Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Кататонические реакции как форма психопатологии человека и их значение для животных 1.1.1. Кататония в психиатрической классификации 12
1.1.2. Кататонические реакции у животных
1.1.3. Механизмы развития кататонии 21
1.1.4. Моделирование кататонии на животных. Линия крыс ГК. 24
1.2. Постурально-моторные реакции в раннем постнатальном онтогенезе 31
1.2.1. Развитие постурально-моторных реакций у крыс в раннем постнатальном онтогенезе 34
1.2.2. Центральные генераторы ритмической активности 38
1.2.3. Роль модуляторных проекций в развитии нейронной сети центрального генератора ритмической активности 43
1.2.4. Роль нейротрансмиттеров в модулировании двигательных паттернов 45
ГЛАВА 2. Материалы и методы 51
2.1. Экспериментальные животные 51
2.2. Поведенческие тесты 51
2.2.1. Тест по моторным подсистемам 51
2.2.2. Оценка двигательных реакций взрослых животных 52
2.3. Метод определения содержания моноаминов в мозге 54
2.4. Определение содержания моноаминов мозга в неонатальном периоде онтогенеза 60
2.5. Определение содержания моноаминов мозга у взрослых животных 61
2.6. Оценка показателей массы тела в онтогенезе 61
2.7. Статистическая обработка результатов 62
ГЛАВА 3. Результаты исследований
3.1. Характеристика кататонических реакций у крыс линии ГК на современном этапе селекции 63
3.2. Постурально-моторные реакции крыс линии ГК в неонатальном периоде онтогенеза (75-е поколения селекции) 71
3.3. Содержание нейромедиаторов мозга у крыс линии ГК в неонатальном периоде развития и в половозрелом возрасте 77
3.4. Исследование изменения показателей массы тела у крыс линии ГК в онтогенезе 84
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 86
Выводы 100
Список литературы
- Кататония в психиатрической классификации
- Центральные генераторы ритмической активности
- Тест по моторным подсистемам
- Постурально-моторные реакции крыс линии ГК в неонатальном периоде онтогенеза (75-е поколения селекции)
Введение к работе
Актуальность проблемы
Кататония (от греч. katatonos - натянутый) - психопатологический синдром, основным клиническим проявлением которого являются двигательные расстройства. В настоящее время кататония не признается как отдельное заболевание, ее связывают с психическими состояниями, такими как шизофрения (кататонический тип), биполярные расстройства, посттравматические стрессовые заболевания, депрессии и другие заболевания, а также со злоупотреблением или передозировкой лекарств. Встречаемость кататонии среди психиатрических пациентов составляет 7-31%, из которых 20-25% - пациенты с шизофренией, 28-31% - пациенты с аффективными расстройствами и 20-25% кататонии обусловлено соматическими состояниями (Daniels, 2009). Кататонические реакции встречаются и у животных и представляют собой одну из филогенетически древних форм реагирования на пугающие стимулы (Gallup, Maser, 1977; Hennig, 1978; Holcombe et al., 1979; Perkins, 1982; Krystal, 1993; Overeem et al., 2002; Moskowitz, 2004). Однако, несмотря на частые случаи возникновения, кататония по-прежнему остается недостаточно понятым, плохо изученным и плохо распознаваемым синдромом.
Одним из подходов к исследованию феномена кататонии является создание модели данной патологии на лабораторных животных с последующим изучением причин и механизмов возникновения кататонических реакций. Линия крыс ГК (от инициалов слов «генетическая» и «кататония») была предложена д.б.н. В.Г. Колпаковым в качестве модели шизофренной психопатологии (Колпаков и др., 1985; Колпаков, 1990; Kolpakov et al, 1986; Kolpakov et al., 1996). Животные аутбредной линии ГК на сегодняшний день характеризуются поведением двухполюсной природы. К негативному полюсу относят реакции застывания с элементами каталепсии, а к позитивному полюсу - гиперкинетическис реакции (Колпаков и др., 2004). Генетически обусловленные особенности поведения крыс кататонической линии характерны для взрослых животных. Однако проявление поведенческих реакций, предшествующих кататоническому поведению взрослых крыс в раннем постнатальном онтогенезе, еще не было описано. Вместе с тем, изучение потомства с первых дней жизни от генетически предрасположенных к кататонии животных имеет фундаментальное значение, как для науки, так и для практической медицины. К настоящему времени накоплены данные о ранних признаках повышенной «готовности» нервной системы к психическим расстройствам эндогенного круга у детей младенческого и более позднего возраста. К таким признакам, прежде всего, можно отнести повышенную чувствительность и гиперактивность, дезорганизацию постурально-моторного развития, нарушение моторной координации и равновесия, отставание в весе (McNeil et al., 1993; Rosso et al., 2000; Schiffman et al., 2009). Все эти отклонения могут рассматриваться как маркеры генетически обусловленного дефекта в психических расстройствах различного рода, в том числе и кататонических.
В связи с этим селекционная модель кататонии представляет большую ценность для изучения поведения в раннем онтогенезе. К тому же, использование данной модели позволяет определить степень участия нейротрансмиттерных систем в развитии кататонических отклонений на раннем этапе постнатального онтогенеза. Наиболее важными для исследования представляются серотонинергическая и норадренергическая системы, поскольку они обе регулируют развитие центральной
нервной системы (Murrin et al., 2007), обе они вовлекаются в формировании двигательных реакций у неонатальных крыс (Kjaerulff et al., 1994; Kiehn et al., 1999; Ballion, 2001; Pflieger et al., 2002; Norreel et al., 2003; Gerin et al., 2008; Klein et al., 2010; Tartas et al., 2010) и обе участвуют в кататонических реакциях (Tsukamoto et al., 1981; Blizard et al., 1983; Tom et al., 1983; Popova, Kulikov, 1995; Popova, 1999).
Исходя из вышесказанного, была поставлена цель: изучить развитие постурально-моторных реакций и особенности нейрохимической регуляции у крыс линии ГК в неонатальном периоде онтогенеза при сопоставлении с взрослыми животными на современном этапе селекции. В задачи исследования входило:
-
Изучить проявление кататонических реакций у взрослых крыс линии ГК в период с 63-го по75-е поколения селекции.
-
Определить содержание моноаминов в различных структурах мозга у животных кататонической линии.
-
Исследовать постурально-моторные реакции у крысят линии ГК в неонатальном периоде онтогенеза.
-
Определить уровень моноаминов мозга у крысят линии ГК на 1-й, 7-й, 10-й и 14-й дни.
-
Оценить параметры массы тела у крыс линии ГК, начиная со дня рождения и до 6-месячного возраста по сравнению с контрольной линией Вистар.
Научная новизна работы
В данной работе впервые изучено становление постурально-моторных реакций в неонатальном периоде онтогенеза у крыс кататонической линии. Выявлено повышенное количество дискинетических движений и поз в 1-2 дни постнатального онтогенеза и сниженная двигательная активность в последующие дни неонатального периода. Показано прогрессирующее отставание в весе крыс линии ГК от крыс линии Вистар, начиная с первого дня жизни и кончая половозрелым возрастом. Показан измененный баланс по уровню нейротрасмиттеров мозга в неонатальном периоде онтогенеза: активность серотонинергической системы снижена, в то время как активность норадреналинергической системы повышена.
Впервые дана характеристика кататонических реакций крыс линии ГК с помощью теста с применением звукового сигнала. Показана положительная корреляция реакций возбуждения, выявленных по селекционному критерию и по новому методу с использованием звукового сигнала, у крыс обеих линий. Между реакциями застывания и возбудимости обнаружена обратная зависимость у крыс линии ГК и прямая зависимость у крыс линии Вистар.
Теоретическая и научно-практическая ценность работы
Настоящая работа расширяет представление о механизмах кататонических реакций. Выявленные отклонения в развитии постурально-моторной системы у крысят линии ГК в неонатальном периоде онтогенеза могут рассматриваться в качестве предикторов кататонии. Это является важным в теоретическом отношении для понимания развития кататонии. Данные об особенностях нейрохимической регуляции в генезе кататонических реакций в неонатальном периоде могут иметь значение в исследованиях патологий раннего развития. Также полученные результаты могут быть использованы в разработке оптимальных способов коррекции кататонических реакций в раннем постнатальном онтогенезе.
Положения, выносимые на защиту
-
На современном этапе селекции в 63-75 поколениях крыс линии ГК увеличилась доля высоковозбудимых животных с преобладанием гиперкинетических реакций. Впервые за весь период селекции процент высоковозбудимых крыс в кататонической линии стал выше, чем процент «застывающих».
-
Смещение полюса кататонических реакций а линии ГК сопровождалось изменениями на нейрохимическом уровне, которые заключаются в нивелировании различий по содержанию норадреналина (НА), серотонина (5-НТ) и 5-гидроксиндолускусной кислоты (5-ГИУК) в лобной коре, полосатом теле, гипоталамусе, миндалине и гиппокампе по сравнению с крысами линии Вистар.
-
У крыс кататонической линии в первые два дня неонатального периода повышена двигательная активность с превалированием дискинетических движений и асимметричных поз, а с 3-го по 14-й дни отмечена сниженная двигательная активность по всем кинематическим параметрам по сравнению с крысами линии Вистар.
-
Особенностями нейромедиаторной регуляции у крыс линии ГК в неонатапьном периоде является сниженная функциональная активность серотонинергической системы по показателям содержания 5-НТ и 5-ГИУК в мозге, а также повышенное содержание НА в мозге по сравнению с крысами линии Вистар.
Апробация результатов
Материалы диссертации обсуждались на конференции «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008), на VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), на Четвертой и Шестой Всероссийской конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009; 2011). Также полученные результаты были представлены и обсуждены на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 2010).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей в рецензируемых отечественных изданиях и 1 статья в иностранном журнале. Кроме того, опубликовано 5 тезисов в сборниках трудов конференций.
Структура и объем работы
Кататония в психиатрической классификации
Несомненно, кататония всегда была свойственна людям, хотя первое упоминание об этом синдроме в англоязычной литературе зафиксировано лишь в 1583 г Ф. Барроугом, который описал пациента в состоянии ступора (цит. по Fink, Taylor, 2003). В последующие годы также встречались сообщения о больных с элементами кататонии в виде ступора, «восковидной гибкости» и негативизма, однако эти хорошо известные психиатрам симптомы не были логически последовательно связаны. Концепция кататонии основана немецким психиатром К. Кальбаумом, который впервые использовал этот термин в 1869 г и описал как самостоятельное психическое заболевание в своей монографии «Кататония или наряженное помешательство» («Die Katatonia oder das Spannungsirresein») в 1874 г (Moskowitz, 2004). Он рассматривал кататонию, как прогрессирующее расстройство, тесно связанное с аффективными и органическими заболеваниями, обычно начинающееся с изменения настроения, но иногда возникающее резко, особенно после очень сильного физического и психического стресса (Moskowitz, 2004). К. Кальбаум определял кататонию, как специфические нарушения моторной функции, включая стереотипии, каталепсию («восковая гибкость»), негативизм, повторение бессмысленных фраз и слов, ненаправленное двигательное возбуждение (Carroll, 2001; Taylor, Fink, 2003; Moskowitz, 2004). Эти двигательные нарушения, по его мнению, представляли собой фазы в прогрессирующей болезни, которая включает этапы мании, депрессии и психоза и обычно заканчивается слабоумием («dementia») (Taylor, Fink, 2003).
Хотя многие авторы поддерживали точку зрения Кальбаума, самостоятельность кататонии как заболевания признавалась далеко не всеми клиницистами, что вызывало международные споры среди психиатров. Это привело к появлению двух основных школ, первая поддерживала предположения Кальбаума о самостоятельности заболевания, вторая, напротив, рассматривала кататонию, как осложнение различных патофизиологии, а не как отдельное заболевание (Fink et al., 2009).
Значительное влияние на дальнейшую классификацию кататонического синдрома оказал Э. Крепелин, который включил кататонию в группу заболеваний раннего слабоумия, впоследствии переименованную Е. Блейером в шизофрению, однако оба автора признавали, что этот феномен может наблюдаться и при других психических расстройствах (Carroll, 2001; Fink, Taylor, 2003; Moskowitz, 2004; Carroll et al., 2008). На протяжении большей части 20-го века врачи считали кататонию исключительно подтипом шизофрении, несмотря на то, что многие выступали против этой точки зрения. Эта доминирующая идея о связи кататонии и шизофрении была закреплена во всех изданиях руководств по диагностике и статистике психических заболеваний (до публикации DSM-IV в 1994 г) и в международных классификациях болезней (Taylor, Fink, 2003; Moskowitz, 2004). Все это время диагностическое и терапевтическое значение кататонии в нозологии шизофрении оставалось неясным.
Изменения в DSM-IV последовали за серией публикаций, в которых кататония была найдена более частым синдромом при аффективных расстройствах, нежели при шизофрении (Morrison, 1973; Abrams, Taylor, 1976; Gelenberg, 1976; Abrams et al., 1979; Johnson, 1984; Ries, 1985) и при широком спектре серьезных заболеваний, включая вирусные инфекции (такие как энцефалиты), токсические отравления, метаболические заболевания и идиопластические ответы на медикаментозное лечение (Gelenberg, 1976; Barnes et al., 1986; Carroll, 1992; Popkin, Tucker, 1992).
В настоящее время кататония не признается как отдельное заболевание, ее связывают с психическими расстройствами, такими как шизофрения (кататонический тип), биполярные расстройства, посттравматические стрессовые заболевания, депрессии и другие заболевания, а также со злоупотреблением или передозировкой лекарств. В то же время данный синдром может наблюдаться во многих соматических заболеваниях, включая инфекции (например, энцефалиты), аутоиммунные заболевания, очаговые неврологические заболевания, нарушения обмена веществ и при резком или слишком быстром введении бензодиазепинов. Это может быть и неблагоприятной реакцией на предписанные лекарственные вещества.
Согласно современной международной классификации болезней ВОЗ (International Classification of Mental and Behavioural Disorders (ISD-10)- МКБ-10, 1992) кататонический симптомокомплекс постулируется в рамках рубрик: «кататоническая шизофрения» - (F20.2), «тяжелый депрессивный эпизод с психотическими симптомами" - (F32.3), «мания с психотическими симптомами» - (F30.2), «органическое кататоническое расстройство» -(F06.1). В текущей редакции DSM-IV (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 1994) кататонический синдром включен в диагнозы «шизофрения, кататонический тип» (код 295.20), «кататоническое расстройство, обусловленное соматическим состоянием» (код 293.89), также отмечается возможность возникновения кататонической симптоматики в рамках «большого депрессивного эпизода» и «биполярного аффективного расстройства как I, так и II типа», но без отдельных диагностических кодов. В то же время диагноз «злокачественный нейролептический синдром», который некоторые считают формой злокачественной кататонии (Fricchione, 1985; Ahuja, Nehru, 1990; Fink, 1996; Fricchione et al., 2000; Fink, Taylor, 2003), указан отдельно в качестве вызванного лекарствами двигательного расстройства (333.92).
Как и в МКБ-10, в DSM-IV отсутствует отдельная диагностическая категория для кататонии, обусловленной депрессией или манией, но кататония может быть дополнительным специфическим признаком при аффективных расстройствах.
Центральные генераторы ритмической активности
За весь длительный период селекции линии ГК, насчитывающей на данный момент 75 поколений, частоту животных, у которых при тестировании можно вызвать каталептическое застывание, не удалось довести до 100%). Вместе с тем, значительный процент животных проявляет поведение, условно названное «нервным». Среди контрольных крыс Вистар такое поведение наблюдается в единичных случаях (Барыкина и др., 2002).
Следует помнить, что частота «нервных» крыс в линии ГК возрастала, несмотря на то, что селекция на «нервность» не проводилась. Наоборот, отбор на этот признак был даже в некотором смысле отрицательным, поскольку сильно выраженная «нервность» препятствовала застыванию при тестировании. Тот факт, что селекция крыс на длительное и интенсивное застывание привела к высокой частоте «нервных» животных в этой линии (Nikulina et al., 1987; Амстиславский и др., 2000; Барыкина и др., 2002), указывает на тесную связь между каталептическим застыванием и «нервностью».
В попытке ответа на вопрос, является ли нарастание «нервности» и снижение частоты каталептической реакции, происходящее, несмотря на селекцию, именно в пользу застывания, проявлением одного биполярного кататонического генотипа, или же сочетание каталепсии и «нервности» в линии ГК случайно, были проведены гомогенные скрещивания застывающих и «нервных» крыс. В результате дифференциальной селекции из S55 линии крыс ГК в течение трех поколений не удалось разделить гиперкинетическую и акинетическую реакции (Алехина и др., 20056). Повторная селекция крыс в течение 5 поколений из аутбредной популяции Вйстар, проведенная (в отличие от предыдущей селекции) отдельно на предрасположенность к каталепсии и на «нервность», подтвердила прежние данные о том, что каталепсия и «нервность» представляют два фенотипических проявления одного биполярного кататонического генотипа (Чугуй и др., 2007).
Кроме того, для животных линии ГК, помимо предрасположенности к длительному застыванию (Барыкина и др., 1983), также была показана более выраженная, чем у крыс Вйстар, нейролептическая (Колпаков и др., 1995), щипковая (Колпаков и др., 1999а) и послесудорожная каталепсия (Kolpakov et al, 1996). Что касается противоположного полюса, психомоторного возбуждения, то было показано, что около 90% крыс ГК реагируют на манипуляции испугом, агрессией и вокализацией, тогда как крысы линии Вйстар в этих условиях ведут себя спокойно (Nikulina et al., 1987; Петрова, 1990; Kolpakov et al., 1996). Помимо этого, крысы линии ГК проявляют повышенную, примерно в два раза, амплитуду акустического рефлекса вздрагивания (Popova et al., 2000) и увеличенную в три раза межсамцовую агрессию, вызванную электрическим раздражением (Nikulina et al., 1987) по сравнению с крысами линии Вйстар.
Таким образом, крысы линии ГК с генетически наследуемой кататонией характеризуются двухполюсным поведением. Во-первых, кататоническим застыванием или ступором с пластическим и ригидным тонусом. Животные, проявляющие такие реакции, были названы «застывающими» или «каталептическими». Во-вторых, кататоническим возбуждением, которое проявляется в виде повышенной тревожной возбудимости, пароксизмальных побежек, вокализации. Эти реакции были названы «нервными». Часть крыс линии ГК, демонстрирующие как «нервность», так и застывание, были названы «нервно-застывающими». Подобное двухполюсное поведение, наблюдаемое у крыс линии ГК, имеет сходство в проявлении с кататоническим синдромом, что позволяет использовать эту линию в качестве модели исследования.
Поскольку кататонический синдром может наблюдаться и при кататонической форме шизофрении, и при аффективных расстройствах, неудивительно, что крысы линии ГК предлагались в качестве моделей этих патологий (Колпаков и др., 2004). На наш взгляд, более правильно рассматривать животных линии ГК в качестве модели кататонии -уникального синдрома, который встречается как при функциональных, так и при органических расстройствах. Данный синдром требует собственного лечения, независимо от вызвавшего ее расстройства (Rajagopal, 2007). Тот факт, что экспрессия кататонии не меняется, связана ли она с опасными для жизни заболеваниями или подавленным настроением при аффективных состояниях (Carroll et al., 2001), и отвечает на лечение, не влияющее на основное заболевание, при котором наблюдается кататонический синдром (Fink, Taylor, 1991; Ungvari et al., 2001), предполагает, что кататонию лучше всего рассматривать не как компонент этих различных заболеваний, а как реакция на них (Moskowitz, 2004). Согласно точке зрения М. Финка, требуется пересмотр положения кататонии в современной психиатрической классификации и признание ее, как независимого синдрома (Fink, 2009). Признание этого факта является критическим в продвижении нашего понимания и лечения патологически выраженной кататонии.
Многочисленные исследования, проведенные на животных линии ГК, указывают на генетическую предрасположенность к кататоническим реакциям, которые проявляются у животных данной линии во взрослом состоянии (Барыкина и др., 1983; Колпаков и др., 1999а; Чугуй и др., 2007). Однако вопрос о том, на каком этапе онтогенеза впервые возникают поведенческие отклонения, и что может служить предиктором этих отклонений у животных кататонической линии, остается неясным. В связи с этим изучение постурально-моторных реакций у крыс линии ГК в раннем онтогенезе является актуальной задачей настоящего исследования.
Тест по моторным подсистемам
Для определения 5-ГИУК к 4,5 мл органической фазы добавляли 0,6 мл фосфатного буфера, пробы встряхивали 10 мин. и центрифугировали 10 мин. при 2000 об/мин. и 4С, при этом 5-ГИУК экстрагируется в фосфатный буфер. Органическую фазу отбрасывали водоструйным насосом, а 0,2 мл водной фазы использовали для определения. К ним прибавляли 0,02 мл 1% Г-цистеина, способствующего образованию флуорофора, 0,4 мл 0,1% ОРТ в НСІконш пробы нагревали 10 мин. в водяной бане при 80С, охлаждали и затем измеряли флуоресценцию.
Измерения проводили на приборе Victor (фирма «Perkin Elmer», США) на волнах 355/460 нм. Содержание медиатора в ткани рассчитывали на основании того, что концентрации веществ в тканевых пробах и стандартах лежат в диапазоне линейной зависимости флуоресценции от концентрации, по формуле: Содержание = 1000 M (FT-Fn) 1.4 (мкг/кг) m (FcT-Fn) где М - содержание медиатора в стандарт-пробе; m - вес образца в мг; FT -флуоресценция тканевой пробы; Fn - флуоресценция пустой пробы; FCT -флуоресценция стандарта; 1.4 - отношение объема гомогената к объему супернатанта. Таблица 1. Определение содержания моноаминов флюориметрическим методом гомогенизация образца в 3,5 мл НС1-бутанола центрифугирование гомогената (10 минут, 2000 оборотов/мин, 0С)Супернатант (2,5 мл): + 0,1мл0,01ЫНС1.+ 5 мл н-гептана + 0,4 мл 0,1NHC1. встряхивание (10 мин) центрифугирование (10 мин, 2000 оборотов/мин, 0С)
Определение НА Определение 5-НТ Определение 5-ГИУК 0,2 мл водной фазы + 0,05 мл 0,4 N НС1 + 0,1 млОДМЭДТА + 0,1 мл йодного реактива2 мин + 0,1 мл щелочного р-ра Na2S031,5 мин + 0,1 мл 10NCH3COOHнагревание на водяной бане (98С, 6 мин)охлаждение до комнатной температуры 0,1 мл водной фазы + 0,6 мл 0,004% раствора ОРТ в 1 ON НС1нагревание на водяной бане(80С, 15 мин)охлаждение до комнатной температуры 4,5 мл органическойфазы+0,6 мл фосфатногобуферавстряхивание (10 мин)центрифугирование (10мин, 2000 оборотов/мин,0С).0,2 мл водной фазы +0,02 1%Ь-цистеина +0,4 мл 0,1% ОРТ внагревание на водяной бане(80С, 10 мин) охлаждение до комнатной температуры
Измерение флюоресценции на приборе Victor (фирма «Perkin Elmer», США)на волнах 355/460 нм 2.4. Определение содержания моноаминов мозга в неонатальном периоде онтогенеза
С целью соотнесения изменений поведения в раннем онтогенезе с активностью медиаторных систем было измерено содержание моноаминов на 1-й, 7-й, 10-й и 14-й дни неонатального периода у крыс линии ГК 75-го поколения селекции и у контрольных животных Вистар. Эти точки онтогенеза были выбраны на основании анализа литературных данных (Clarac et al., 2004; Schank, 2008) и соответствуют критическим периодам неонатального развития: 1 день - рождение, адаптация к новым внеутробным условиям среды, изменение ритма центрального нейронного генератора в соответствии с сенсорным притоком информации; 7 день - развитие кортикоспинального тракта, животные начинают поворачивать корпус, и появляются циркулярные движения; 10 день - ускоренное функциональное созревание задних конечностей, тазовая область начинает поддерживать вес тела, крысята обретают способность подниматься на все 4 лапы, появляются первые локомоции; 14 день - появляется способность сидеть на задних конечностях и использовать передние лапы для манипуляций, открытие глаз и ушных раковин, поток сенсорной информации, влияющей на двигательную активность.
Животных быстро декапитировали; выделяли полушария (переднюю часть) и ствол (средний мозг, Варолиев мост и продолговатый мозг). Выделенные структуры замораживали в жидком азоте и хранили при -80С до дня определения содержания в них НА, 5-НТ и 5-ГИУК. Перед определением замороженные образцы ткани взвешивали. Всего в эксперимент было взято 80 животных, по 10 в каждой группе.
Для исследования зависимости форм поведения, наблюдаемых у крыс линии ГК на современном этапе селекции, от соотношения активности моноаминов мозга определяли содержание 5-НТ, 5-ГИУК и НА в таких структурах мозга, как лобная кора, полосатое тело, миндалина, гипоталамус, гиппокамп. Выбор этих структур обусловлен тем, что ранее уже было показано их участие в реализации кататонического поведения у крыс линии ГК (Попова и др., 1985; Алехина и др., 1987; Алехина, 1989; Alekhina et al., 1994; Колпаков и др., 2001; Алехина и др., 2005а; Алехина и др., 2006). Исследования были выполнены на половозрелых 3-месячных крысах линии ГК 63-65 поколений селекции и крысах линии Вистар. Всего в эксперимент было взято 20 животных, 10 крыс линии ГК и 10 крыс линии Вистар.
Поскольку масса тела в раннем постнатальном периоде служит достаточно объективным показателем степени физического развития, было целесообразно оценить динамику этого показателя в онтогенезе. Измерения массы тела крыс линии ГК и Вистар проводили на самцах путем взвешивания в возрасте 1 день, 7 дней, 10 дней, 14 дней, 20 дней, 1 месяц, 3 месяца и 6 месяцев. Исследования выполнены на 160 животных из вышеуказанных линий. 2.7. Статистическая обработка результатов
Данные представлены в виде среднего значения с ошибкой (mean ± SEM). В случае нормального распределения оценку достоверности различий между группами проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Для оценки различий между процентными долями двух выборок использовали р-критерий. Оценку двигательного поведения неонатальных крысят с 3-го по 14-й дни и содержание нейротрансмиттеров в ненатальном периоде проводили с помощью многофакторного дисперсионного анализа ANOVA/MANOVA. Для парных сравнений использовали пост-хок тест Ньюмана-Кейла.
Для оценки поведения взрослых животных использовали непараметрическую статистику, поскольку тесты Колмагорова-Смирнова и Шипиро-Уллка показали отклонения распределений от нормального. Различия между группами оценивались с помощью U-теста Манна-Уитни. При сравнении тестов «на каталепсию» и «на звонок» использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Во всех случаях в качестве статистически достоверного принимался уровень значимости от р 0.05. Статистическая обработка результатов проведена с использованием пакета компьютерных программ STATISTICA 6.0.
Постурально-моторные реакции крыс линии ГК в неонатальном периоде онтогенеза (75-е поколения селекции)
В настоящем исследовании был продолжен отбор животных линии ГК на пассивно-оборонительные реакции застывания с 63-го по 75-е поколения. Были проанализированы данные тестов на кататонические реакции, полученные на более ранних поколениях селекции. В ходе селекции крыс на каталептическое застывание наблюдалось прогрессирующее изменение выраженности поведенческих признаков, что привело к возросшей частоте «нервных» крыс с преобладанием гиперкинетических реакций, и они стали превалировать над количеством застывающих крыс в линии ГК. Кроме того, в настоящем исследовании с помощью двух тестов - теста по селекционному критерию и теста с использованием звукового стимула, было показано преобладание гиперкинетических реакций у крыс линии ГК по сравнению с крысами линии Вистар. Исходя из полученных данных, можно заключить, что на современном этапе селекции крысы линии ГК характеризуются двойственным проявлением реакций - в виде акинетического компонента кататонии, или каталепсии, и гиперкинетического компонента, или «нервности», с преобладанием последнего.
Увеличение количества высоковозбудимых или «нервных» животных в линии ГК отмечалось уже с 40-го поколения селекции (Амстиславский и др., 2000; Барыкина и др., 2002) и на современном этапе их доля в линии увеличилась еще больше (до 60-70% крыс на каждое поколение). Тот факт, что селекция крыс на длительное и интенсивное застывание привела к высокой частоте «нервных» животных в линии ГК, указывает на тесную функциональную связь между каталептическим застыванием и «нервностью». Эта связь между предрасположенностью к каталепсии и «нервностью» наблюдалась уже на 7 - 8 поколениях селекции на фоне действия метилфенидата. У крыс линии ГК достоверно чаще, чем у крыс линии Вистар, появлялись «гиперкинетические» реакции, оцениваемые по шкале Эллинвуда - Балстера (Ellinwood, Balster, 1974) в ответ на введение метилфенидата (Kolpakov et al., 1981; Барыкина и др., 1983; Kolpakov et al., 1996). Очевидно, что гиперкинетический компонент кататонических реакций проявлялся и в повышенной в 3 раза «раздражительной агрессивности» у крыс линии ГК 20 - 21 поколений селекции, по сравнению с крысами линии Вистар (Nikulina et al., 1987; Алехина и др., 1995). Связь между двумя типами реакции выражалась и в характерной для 50-х поколений селекции линии ГК повышенной амплитуде рефлекса вздрагивания (Колпаков и др., 1999а; Попова и др., 1999а, 19996; Амстиславский и др., 2000).
Согласно данным, полученным при дифференциальной селекции крыс отдельно на застывание и отдельно на «нервность» в течение трех поколений из S55 линии крыс ГК и повторной селекции крыс в течение 5 поколений из аутбредной популяции Вистар, каталепсия и «нервность» представляют два фенотипических проявления одного биполярного кататонического генотипа (Алехина и др., 20056; Чугуй и др., 2007). Совместное наследование этих двойственных реакций позволяет предположить, что существует также общий физиологический механизм, определяющий уровень возбудимости и регулирующий интенсивность проявления указанных компонентов.
Отбор на акинетический компонент кататонических реакций оказался малоэффективным, поскольку его экспрессия является довольно лабильной и, очевидно, сильнее зависит от среды, чем экспрессия фактора, контролирующего общий механизм возбудимости (Барыкина и др., 2004). Действительно, на протяжении селекции наблюдалась синхронность в динамике появления каталептических крыс в линии ГК и Вистар, тестирование которых проводилось в одно и то же время. Обнаруженная положительная корреляционная связь (г=0,53; р 0,05) между частотой возникновения каталептических реакций у крыс линии ГК и Вистар, вполне вероятно, отражает влияние внешних факторов на проявление реакции застывания. Возможно, это было причиной относительно низкой эффективности селекции непосредственно на длительность застывания, поскольку довести частоту «застывающих» животных в линии ГК до 100% так и не удалось.
Гиперкинетический компонент поведения, или «нервность», менее подвержен таким влияниям, чем собственно каталепсия. Так, в предыдущих работах показано влияние материнской среды на длительность каталепсии и отсутствие такового на амплитуду рефлекса вздрагивания (Амстиславский и др., 2000). Факторы, обусловливающие повышение частоты «нервности» и снижение частоты каталептических крыс в процессе селекции линии ГК, требуют специального исследования. Возможно, причиной относительно низкой эффективности селекции линии ГК непосредственно на длительность застывания была зависимость экспрессии каталептической реакции от факторов внешней среды.
Для оценки каталептических реакций, а также «нервности» традиционно используется тест по селекционному критерию (Барыкина и др., 1983; Алехина и др., 2009). Этот тест в большей степени учитывает акинетический компонент двигательного поведения и, на наш взгляд, недостаточно четко описывает «нервные», или гиперкинетические реакции. Так, согласно тесту по селекционному критерию крыс определяли «нервными», если при попытках манипулирования с ними они проявляли не менее двух из следующих признаков: 1) вокализация; 2) безудержный бег и метание по клетке; 3) попытки выпрыгнуть из клетки (Колпаков и др., 1999 б). В настоящем исследовании мы ранжировали «нервные» реакции. В тесте по селекционному критерию были модифицированы параметры «нервности». Дополнительно к этому было проведено тестирование животных с использованием звукового сигнала, что позволило, на наш взгляд, оценить гиперкинетический компонент поведения более объективно.
