Применение азидных производных в консервации биологического материала [Электронный ресурс] Зайцева Ольга Олеговна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор методов консервации органов и тканей .. 11

1.1. Бальзамирование трупов в Древнем Египте и других странах 12

1.2. Развитие бальзамирования в эпоху возрождения 15

1.3. Бальзамирование и сохранение трупов в России с XVIII - XX вв.. 17

1.4. Современные методы бальзамирования 26

1.5. Особенности ряда антисептических средств, используемых для консервации органов и тканей 31

1.6. Состав растворов для консервации и приготовления анатомических препаратов 38

Глава 2. Материал и методы исследования 44

Глава 3. Анализ экспериментальных исследований 50

3.1. Оценка консервирующих способностей растворов неорганических ; производных азота в сравнении с раствором формалина и их влияние на качественное и длительное сохранение биологического материала 50

3.2. Сохранность макроструктуры фиксируемых органов при действии различных консервирующих растворов .71

3.3. Влияние нелетучих растворов азидных производных и летучего формалина на живой организм в эксперименте 74

3.4. Доказательство экономической выгоды и простоты способа хранения растворов азидов перед раствором формалина, как основного консерванта в настоящее время 85

Глава 4. Обсуждение результатов экспериментальных исследований 88

Выводы 92

Практические рекомендации 93

Список использованной литературы 94

• Бальзамирование трупов в Древнем Египте и других странах
• Развитие бальзамирования в эпоху возрождения
• Оценка консервирующих способностей растворов неорганических ; производных азота в сравнении с раствором формалина и их влияние на качественное и длительное сохранение биологического материала
• Сохранность макроструктуры фиксируемых органов при действии различных консервирующих растворов

Введение к работе

Актуальность исследования. Известно, что после наступления биологической смерти начинаются естественные процессы разложения мягких тканей, которые протекают по типу ранних и поздних трупных изменений [4, 6, 78, 125, 193, 202, 234]. Потребность сохранения тела человека после смерти продиктована многими факторами. Основные -гигиенические, эстетические, социальные, также психологические и религиозные [61, 87, 155].

Фиксирующие жидкости с целью сохранения анатомических, патологоанатомических препаратов и бальзамирование трупов выдающихся государственных и религиозных деятелей применяли с древних времен [1,2, 13, 14, 89]. В то же время рецепты приготовления большинства консервирующих растворов были засекречены и сведения о них не публиковались в открытой печати, что создавало определенные сложности в их широком использовании, а конечный результат ранее апробированных технологий прочитывался спустя десятки, сотни и даже тысячи лет [137, 138, 139, 148].

В современном мире необходимо не только бальзамирование тел умерших, но и сохранение различных тканей, изъятых из трупа, для проведения дальнейших специальных исследований [135, 144, 147, 156] . Применяемые в настоящее время растворы для фиксации разных объектов в своем составе имеют формалин в высоких концентрациях [233, 236, 238, 239]. Формалин был введен в практику консервации в 90-х годах XIX века и получил известность и всеобщее признание как относительно дешевый препарат с выраженной бактерицидной способностью и дубящим эффектом [40, 45, 182, 221, 226, 228, 229], но затем стало известно, что формалин имеет ряд отрицательных свойств: токсичен; изменяет структуру белка при взаимодействии с его NH₂' группами, что в последствии может привести к аллергическим реакциям различного типа и генетическим мутациям у

работающих; он летучее резким запахом, вызывающим раздражение и сухость слизистых; угнетает обмен веществ в организме, инактивируя ферменты в органах и тканях; обладает канцерогенными и эмбриотоксическими свойствами [62, 149, 165, 189]. Органы, зафиксированные формалином, теряют эластичность и меняют прижизненную окраску из-за перехода гемоглобина крови в метгемоглобин [15, 80, 96, 146, 204, 205, 215].

Одним их новых методов для сохранения биологических образцов, особенно мягких, содержащих большое количество воды и способность загнивать (сердце, мозг, печень, легкие, почки, мышцы), является метод пластинации, в процессе которого тканевая вода и часть тканевого жира замещаются полимеризующей смолой БИОДАР [38, 84, 85].

Этот метод используется более чем в 70 институтах Германии и других стран, прост в техническом исполнении, дает всегда положительные результаты, но дорог, не исключает использование формалина и требует специального технического оборудования [12, 238].

В последние годы XX века учеными Боливии и Чили был изобретен опытным путем тромболитик COMPLUCAD, применяемый для консервации тканей. С помощью COMPLUCAD можно получить консервацию на 48 часов, одну неделю, 20 или 60 дней в зависимости от различных предлагаемых формул [163, 166, 167, 168].

В этом случае отсутствует формалин, повышается качество биологического материала, препарат является экологически чистым продуктом, однако весьма дорогостоящим, к тому же авторы не раскрывают его состав и поэтому COMPLUCAD не может быть использован нами на данном этапе.

Учитывая технические сложности обеспечения процессов фиксации тканей, высокую степень токсичности бальзамирующих растворов, поиск новых и менее опасных для здоровья человека консервантов и путей предотвращения гнилостного разложения крупного биологического объекта чрезвычайно современно и актуально [48].

С нашей точки зрения, оптимальное сохранение трупного и операционного материала должен обеспечивать консервант, обладающий способностью ингибировать ферментную активность протеаз не только клеток консервируемых объектов для предотвращения аутолиза, но и ферментных систем микроорганизмов для предупреждения бактериальной инвазии. Оказалось такими консервантами являются солевые растворы азидных производных, неорганических соединений азота. Однако они до сих пор всесторонне не исследованы, что обусловливает перспективность разработок таких химических соединений и связано с требованиями профессиональной экологии [9, 10].

Цель исследования - изучить эффективность азидных производных в качестве консервирующего раствора для биологических объектов.

Задачи исследования:

1. Оценить степень сохранности макроскопического вида и
микроскопической структуры биологической ткани в условиях фиксации
растворами азидов.

2. Представить микробиологическую характеристику азидных производных
в предотвращении процессов гниения биологических объектов.

3. Определить токсичность предлагаемого фиксирующего раствора на биологический организм в эксперименте.

4. Рассчитать экономическую составляющую применения азидов в современных условиях.

Научная новизна. Впервые изучен новый по химическому составу консервирующий раствор азида натрия для сохранения биологического материала (приоритетная справка на патент «Фиксатор биологического материала» №2006103522/15 (003850) от 06.02.2006 г.). В результате комплексного исследования достоверно установлено, что даже 0,3% и 0,5% солевые растворы азида натрия позволяют сохранить прижизненную макроскопическую структуру органов: окраску, форму, консистенцию в

7 течение 550 суток без замены растворов. Одновременно впервые научно обоснована экологическая безвредность предлагаемых фиксирующих растворов.

Практическое значение. Благодаря своим эффективным свойствам и безвредности для окружающей среды растворы азидных производных позволят провести полную замену формалина и тем самым значительно улучшат качество консервации препаратов, увеличат время хранения музейного материала на морфологических кафедрах медицинских ВУЗов, в том числе в лабораториях бюро судебно-медицинской экспертизы, и могут быть востребованы службами МЧС.

Весьма ценно еще и то, что для длительного и качественного хранения органов и тканей не требуется замена растворов азидных производных в течение полутора лет.

Использование новых технологий консервации биологического материала приведет к устранению токсического воздействия формалина на персонал патологоанатомических отделений больниц, диспансеров и институтов, а также на студентов медвузов, занимающихся изготовлением музейных наглядных пособий для учебного процесса. В результате внедрения новых технологий биоконсервантов произойдет оздоровление условий труда, резко снизится степень вредного возникновения последствий работы, как это бывает с формалином, особенно у девушек и женщин репродуктивного возраста. Кроме того, доказано, что растворы азидных производных по современному курсу валют экономически выгоднее в несколько раз формалина.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Неорганические производные азота, в частности, растворы азида натрия являются высоко эффективными консервантами крупных биологических объектов.

2. Азидные производные слабой концентрации на обладают летучестью и

раздражающим действием, что улучшит качество труда в медицинских учреждениях и повысит уровень усвоения базовых знаний студентами.

3. Низкие экономические затраты на растворы азидов позволяют провести замену формалина как основного биоконсерванта не только для музейных препаратов, но и при фиксации тканей биоптатов и операционного материала больных.

Апробация работы. Основные положения и выводы диссертации доложены
на: ,

3. IV Всероссийской конференции «бизнес-ангелов» (Саранск, 2006);

4. межвузовской научной политематической конференции Кировской ГМА в разделе «Морфология» (Киров, 2006);

5. Российской научной конференции с международным участием «Вопросы морфологии» (Уфа, 2006) - Диплом II степени;

4. IV Российской научной конференции «Роль природных факторов и
туризма в формировании здоровья населения» (Уфа - Тюлюк, 2006);

5. Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)» (Ростов-на-Дону, 2006) - Диплом;

6. Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы гепатологии» (Киров, 2006);

7. 5-ой выставке инноваций при правительстве Кировской области (Киров,
2006); . ;

8. Межрегиональной научно-практической конференции студентов и
молодых ученых с международным участием «Молодежь.и наука: итоги и
перспективы» (Саратов, 2006) - Диплом III степени; ч

9. IV Республиканской научно-практической конференции «Перспективные
направления и новые технологии в здравоохранении» (Йошкар-Ола, 2006); (

10. 1Х-ой Межрегиональной специализированной выставке

і
«Здравоохранение - 2006» (Киров, 2006) - Диплом; |

11. VII Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Москва, 2007) - Приз Международной федерации изобретательских организаций «За лучшую разработку в области экологии» и Серебряная медаль Министерства образования и науки РФ;

12. Ш-ей промышленной выставке - конференции «Промышленность, наука, инновации, инвестиции» (Киров, 2007) - Диплом;

13. 3-й Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы
совершенствования фармацевтического образования. Создание новых
физиологически активных веществ» (Воронеж, 2007);

14. 2-ой Международной студенческой научной конференции «Знания
молодых - новому веку» (Киров, 2007) - Диплом I степени;

15.1-ой Всероссийской студенческой научной конференции «Студенческая наука и медицина 21 века: традиции, инновации и приоритеты» (Самара, 2007);

16. V-ой окружной ярмарке бизнес - ангелов и инноваторов «Российским инновациям - российский капитал» (Пермь, 2007) - Диплом;

17. 2-й областной научно-практической конференции молодежи «Экология родного края: пути и проблемы их решения» (Киров, 2007) - Диплом.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых 1 - в центральном журнале, рецензируемом ВАК. Получена приоритетная справка № 2006103522/15 - 003850 Федерального института по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам от 06.02. 2006 года по заявкам на изобретение «Фиксатор биологического материала».

Личное участие автора в получении результатов. Автором были выполнены все исследования на всех этапах работы по изучению эффективности качественного сохранения макроструктуры биологического материала, наличия антибактериальных консервирующих свойств растворов азидных производных. Осуществлялось также написание патента, статей и тезисов. Автор лично выступал на 10-ти научных конференциях и выставках.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 114 машинописных страницах, состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материал и методы, анализ экспериментальных исследований, обсуждение результатов исследований), выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы (241 источник, из них 200 отечественных и 41 иностранных). Диссертация иллюстрирована 19 фотографиями, содержит 22 таблицы, 4 диаграммы.

Внедрение результатов исследования. Практические рекомендации по результатам проведенных исследований новых технологий консервации биологического материала внедрены на кафедре анатомии и кафедре патологической анатомии с секционным курсом при фиксации операционного материала больных, органов, изъятых во время секции трупов и при изготовлении демонстрационных препаратов для анатомического музея Кировской государственной медицинской академии.

При этом отмечается экологическая безупречность азидных производных вследствие отсутствия летучести и слабой концентрации, выраженная эффективность и качество консервации биологических объектов в течение длительного срока, а также экономическая выгода в сравнении с формалином.

Бальзамирование трупов в Древнем Египте и других странах

Первые достоверные сведения о бальзамировании относятся к древнему Египту. Эти сведения подтверждаются фактом сохранения египетских мумий до наших дней. Сухая почва песчаных пустынь и теплый климат Африки способствовали естественной мумификации мертвых тел, случайно находимых египтянами [31, 146]. Превращение трупа в мумию происходит следующим образом. В первые дни после смерти гниение при высокой температуре идет очень быстро. Вследствие этого богатые кровью и лимфой ткани превращаются в жидкую массу (колликвационный некроз), которая скапливается в нижележащих частях трупа. Под кожей образуются пузыри, которые со временем лопаются, и жидкость вытекает наружу, в песок. Такая жидкость поглощается сухой, хорошо проветриваемой почвой, вследствие чего труп высыхает, а сухое тело - плохая среда для жизнедеятельности гнилостных бактерий. Поэтому гниение замедляется и прекращается. Оставшиеся плотные части трупа - кости, связки, соединительная ткань мышц и внутренностей, сухожилия и кожа - окончательно высыхают и образуют то, что называется мумией [90, 112, 113, 161, 178].

Геродот, живший в V веке до нашей эры и написавший сочинение, считающееся главным источником исторических сведений о бальзамировании в Египте, описывает три основных способа бальзамирования [42, 169, 170, 171].

Самый лучший и самый дорогой способ применялся для бальзамирования царей, знатных и богатых людей. Он заключался в следующем: через нос извлекали железным крючком головной мозг, остатки которого вымывали медикаментозной жидкостью. Взамен вливалось расплавленное смолистое вещество, которое застывало и заполняло полости черепа. Затем остроконечным эфиопским камнем вскрывали полость живота, из которой вынимались внутренности. Полость промывали пальмовым вином и наполняли миррой, кассией и иными благовониями, после чего живот зашивали. Вслед за тем труп клали в соль на 70 дней, потом обмывали и обматывали бинтами из тонкой льняной материи, смазанной снизу клеем (гумми). Затем труп клали в металлический, деревянный или каменный гроб.

Второй способ проще и дешевле. Полость живота оставляли невскрытой, а внутренности извлекали через задний проход, предварительно наполнив кишечник кедровым маслом с помощью клистирной трубки. После обработки внутренностей их помещали в брюшную полость, а труп клали на 70 дней в соль.

Третий способ самый простой и дешевый, применялся для представителей бедного класса. Он сводился к промыванию кишечника редечным маслом с последующим хранением тела в соли [31, 157, 172].

Научное исследование египетских мумий, проведенное Гранвиллем (1825), показало, что описания Геродота оказались неточными и неполными. Это объяснялось тем, что каста бальзамировщиков держала свое ремесло в секрете. При обследовании мумий оказалось, что извлечения мозга производилось и через промежуток между затылочной костью и атлантом или через глазницу. В полость черепа наливали горячую смолу или асфальт. В полость живота через разрез или через прямую кишку также наливали горячую смолу. Все тело покрывалось слоем извести для уничтожения эпидермиса, затем кадавер погружался в смесь воска или смолы и, наконец, в раствор солей (азотнокислый калий, углекислый, сернокислый и солянокислый натрий) и дубильных веществ. Потом труп высушивали, обматывали бинтами, пропитанными танином или расплавленным воском и смолой. Отсюда и происходит название «мумия» (от персидского слова «мум» - воск). Это слово стало встречаться лишь в XII веке [19,23, 29].

Кроме египтян бальзамирование проводили индусы, ассирийцы, эфиопы, иудеи, персы, греки.

- У индусов мумии, или коаксосы, приготавливались как у египтян: набальзамированное тело зашивали в козьи шкуры и ставили в катакомбы. Индусские мумии на вид желты, легки и пахучи [13, 36, 37]. У эфиопов - высушенные тела обкладывали гипсом, после чего труп расписывали красками, чтобы придать вид живого человека, и помещали в гроб из прозрачной, как стекло, массы. По Гиршфельду эфиопы покрывали мертвое тело камедью [74, 230, 237].

Скифы и персы обливали тело растопленным воском. Древние греки также применяли воск и пчелиный мед, которые являются хорошими консервирующими средствами. Тело Александра Македонского было покрыто медом [25].

В погребениях скифов на Горном Алтае были найдены бальзамированные тела, сохранившиеся благодаря искусственной мумификации [34]. Бальзамирование производили следующим образом: разрезав брюшную полость от мечевидного отростка до лонного сочленения, извлекали внутренности и заполняли полость живота крупно нарубленными стеблями и корнями растения (пока еще не определенного). После чего брюшная полость зашивалась шнуром из черных конских волос. Производились разрезы сзади на обеих ягодицах, бедрах и голенях, удалялись части мышц и заменялись травой вида осоки. После этого кожа сшивалась конским волосом. В дальнейшем выполнялась трепанация черепа в области левой теменной кости с последующим извлечением мозга и заполнением полости черепа еще не исследованным материалом. Выбитая костная пластинка ставилась на прежнее место и кожа затягивалась крученым конским волосом. Употреблявшиеся в средние века способы бальзамирования не были какими-то оригинальными, они просто повторяли египетские и были разбиты на две группы. При первой - консервирующие средства накачивали через задний проход в предварительно промытый кишечник, при второй - вводили бальзамирующие вещества в полость тела (грудную, брюшную, тазовую) путем вскрытия их продольным разрезом от гортани до лобка. Полости очищали губкой и наполняли различными медикаментами [133]. Известно также, что Разесом (1544) описан арабский способ бальзамирования, при котором тело натирали порошком, состоящим из ароматических веществ, квасцов и соли. После чего тело обертывали спарадрапом, то есть холстом, пропитанным воском и терпентином [51, 139]. Существующий в средние века церковный запрет вскрывать трупы людей значительно тормозил развитие анатомии как науки и учения о бальзамировании в частности.

Развитие бальзамирования в эпоху возрождения

В отличие от средних веков в эпоху возрождения врачи и ученые получили возможность вскрывать человеческие трупы и начали создавать научную анатомию (Леонардо да Винчи, Везалий). Преподавание анатомии в университетах вызвало необходимость создания наглядных пособий, в связи с чем возникала потребность изготовления анатомических препаратов, сохранения их на длительное время и составления из них коллекций и музеев. Большинство указанных препаратов хранилось в спирте, который уже в средние века стал завоевывать важнейшее место среди консервантов [33, 71, 76,77].

Начиная с XVI века, опубликовываются специальные сочинения, посвященные вопросам бальзамирования трупов и консервирования анатомических препаратов.

В первой половине XVI века французские врачи применяли сложные смеси, состоящие из солей и ароматических веществ, растертых в уксусе. Этими смесями наполняли полости тела, которое затем обливали воском и клали в гроб [24].

Во второй половине того же столетия был распространен способ бальзамирования А. Паре, заключавшийся в споласкивании смесью из ряда веществ, вскипяченных в спирте, полостей тела, а затем их заполнение сложным порошком из ароматических веществ. Снаружи тело натирали терпентином и эфирными маслами, после чего обвивали холстом и спускали в гроб [138].

В Италии в XVII веке применяли способ Санторелли (1629), который состоял из следующих манипуляций: удаление внутренностей и выпускание крови, просаливание, натирание тела воском, кедровым маслом и камедью, обертывание бумагой, пропитанной воском [12].

В начале XVIII века были опубликованы два способа бальзамирования голландского врача С. Бланкардуса (1705) - мокрый и сухой. При мокром способе тело после извлечения мозга и внутренностей погружалось или в крепкий раствор морской соли и квасцов, либо в терпентин, или в спирт. При сухом способе из кровеносных сосудов выпускали кровь и взамен ее инициировали воск, после чего труп оставляли на свежем воздухе и покрывали лаком [40].

Во второй половине того же столетия большую известность приобрел способ Людвига де Бильс, при котором бальзамирование производилось без вскрытия полостей. В свинцовый ящик насыпали 60 фунтов истолченной дубовой коры, 50 фунтов римских квасцов, столько же перцу и 100 фунтов поваренной соли, затем вливали 1500 фунтов спирта и 800 фунтов уксуса. После вымачивания в этой жидкости в течение двух месяцев труп погружали еще на два месяца в спирт, с прибавлением ароматических веществ. Далее труп высушивали в сушильной печи, смазывали бальзамом и укладывали в гроб [172].

Необходимо подчеркнуть, что при всем разнообразии способов консервирования инъекция сосудов в XVII веке в практику еще не была введена. Применялось только погружение тела в жидкость или введение ее в ткани и полости.

В России в начале XVIII столетия был создан первый естественнонаучный музей, так называемая кунсткамера. В ней собирались главным образом тератологические уродства животных и человека, а также препараты, приобретенные Петром І у голландского анатома Рюйша [30]. Основным консервирующим средством при создании Петром Великим анатомического музея явился спирт. Для консервации своих препаратов Рюйш употреблял спирт, настоянный на черном перце и разбавленный до 75 градусов. Для инъекции сосудов он, предположительно, применил воск, с примесью красящих веществ [42].

Во второй половине XVIII века был опубликован способ В. Гюнтера (1718-1783), который также как и Рюйш применил инъекцию артериального русла целого трупа через бедренную артерию [18]. В качестве инъекционной массы применялась окрашенная киноварью смесь масел и скипидара и повторно -смесь скипидара, киновари, камфоры и спирта. После этого в полости засыпали порошок, составленный из желтой смолы, селитры и камфоры. Новый метод бальзамирования путем инъекций сосудов стал дополнять метод погружения всего трупа [117, 142, 143].

На протяжении всего XIX века было предложено множество различных способов, основанных на бальзамировании сулемой [213], что сохраняло трупы от гниения. Буде [211] употребил сулему в растворе спирта в сочетании с дубильными веществами с последующим лакированием тела, а Буатар [210] использовал спиртовый раствор сулемы без дубильных веществ, но с лакированием [137].

Оценка консервирующих способностей растворов неорганических ; производных азота в сравнении с раствором формалина и их влияние на качественное и длительное сохранение биологического материала

с раствором формалина и их влияние на качественное и длительное сохранение биологического материала Нами установлено, что при использовании азида натрия различной процентной концентрации (0,3%, 0,5%) в физиологическом растворе в качестве консерванта все испытуемые органы сохраняют прижизненный цвет, консистенцию, форму, прочность макроскопической структуры на протяжении всего срока фиксации - 15 месяцев (диаграммы 3.1, 3.2, 3.3). В то же время при низких концентрациях раствора 0,05% и 0,1% отмечается некоторое изменение цвета органов [58, 59].

Органы, фиксированные в 10% растворе формалина, приобретают выраженную плотную консистенцию, неприятный запах и грязно-бурый цвет в результате перехода гемоглобина крови в метгемоглобин уже через 6 часов от начала фиксации, что согласуется с данными литературы [112, 113]. Также зафиксировано заметное уменьшение размеров органов уже на 14 сутки от начала опыта. Такой дубящий эффект, исследователи связывают с изменением структуры белка [190]. Вышеуказанные изменения представлены на рис. 3.1, 3.2.

Сохранность макроструктуры биологического материала в растворах азида натрия различной процентной концентрации и в растворе 10% формалина Фиксирующие растворы 0,05% р-р азида натрия 0,1% р-р азида натрия 0,3% р-р азиданатрия 0,5% р-р азида натрия 10% р-р формалина Свойства Структура органа Нормальная Нормальная Нормальная Нормальная Уменьшение размеров Цвет Измененнезначительно Изменен незначительно Обычный Обычный Грязно-бурый Консистенция Нормальная Нормальная Нормальная Нормальная Оченьплотная Антибахтер-ное действие Недостаточно Достаточно Сильно выражено Сильно выражено Сильно выражено Форма органов Сохранена Сохранена Сохранена Сохранена Уменьшена

Из анализа данных таблицы 3.1. можно сделать заключение об оптимальной процентной концентрации растворов азида натрия для целей фиксации биологического материала. В частности, 0,05% и 0,1% растворы полностью не обеспечивают удовлетворительную сохранность цвета органов, как было описано ранее, хотя другие учитываемые параметры не изменялись (рис. 3.3).

В то же время 0,3% и 0,5% растворы азида натрия намного эффективнее сохраняют все наблюдаемые признаки органов на протяжении сроков фиксации 60 суток (рис. 3.4), 180 суток (рис. 3.5), 360 суток (рис. 3.6). Рис. 3.1. Фото фрагмента правой доли печени после фиксации в 10% формалине в срок до 30 суток. Размеры - уменьшены, цвет - изменен, консистенция - очень плотная. I- диафрагмальная поверхность. Макрофото. Ув. Рис. 3.2. Фото фрагмента нижней доли левого легкого после фиксации в 10% формалине в срок до 30 суток. Размеры - уменьшены, цвет - изменен, консистенция - очень плотная. 1- срез сегментарного бронха. Макрофото. Ув. Рис. 3.3. Фото фрагмента правой доли печени после фиксации в 0,1% растворе азида натрия в срок 60 суток. Цвет - светлее обычного, форма и структура органа сохранена. I- висцеральная поверхность. Макрофото. Ув. 15 Рис. 3.4. Фото фрагмента нижней доли левого легкого после фиксации в 0,3% растворе азида натрия в срок 60 суток. Цвет, форма и структура органа сохранена. 1 - срез междолькового бронха; 2 - инородное включение. Макрофото. Ув. ! Рис. 3.5. Фото фрагмента желудочков сердца в области завитка после фиксации в 0,5% растворе азида натрия в срок 180 суток. Цвет, форма и структура органа сохранена. 1- стенка левого желудочка; 2 -межжелудочковая перегородка; 3 - мясистые трабекулы. Макрофото. Ув. 15 Рис. 3.6. Фото сагиттального разреза левой почки и фрагмента мочеточника после фиксации в 0,5% растворе азида натрия в срок 360 суток. Цвет, форма и структура органа сохранена. 1 - лоханка; 2 - мочеточник; 3 - корковое вещество; 4 - жировые включения. Макрофото. Натуральная величина

Анализ соответственных наблюдений показывает, что формалин как консервант всегда изменяет структуру, цвет, консистенцию фиксируемых органов и поэтому не соответствует удовлетворительному сохранению биологического материала, при этом органы имеют еще и резкий запах, что безусловно сказывается на здоровье человека. Последний постулат оттеняется многими авторами [15, 93, 97, 100, 198].

Одновременно нами доказано, что при консервации в солевых растворах азидных производных сохраняются тинкториальные свойства гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином: ядра прокрашиваются базофильно, цитоплазма оксифильно, четко выявляется плазмолемма на протяжении всего срока фиксации. При исследовании тканей выявлено, что целостность клеточной стенки микроструктур сохраняется при сроке фиксации до 30 дней (рис. 3.9). Сохранность гистологических структур при фиксации органов в 10% формалине в срок 30 суток отражена на рис. 3.10, до 60 дней на рис. 3.12, 3.14 [58, 59].

Микрофото. Ув.: объектив 40, окуляр Рис. 3.14. Фото фрагмента паренхимы печени после фиксации в 10% формалине срок 60 суток. 1 - печеночная балка; 2 - ядро печеночной дольки.

Микрофото. Ув.: объектив 40, окуляр 10 При оценке консервирующих способностей растворов азида натрия на микроскопическом уровне (2304 наблюдения) выявлено, что фиксация в предложенных растворах всегда сохраняла тинкториальные свойства гистологических препаратов: ядра прокрашивались гематоксилином базофилыю, цитоплазма эозином - оксифильно, четко фигурировала плазмолемма при анализах их на протяжении 60 суток фиксации [59, 60].

Таким образом, полученные результаты гистологического исследования препаратов разнообразных тканей, фиксированных растворами азидных производных, позволяют заключить, что их консервирующая способность высока в течение длительного срока - до 60 суток. Такой временной период вполне достаточный для морфологического исследования секционного и операционного материала, поступающего в патологоанатомическую лабораторию больниц, с целью гистологической верификации диагноза.

При проведении микробиологического анализа подтверждено, что антибактериальные свойства выражены в меньшей степени у 0,05% раствора азида натрия, в отличие от растворов с большим процентным содержанием фиксирующего вещества [59, 60].

Сохранность макроструктуры фиксируемых органов при действии различных консервирующих растворов

Экологию внешней среды за счет летучести консервирующих растворов мы изучили на 15 лабораторных мышах и 20 крысах. Изучение токсичности (летучести) 0,5% раствора азида натрия. В опыте №1 наблюдали здоровых мышей обоего пола массой 19-21 г, на которых ранее не проводили никаких испытаний согласно методике Х1-ой ГФ (1990). За 24 часа до эксперимента и во время его проведения животные находились в помещении с постоянной температурой (20-21 С). Каждую серию препарата испытывали на 5 мышах: опытная группа животных №1 находилась под воздействием паров 10% формалина, другая опытная группа животных №2 - под воздействием 0, 5% солевого раствора азида натрия, а контрольная группа животных - под воздействием дистиллированной воды.

Опытный раствор №1 - 10% раствор формалина объемом 100 мл, опытный раствор №2 - 0,5% солевой раствор азида натрия объемом 100 мл, контрольный раствор - дистиллированная вода объемом 100 мл.

Ежедневно оценивали поведенческие реакции, наличие или отсутствие анорексии, цвет кожи, лишенной волосяного покрова, выпадение и изменение цвета шерсти. По окончанию эксперимента проводили гистологическое описание органов (печень, почка, сердце, легкое) убитых животных [79, 80].

В первые двое суток опыта №1 наблюдали анорексию у мышей, «дышавших» 10% формалином, замедленную реакцию на прикосновение, общую пассивность, максимальное удаление от чашки с формалином, иногда ступорозное состояние. Однако опытные животные, находившиеся вблизи с 0,5% раствором азида натрия, проявляли обычную двигательную активность, анорексия отсутствовала. В том и в другом опыте изменения цвета кожных покровов и выпадение шерсти не наблюдали.

На третий день в опытной группе мышей №1 в поведении отмечали агрессивность у особей мужского пола, с последующим развитием вторичной инфекции в ранах, которые возникли в результате драки между самцами, неустойчивый аппетит, цвет шерсти у всех особей имел желтую окраску. Животные опытной группы №2 по-прежнему сохраняли двигательную активность, адекватно реагировали на прикосновение, проявляли интерес к пище.

В течение четвертых и пятых суток у опытной группы животных №1 отмечали активность, сменяющуюся сонливостью или ступором, аппетит неустойчивый, открытые участки кожи бледные. Но в то же время опытная группа мышей №2 отличалась активной жизнедеятельностью на протяжении всего срока эксперимента.

По истечению 5 суток мы констатировали изменение массы тела у всех особей опытной группы №1 с 19-21 г до 17-19 г. Но у особей опытной группы №2 и контрольной масса тела не колебалась, были прежние показатели -19-21 г (табл. 3.15).

По окончанию эксперимента были проведены эвтаназия (парами эфира) и забор органов (печень, почка, сердце, легкое) для гистологического исследования. Причем шерсть и внутренние органы опытной группы животных №1 издавали резкий запах формалина, у всех особей печень и почки отличались более бледной окраской, чем прижизненная, и «дряблой» консистенции. Одновременно наблюдалось массивное выпадение пожелтевшей шерсти сразу после эвтаназии у мышей, находившихся под влиянием паров формалина.

Органы опытной группы животных №2 и контрольных особей имели первоначальный прижизненный цвет, выпадение шерсти у них не отмечали, при этом запах каким-либо химическим веществом отсутствовал.

Таким образом, данные, полученные при исследовании опытного раствора №1, свидетельствуют о том, что 10% раствор формалина оказывает токсическое воздействие на общее состояние животных, снижает иммунный

Ответ, что приводит к возникновению вторичной инфекции, вызывает анорексию с изменением массы тела, что характерно для токсичности (летучести).

Объем опытного раствора №1 10% формалина уменьшился со 100 до 60 мл (испарился), а объемы опытного раствора №2 0,5% азида натрия и контрольного - дистиллированной воды как и вначале эксперимента перманентными и составляли по 100 мл (табл. 3.16).

Как видно результаты исследования опытного раствора №2 позволяют судить о том, что 0,5% солевой раствор азида натрия не летуч и не оказывает какого-либо отрицательного воздействия через дыхательные пути на организм животных.

Органы животных опытной группы №1 (с формалином): -почка — клубочки округлой формы, просвет капсулы Шумлянского -Боумена не определяется, пролиферация мезангия, в эпителии извитых канальцев тотальная белковая дистрофия, местами с явлениями очагового некробиоза; просвет канальцев иногда резко сужен, вплоть до их полного отсутствия; сосудов незначительное количество с истонченными стенками, периваскулярное диапедезное кровоизлияние вокруг них; в некоторых клубочках отсутствуют сосудистые петли.

Похожие диссертации на Применение азидных производных в консервации биологического материала [Электронный ресурс]

Клинико-морфологическая характеристика слизистой оболочки десневой борозды при применении различных композиционных пломбировочных материаловАртамонова Наира Варужановна

Физиолого-биохимическая характеристика базидиомицета Panus tigrinus и его применение для получения прессованных материаловШутова Виталина Викторовна

Нанобиокомпозитные материалы с использованием оксидоредуктаз: получение, свойства и применениеЗейфман Юлия Сергеевна

Изучение свойств полимерных пленок для применения их в качестве экологически безопасных упаковочных материаловВалгин Денис Дмитриевич

Применение термодинамического резерва для минимизации антропогенного воздействия обжиговых технологий производства строительных материалов на окружающую средуЗуева Наталия Александровна

Ультрадисперсные материалы на основе рения : синтез предшественников, свойства и применение материаловПетракова Ольга Викторовна

Экспериментально-клиническое обоснование применения материала на основе эластичного полиуретана для изготовления индивидуальных защитных спортивных каппХан, Александр Владиславович

Применение материалов съемки длиннофокусными аэрофотоаппаратами в кадастре земель сельских поселений области : На примере Ярославской областиБарцев Александр Васильевич

Минерализация опресненной воды с применением материалов, содержащих CaCO3Ерохин Михаил Александрович

Морфоструктурный анализ рельефа южного склона Юго-Восточного Кавказа с применением материалов дешифрирования космофотоснимков Ализаде ЭлЬбрус Керим оглы