткой (Сатрапа, 2007; Wendy, 2007). С помощью флуоресцентных меток разной массы было показано, что вещества могут проникать из периаксонального пространства в структуру насечки (Mierzwa, Shroff, Rosenbluth, 2010). При этом предполагается, что данный путь в 1000 раз быстрее обычного пути, через компактный миелин, и что главную роль в этом процессе играют щелевые контакты.
Электрофизиологических работ относительно функции насечек немного. До недавнего времени предполагалось, что только перехваты являются местами, где затрачивается энергия и время, необходимые для проведения нервного импульса. Однако следует иметь ввиду, что волокно вдоль его длин располагает большим количеством электропроницаемых цитоплазматических каналов насечек, прободающих всю толщу миелиновой оболочки. Поэтому насечки с изменяющемся диаметром каналов должны обладать свойствами регулятора сопротивления оболочки, и следовательно, способностью управлять скоростью проведения импульса (Сотников, 1985). Ранее было высказано предположение (Holder, Stampfli R., Tasaki., 1952), что сопротивление миелиновой оболочки имеет не омическую природу, а емкостную («реактивную»). Таким образом, согласно этой гипотезе миелиновая оболочка ведет себя подобно конденсатору с утечкой. Это положение чрезвычайно важно для решения вопроса о значении структур межанулярного миелинового сегмента, включающего насечки Шмидта-Лантермана. Из него следует, что для проведения нервного импульса существенны не только перехваты, но и строение межанулярного сегмента. По-видимому, на сегодняшний день нельзя не учитывать вклад насечек в пассивные электрические свойства миелинового волокна (Zaciu, Koppenhofer, Maskaliunas, 1996). При этом для функции волокна важное значение имеет структурная кинетика насечек, степень их расширения и количество этих структур в одном междоузлии.
Методика исследования живых нервных волокон в гиптонической среде
Исследовали выбранные одиночные изолированные волокна. Изменённые волокна оценивались как механически повреждённые. Такие волокна имели ровные контуры миелиновой оболочки и осевого цилиндра. У них отсутствовали признаки набухания миелиновых насечек, перехватов и перикарионов шванновских клеток. Исследовалась реактивная перестройка волокон при длительном переживании, механической травме и действии гипотонической среды. Под световым инвертированным фазовоконтрастным микроскопом препарат исследовали в среднем около 2-6 часов. Наблюдение за нервными волокнами с первых минут осуществляли на компьютерной автоматизированной микровидеоустановке. Производили цейтраферную видеосъемку (1 кадр каждые 10 минут) и из полученных изображений с помощью программы Adobe After Affects 7.0 монтировали фильмы развития реактивной перестройки структур живого миелинового волокна.
Для изучения на ультраструктурном уровне исходный препарат после расщепления выдерживали 2 часа в растворе Рингера и затем фиксировали для электронно-микроскопических исследований (см. раздел 2.6). Всего в опытах использовано 145 лягушек, исследовано 3417 волокон.
В исследованиях использовали 50 %, 33 %, 25 % гипотонические растворы, которые готовились на основе раствора Рингера для лягушки. Восстановление структур наблюдали при замене гипотонической среды на изотонический раствор Рингера. Чтобы выявить особенности механизма процесса набухания структур миелинового волокна проводили качественные и количественные исследования. Было использовано 26 лягушек, исследовано 76 волокон.
Для некоторого увеличения осмотического давления аксоплазмы мы деполимеризовали её основные цитоскелетные белки, тубулин и F-актин, и одновременно отделяя ассоциированные с ними протеины. Колхицин (Sigma, США) использовали для деполимеризации микротрубочек. Колхицин разводили в растворе Рингера в концентрации 0,5 мМ по А.Н. Кислову, Н.Р. Чекуровой и А.А. Катаеву (1999) и выдерживали в нём препарат в течение 2-х часов. Было использовано 10 лягушек, исследовано 589 волокон.
Цитохалазин В (Sigma, США) использовали для деполимеризации микрофиламентов. Его вначале растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) (1 мг/мл), а затем разводили в растворе Рингера до 0,2 мМ концентрации. Препарат в растворе цитохалазина В выдерживали 2 часа. Было использовано 27 лягушек, исследовано 1125 волокон. В контрольной серии опытов было использовано 10 лягушек, изучено 1105 волокон. В течение 2-часовой выдержки препараты изучали под инвертированным фазовоконтрастным микроскопом. Определяли количество неизменённых и реактивно изменённых структур волокна. Также для изучения изменений миелиновых волокон на ультраструктурном уровне препараты подготавливали для электронно-микроскопических исследований.
Расщеплённый нерв фиксировали в течение 1-го часа охлажденным 2,5% раствором глутарового альдегида на основе 0,1 М какодилатного буфера с рН 7,2-7,4. Затем с помощью охлажденного какодилатного буфера препарат трёхкратно промывали. В последующем проводили дофиксацию 1% охлажденным раствором OSO4 в течение 1 часа. Далее материал снова трёхкратно промывали охлажденным какодилатным буфером. Затем осуществляли дегидратацию препарата спиртами восходящей концентрации (50 и 70) по 10 мин 3 раза. Далее на сутки материал помещали в холодильник в 3,5% уранилацетат, разведённый в 70 спирте. Затем объекты выдерживали 3 раза по 10 мин в 80, 90, 96 спиртах. В абсолютный спирт помещали 2 раза на 10 мин. После этого материал переносили в смесь ацетона и абсолютного спирта 1:1 на 15 мин, потом - в абсолютный ацетон 2 раза на 10 мин. Далее ацетон меняли на смесь аралдитов и ацетона в отношении 1:3 и держали в течение 1 ч. Смесь аралдитов готовили из аралдита М (5 мл), аралдита Н (5 мл), дибутилфтолата (0,35 мл) и аралдита В (0,25 мл). Далее объект помещали в смесь аралдитов и ацетона в соотношении 1:1 на 1 ч, затем в соотношении 3:1, и - в смесь аралдитов без ацетона на 1 ч. В тот же день материал перемещали в другие порции смолы в специальные пластмассовые формы. Присваивали каждой форме номер, записывали в журнале характеристику объектов. Для полимеризации смеси аралдитов их выдерживали по 24 ч в термостате при 37С и 60С.
Фиксированный материал резали на ультратоме LKB-5 (Швеция) на полутонкие срезы и просматривали их под фазовоконтрастным микроскопом. Ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца в течение 30 мин. Использовали электронный микроскоп JEM 100В (Япония). Негативы сканировали в просвечивающем режиме с помощью сканера HP ScanJet G4050 (Китай). Позитивные изображения подвергали морфологическому анализу, пользуясь программой ACDSee 8 Photo Manager. Было использовано 7 лягушек, исследовано 140 волокон.
Установка для компьютерной фазовоконтрастной микроскопии с цейтраферной видеосъёмкой
В наших опытах прослеживалась взаимосвязь между реактивными структурными изменениями насечек и осевого цилиндра. Постепенное набухание и расслоение компактного миелина в этой области сопровождалось варикозной деформацией осевого цилиндра, который росполагается между соседними набухшими миелиновыми насечками (рис. 12). Время набухания могло продолжаться до 5-8 часов (рис. 14).
Иногда процесс набухания насечек мог быть асимметричным, и они увеличивались только с одной стороны волокна (рис. 15). При этом набухание миелиновых насечек толстых нервных волокон за пределы наружного контура волокна не происходило. Насечки не выпячивались, а "вдавливались" внутрь осевого цилиндра. Диаметр суженной части осевого цилиндра под всеми насечками оставался примерно одинаковым, равным около 1/3 его исходного диаметра. Этот диаметр на всем миелиновом сегменте оказывался равным плотному "кончику" в области ампутированного конца волокна, так что он представлял собой участок плотного аксиального тяжа аксоплазмы. Это впечатление усиливалось со временем, когда расщепление миелина в области насечек увеличивалось и сама насечка начинала удлиняться, обнажая центральный плотный тяж (рис. 12).
Киносъёмка развития реактивной перестройки насечек волокна при переживании показывала, что этот процесс неразрывно связан с варикозной деформацией осевого цилиндра. В связи с этим перед нами встал ряд вопросов: как изменяются при этом объёмы взаимосвязанных между собой осевого цилиндра и насечек, варьирует ли при этом объёмы волокна в целом и за счёт какой воды набухают насечки? Наши прижизненные исследования продемонстрировали, что имеется взаимосвязь не только между осевыми цилиндрами и насечками, но также между этими структурами и перехватом Ранвье. Удалось показать, что принцип изменения перехватов Ранвье полностью совпадает с принципом перестройки насечек Шмидта-Лантермана.
Перехват Ранвье (узловой перехват) представляет собой участок живого волокна, где отмечается истончение и перерыв миелиновой оболочки смежных шванновских клеток (рис. 6). Никаких крестообразных структур, описанных Л. Ранвье на фиксированных и окрашенных препаратах, на живых нервных волокнах не выявляется, но в этом месте образуется межсегментарная щель перехвата, зона осевого цилиндра не покрытого миелином. У перехвата интактного волокна крайне узкая межсегментарная щель, однако её размер в норме колеблется, что свидетельствует лабильности этой структуры. По сторонам от щели расположены конусовидные участки волокна (миелиновые конусы перехвата), которые переходят в утолщение (миелиновые луковицы перехвата) (рис. 16).
Фазовый контраст. Об. 40Ph, ок. 16. Миелиновые конусы сформированы благодаря местному сужению осевого цилиндра и истончению миелиновой оболочки. Образованные луковицы перехвата связаны только с расширением осевого цилиндра. Толщина миелиновой оболочки в этом месте остается равной ее толщине в остальной части миелинового сегмента. Тонкие волокна имеют луковицы, выраженные гораздо слабее (рис. 6).
Расслоение компактного миелина можно заметить у неизменённых перехватов в зоне миелиновых конусов (рис. 17, а). Комплексы ламелл имеют циркулярную форму и на препаратах видны в виде поперечной исчерченности. Её удалось выявить, изменяя оптический фокус при микрометрировании. В области конусов можно было выявить также более интенсивное отщепление слоистых комплексов миелиновой оболочки (рис. 17,6).
При этом миелиновые комплексы частично отклонялись в сторону от щели перехвата, создавая там впечатление перемещения миелина внутрь интернодального сегмента с расширением щели перехвата. На самом деле известно, что ламеллы миелина от щели перехвата не перемещаются, а только изгибаются при набухании паранодальных петель и отклоняются от щели (схема 6). Комплексы петель перемещались неравномерно: расслаивались и соединялись вновь, так что на удалении от щели мог быть сформирован новый вторичный конус. У сильно изменённых луковиц перехвата расщепление комплексов ламелл становилось более выраженным и менее упорядоченным (рис. 17, в).
Таким образом набухание паранодальных петель вызывает увеличение степени расслоения компактного миелина, то есть наблюдается принципиально тот же процесс, что и реактивная перестройка насечек Шмидта- Лантермана.
Электронная микроскопия плотности распределения цитоскелетных структур при механической травме
Выполненное нами сканирование распределения электронноплотных цитоскелетных элементов аксоплазмы в нормальном (контрольном) волокне свидетельствало о равномерном их распределении в аксоплазме (рис. 35, а). Осевой цилиндр сохранял нормальную цилиндрическую форму. Филаментозно-тубулярные структуры располагались параллельно, на равном расстоянии друг от друга и имели приблизительно одинаковую длину. Автоматическое определение плотности распределения этих структур свидетельствовало о равномерном их расположения в нормальных нервных волокнах. Плотность распределения локальных оптических максимумов, соответсвующая концентрации цитоскелетных структур, составляла 0,040 и вычислялась как отношение плотности локальных оптических максимумов на длину линии сканирования (рис. 35, б).
В области нормальных миелиновых насечек, где были хорошо видны островки ненабухшей цитоплазмы шванновской клетки (рис. 36, а), плотность распределения этих цитоскелетных структур (рис. 36, б) оставалась также низкой (0,056, рис. 44). Однако при набухании насечки в суженной области аксоплазмы (рис. 37, а, 38, а) она возрастала на 200 %-275 % (рис. 37, б, 38, б). Это свидетельствовало агрегации компактного пучка филаментозно-тубулярных структур с образованием аксиального тяжа.
При электронно-микроскопическом исследовании у нормальных неповреждённых перехватов прослеживалась слабое расслоение компактного миелина на одиночные равномерные петли (островки паранодального канала) (рис. 39, а). В области аксона такого перехвата плотность распределения цитоскелетных структур (рис. 39, б) была равна 0,059 и близка к плотности аксона в зоне нормальной насечки (0,056, рис. 44). При слабой степени реактивных изменений волокна (второй степени) паранодальный миелин несколько набухал (рис. 40,а), сдавливая осевой цилиндр. Резкие изменения травмированного перехвата (третьей степени) проявлялись выраженным набуханием миелина, отщеплением его пластинчатых комплексов и сужением осевого цилиндра (рис. 41,а), набуханием цитоплазматического канала паранодальной области, расширением зоны, занятой миелином, за счёт диаметра осевого цилиндра. В этой области плотность распределения цитоскелетных структур аксоплазмы возрастала до 200 %-250 % (рис. 40,6, 41,6), что свидетельствовало о формировании филаментозно-тубулярный пучка по размеру равного выходному отверстию конусов перехвата в норме, промежутку между набухшими насечками и "кончику" у живого ампутированного волокна. Другими словами, в локальных участках набухших насечек и реактивно изменённых перехватов локально формируется плотный филаментозно-тубулярный агрегат цитоскелетных белковых структур, резко отличающийся от нормальной аксоплазмы, где их концентрация относительно низкая.
При электронно-микроскопическом исследовании перикариона шванновской клетки установлено, что даже в норме, перикарион слегка вдавливается внутрь осевого цилиндра (рис. 42,а). В случае резкой травмы волокна набухающая цитоплазма могла выступать с двух сторон от миелиновой оболочки (рис. 43,а). При этом отмечается высокая плотность распределения цитоскелетных структур аксоплазмы в пределах набухающего перикариона шванновской клетки (0,076, рис. 43,6). По сравнению с контрольным волокном в зоне набухшего перикариона плотность распределения цитоскелетных структур возрастает до 0,114 (рис. 42,6, 44). Она увеличивается по сравнению с плотностью распределения у нормального волокна вне миелиновых структур примерно на 200 %-275 %.
Плотность распределения цитоскелетных структур аксоплазмы вне миелиновых насечек. а - траектория сканирования осевого цилиндра; б - график профиля плотности распределения локальных оптических максимумов (цитоскелетных структур) вдоль траектории сканирования и числовое выражение этой плотности; 1 - компактный миелин; 2 - равномерно расположенные микрофиламенты и микротрубочки; по оси ординат -величина оптической плотности в относительных единицах/пиксели, позволяющая определить число оптических максимумов (количество цитоскелетных структур); по оси абсцисс - длина профиля оптической плотности в пределах траектории сканирования в пикселях;. Электронная микроскопия. Ув. 19000.
