Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 13
1.1. Особенности структурно-функционального созревания различных отделов конечного мозга в онтогенезе крыс 14
1.1.1 Развитие сенсомоторной коры крыс в онтогенезе 23
1.1.2 Развитие стриатума крыс в онтогенезе 33
1.1.3 Развитие гипокампа крыс в онтогенезе 39
1.2. Нейродегенерация и типы клеточной гибели 45
1.3. Влияние гипоксического воздействия на нервную ткань .53
1.4 Нарушение формирования отделов конечного мозга в эмбриогенезе 69
1.5 Влияние условий пренатального развития на формирование двигательного поведения, памяти и способности к обучению в онтогенезе крыс 71
ГЛАВА 2. Методика исследования 74
2.1 Модель пренатальной нормобарической гипоксии 74
2.2 Светооптический метод Ниссля 75
2.3 Иммуногистохимические методы 76
2.4 Компьютерная морфометрия 81
2.5 Классификация клеток при помощи кластерного анализа .82
2.6 Исследование поведения животных 83
ГЛАВА 3. Результаты исследования 85
3.1 Исследование поведения животных 85
3.2 Иммуногистохимическое исследование белка шипикового аппарата синаптоподина 86
3.2.1 Сенсомоторная кора 86
3.2.2 Дорсальный гиппокамп 87
3.2.3 Дорсолатеральный стриатум 88
3.3 Количественные изменения клеточного состава и общей плотности расположения клеток у животных, перенесших пренатальное гипоксическое воздействие 89
3.3.1 Сенсомоторная кора 89
3.3.2 Дорсальный гиппокамп 92
3.3.3 Дорсолатеральный стриатум 93
3.4 Нейродегенеративные процессы в нервной ткани сенсомоторнои коры, дорсального гиппокампа и стриатума 96
3.4.1 Сенсомоторная кора 96
3.4.2 Дорсальный гиппокамп 99
3.4.3 Дорсолатеральный стриатум 101
3.5 Иммуногистохимическое исследование экспрессии апоптоз-ассоциированных белков в нервной ткани 103
3.5.1 Сенсомоторная кора 104
3.5.2 Дорсальный гиппокамп 106
3.5.3 Дорсолатеральный стриатум 108
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 112
Заключение 136
Выводы 138
Список цитируемой литературы 141
- Особенности структурно-функционального созревания различных отделов конечного мозга в онтогенезе крыс
- Нейродегенерация и типы клеточной гибели
- Светооптический метод Ниссля
- Иммуногистохимическое исследование белка шипикового аппарата синаптоподина
Введение к работе
головного мозга млекопитающих происходят в период эмбриогенеза, и
воздействие внешних факторов в определённые периоды пренатального
развития может приводить к нарушению структурнофункциональной
организации мозга и, как результат, вызывать изменение поведенческих
реакций в дальнейшем онтогенезе [Dobbing, 1968; Nyakas et al., 1996; Berger-
Sweeney, Hohman, 1997; Кассиль и др., 2000; Журавин, 2002; Отеллин и др.,
2002; Хожай и др., 2002]. Действительно, у животных, перенесших
пренатальное воздействие, выявлено отставание в физиологическом развитии
и формировании двигательных реакций, снижение способности к обучению
[Nyakas et al., 1996; Дубровская и др.,2002]. Наиболее вероятной причиной
таких сдвигов в поведении животных может являться изменение
морфофункциональной организации центральной нервной системы,
вызываемое нарушением процессов пролиферации и миграции нейробластов
тех отделов мозга, которые закладываются во время действия
патологического фактора [Rakic, 1982; Журавин и др., 2003, 2005].
Выяснение этих механизмов необходимо для понимания принципов развития
нервной системы и может иметь важное прикладное значение для
диагностики нарушений пренатального развития мозга, лечения заболеваний
у человека, связанных с нейродегенеративными процессами и гибелью
нервных клеток [Пальчик, Шабалов, 2001]. Деструктивные воздействия в
период эмбриогенеза также повышают риск когнитивных нарушений в
постнатальный период [Журавин и др., 2003; Nalivaeva et al., 2004], вплоть до
развития опасных заболеваний, например, болезни Альцгеймера у человека.
Одним из основополагающих свойств нервной системы,
обеспечивающих адекватный поведенческий ответ организма на
изменяющиеся условия среды, является её пластичность. Она имеет прямое
отношение к обучению и запоминанию у животных. Синаптическая пластичность считается важным условием адаптивных изменений мозга, а также компенсации нарушения функционирования нейронных сетей при нейродегенеративных процессах, вызванных наследственными нарушениями, либо патологическими воздействиями [Segal, 2005]. В настоящее время представление о ведущей роли нейродегенеративных процессов в изменении двигательной активности, когнитивных функций и памяти сменяется концепцией преобладающего значения нарушений формирования нейронных сетей и межклеточных контактов, а также изменения пластичности нервной ткани в качестве причины этих функциональных нарушений. Таким образом, исследование механизмов пластичности мозга является приоритетным в нейробиологии [Arendt, 2003; Попов и др., 2003]. Однако комплексные исследования формирования отделов головного мозга в онтогенезе при нормальном и изменённом онтогенетическом развитии, в которых анализировались изменения клеточного состава, нарушения формирования нейронных сетей, а также изменения пластичности нервной ткани, проводились редко, и проблема патогенеза развития головного мозга остаётся недостаточно изученной.
Известно, что при патогенезе развития в наибольшей степени страдают отделы конечного мозга, вносящие наиболее существенный вклад в осуществление когнитивных функций. В связи с этим, в настоящей работе приводятся результаты исследования нарушения эмбрионального развития (модель пренатальной гипоксии) новой коры и стриатума, которым принадлежит ведущая роль в осуществлении организации движения и реализации процесса обучения [Толкунов, 1978; Goldman-Rakic, Selemon, 1990; Shapovalova, 1993], а также гиппокампа, являющегося структурной основой способности к запоминанию [Broadbent et al., 2004; Moses et al., 2005].
Цели и задачи исследования:
Цель настоящей работы состояла в изучении особенностей
морфофункционального формирования кортикальных отделов конечного
мозга (сенсомоторная кора, гиппокамп), в сравнении с развитием стриатума,
на разных этапах постнатального онтогенеза крыс после нормального и
нарушенного эмбрионального развития.
Для достижения поставленной цели предполагалось решить следующие
задачи:
изучить двигательную активность и пространственную память взрослых животных, перенесших пренатальную гипоксию, с целью выявления отставленных во времени нарушений поведения;
оценить функциональное состояние нервной ткани (в частности, её пластичности) путём сравнительного анализа плотности расположения синаптоподин-позитивных дендритных шипиков в постнатальном онтогенезе контрольных животных и крыс, перенесших пренатальное гипоксическое воздействие, при помощи иммуногистохимического выявления белка шипикового аппарата синаптоподина;
провести исследование количественных характеристик клеточного состава и структуры нервной ткани сенсомоторной коры, гиппокампа и дорсолатерального стриатума в постнатальном онтогенезе крыс, перенесших пренатальное гипоксическое воздействие в сравнении с контрольными животными;
изучить нейродегенеративные процессы в нервной ткани сенсомоторной коры, гиппокампа и стриатума в постнатальном онтогенезе крыс, перенесших пренатальное гипоксическое воздействие;
выполнить иммуногистохимическое исследование экспрессии апоптоз-ассоциированных белков Р53 и каспазы-3 в нервной ткани сенсомоторной
коры, гиппокампа и стриатума в постнатальном онтогенезе крыс, перенесших гипоксическое воздействие, в сравнении с контрольными животными, с целью определения механизма гибели клеток. Положения выносимые на защиту:
Количественные и нейродегенеративные изменения в разных отделах конечного мозга животных, перенесших пренатальную гипоксию в определённый момент развития, различны. Проявления последствий деструктивного воздействия максимальны в случае совпадения времени воздействия с критическим периодом развития отдела головного мозга, в частности, с периодом интенсивной пролиферации и миграции нейробластов.
Снижение количества и процент гибели клеток относящихся к разным клеточным популяциям у животных, перенесших пренатальное воздействие, неодинаковы.
Основным механизмом гибели нейронов в исследуемых отделах конечного мозга животных, перенесших пренатальную гипоксию, является механизм каспаз-зависимого апоптоза.
Причины отсроченной гибели и нейродегенерации нейронов в постнатальном онтогенезе животных, перенесших пренатальное воздействие, связаны с нарушениями формирования нейронных сетей и клеточной организации нервной ткани в эмбриогенезе и раннем постнатальном онтогенезе, а не с гибелью клеток в результате гипоксии-реоксигенации.
Нейродегенеративные процессы в постнатальном онтогенезе крыс, перенесших пренатальное воздействие, сопровождаются снижением плотности расположения синаптоподин-позитивных дендритных шипиков в нейропиле исследуемых отделов конечного мозга, что может указывать на изменение пластичности нервной ткани. Эти процессы могут являться
причиной нарушения памяти у взрослых животных, перенесших пренатальное воздействие.
Научная новизна: Исследование показало, что воздействие, совпадающее во времени с периодом интенсивной пролиферации и миграции клеточного материала формирующегося отдела мозга, вызывает наиболее выраженные изменения состава и структуры нервной ткани в постнатальном онтогенезе.
Впервые было проведено иммуногистохимическое исследование экспрессии актин-ассоциированного белка шипикового аппарата синаптоподина в нервной ткани животных, перенесших пренатальную гипоксию. Это исследование позволило описать изменения плотности расположения синаптоподин-позитивных шипиков в нейропиле исследованных отделов мозга в раннем онтогенезе крыс при нормальном и нарушенном формировании нервной ткани в эмбриогенезе. Снижение количества синаптоподин-позитивных шипиков в сенсомоторной коре и гиппокампе взрослых животных, перенесших гипоксию, сопровождалось нарушением пространственной памяти.
Автором были впервые привлечены специальные математические методы (кластерный анализ, анализ по методу К-средних) с целью создания размерной классификации клеток нервной ткани, окрашенной по Нисслю. Это первое применение данного метода для создания классификации клеток нервной ткани.
Используя комплексный методический подход к изучаемой проблеме (светооптический, гистохимический, морфометрический анализ), автор подробно описывает динамику изменений клеточного состава и плотности расположения клеток разных типов в исследуемых отделах конечного мозга в ходе постнатального онтогенеза. На данной модели пренатального нарушения развития головного мозга были впервые показаны полиморфизм,
различная степень выраженности и гетерохронность наблюдаемых изменений, охватывающих разные клеточные популяции в изучаемых отделах конечного мозга, а также их зависимость от срока проведения гипоксического воздействия.
Было обнаружено, что изменения плотности расположения клеток нервной ткани животных, перенесших пренатальное гипоксическое воздействие, не всегда совпадают с периодами усиления нейродегенеративных процессов. Возможно, это указывает на основную роль нарушения миграции и дифференцировки нейробластов в сокращении нейронной популяции в нервной ткани таких животных в раннем постнатальном онтогенезе.
Теоретическая и практическая значимость: Полученные данные о количественных различиях состава и структуры нервной ткани отделов конечного мозга контрольных и экспериментальных животных имеют существенное значение для понимания механизмов формирования нервной ткани отделов конечного мозга, как в ходе нормального онтогенеза, так и при нарушении эмбрионального развития.
Результаты исследования вносят определённый вклад в представление о том, что изменение цитоархитектоники и клеточного состава нервной ткани у животных, перенесших пренатальное воздействие, сопровождается изменением синаптической пластичности.
Полученные данные дополняют наши знания о возможных механизмах нарушения памяти и способности к обучению у животных после пренатального воздействия.
Материалы диссертации могут быть использованы в курсах лекций по онтогенетической нейроморфологии и нейрофизиологии. Кроме того, полученные данные могут быть использованы при разработке методов
диагностики нарушений пренатального развития головного мозга и лечения пренатальной патологии.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методик, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения и основных выводов. Работа изложена на 157 страницах текста, включает 49 рисунков, 5 таблиц и 253 литературных источника.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции ИВТН-2004 ("Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных и прикладных научных задач", Москва, 2004); XIX Конгрессе Физиологического общества им. И.П.Павлова (Екатеринбург, 2004); конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2004, 2005, 2006); Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и Медицина», (С.-Петербург, 2005); IX Санкт-Петербургской Ассамблее молодых учёных и специалистов (С.-Петербург, 2005); на конференции «Нейрохимия: Фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), Четвертой Российской конференции «Гипоксия: Механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005); на I съезде физиологов СНГ, (Сочи, Дагомыс, 2005); на Международном симпозиуме, посвященном 80-летию организации Института физиологии им. И.М. Павлова РАН «Механизмы адаптивного поведения», (С.-Петербург, Колтуши, 2005); на XIII международном совещании по эволюционной физиологии, (С.-Петербург, 2006); V Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения - 2006» (С.-Петербург, 2006); 11-th meeting of Czech and Slovak Neurochemical Society «Molecular basis of neurological and psychiatric disorders», (Martin, Slovak Republic, 2006); Second FENS/IBRO International summer school "Development and Plasticity of the
Human Cerebral Cortex", (Zadar, Zagreb, Croatia, 2005); а также на заседании Отдела эволюции центральной нервной системы ИЭФБ РАН.
Работы поддержаны грантами: РФФИ 02-04-49385; 06-04-48414; программами Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине" и СПбНЦ РАН; а также Персональным грантом для молодых учёных и специалистов Северо-Запада (М04-2.6К-217).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ: 3 статьи, 15 тезисов докладов на российских и международных конференциях.
Особенности структурно-функционального созревания различных отделов конечного мозга в онтогенезе крыс
По сравнению с приматами, мозг крысы при рождении менее зрелый и его развитие в раннем постнатальном онтогенезе происходит очень быстро. По общему уровню зрелости нервной ткани, мозг 10 суточного крысёнка соответствует уровню новорождённого человека, таким образом, время рождения крысы соответствует концу второй трети эмбриогенеза человека [Nyakas et al.., 1996].
Формирование нервной ткани, происходящее в период эмбрионального развития у наземных позвоночных, имеет общие особенности, можно выделить несколько этапов. Нейрогенез сопровождается интенсивной пролиферацией камбиальных элементов и миграцией нейробластов. Глиогенез - образование глиальных клеток происходит несколько позднее, но частично перекрывает во времени нейрогенез. Дифференцировка нейронов, сопровождается установлением межнейронных контактов (синаптогенез) и формированием нейронных сетей, в большинстве отделов головного мозга млекопитающих период созревания нервной ткани захватывает ранний постнатальный онтогенез.
В данной работе под типом клеток понимаются клетки, имеющие сходные структурно-функциональные признаки и характеризующиеся закономерными цитогенетическими трансформациями в процессе дифференцировки из единого тканевого зачатка. Под размерным классом (просто классом) клеток понимается группа клеток обладающих сходными визуально наблюдаемыми признаками (например, сходным размером).
Полипотентные клетки развивающейся нервной ткани, в зависимости от их проспективных потенций принято подразделять на клетки-предшественницы 1-го порядка (вентрикулярные клетки); 2-го порядка (субвентрикулярные и экстравентрикулярные) и 3-го порядка (глиобласты).
Для клеток-предшественниц одного порядка характерно одинаковое происхождение, общие признаки и единые проспективные потенции.
Вентрикулярные (нейроэпителиальные) клетки составляют первичную стенку нервной трубки и мозговых пузырей, а потому считаются источником всех типов клеток будущего головного мозга. Исследования этих клеток подтвердили их высокую митотическую активность и полипотентность [Stemple, Anderson, 1992]. Вентрикулярные клетки активно пролиферируют, образуя значительную часть нейронных популяций развивающегося мозга, клетки всех типов, в частности длинноаксонные нейроны [Резников, 1981]. Образование нейронов, как правило, предшествует образованию глиальных клеток [Temple, 2001]. Пролиферативная активность и численность вентрикулярных клеток снижается в процессе эмбриогенеза, поскольку происходит удлинение митотического цикла. Затухание пролиферативной активности и исчезновение вентрикулярных клеток происходит гетерохронно в разных отделах мозга [Резников, 1981]. Предполагается, что существование вентрикулярных клеток ограничивается периодом эмбриогенеза, даже у незрелорождающих млекопитающих вентрикулярные клетки исчезают к моменту рождения [Оленев, 1978; Morshead et al.., 1992].
Субвентрикулярные (субэпендимальные) клетки участвуют в образовании популяций нейронов и глиальных клеток в эмбриогенезе, на поздних стадиях роль этих клеток возрастает. Они считаются основным источником образования новых клеточных популяций в ходе постнатального онтогенеза, в том числе у взрослых животных [Blakemore, 1969; Levison, Goldman, 1993; Alvarez-Buylla et al.., 2002; Furuta et al.., 2005]. Субвентрикулярные камбиальные элементы развиваются гетерохронно и степень их развития в разных отделах мозга различна. Они наиболее развиты в местах интенсивной пролиферации, компенсируя недостаточность пролиферативной активности вентрикулярных клеток [Резников, 1981,
Doetsch et al.., 1997]. Снижения пролиферативной активности в онтогенезе не наблюдается, размер пролиферативного пула также меняется мало. При этом может происходить истощение отдельных зон субвентрикулярных камбиальных элементов в разных отделах мозга [Altaian, Das, 1966, 1967; Morshead et al.., 1992; Sturrock, Smart, 1980].
Экстраеентрикулярные (удалённые от желудочка) камбиальные элементы отмечены в некоторых отделах мозга, например в гиппокампе, и в мозжечке. Сходства в морфологии и характере пролиферативной активности, а также единство происхождения даёт основание рассматривать субвентрикулярные и экстраеентрикулярные клетки как единую систему камбиальных элементов, сохраняющую активность в постнатальном онтогенезе [Резников, 1981]. Ранее считалось, что у млекопитающих субэпиндемальная зона конечного мозга в эмбриональный период способна давать и нейробласты и глиобласты, в постнатальном онтогенезе она продуцирует только глиальные элементы [Резников, 1981]. Однако было показано, что в постнатальном онтогенезе, в том числе и у взрослых животных, субвентрикулярные и экстравентрикулярные камбиальные элементы способны продуцировать как глиальные клетки, так и нейробласты [Levison, Goldman, 1993]. У грызунов особенно интенсивно такой постнатальный нейроногенез происходит в ростральной части субэпендимальной зоны в районе обонятельных луковиц [Temple, 2001; Doetsch et al.., 1996, 1997, 1999]. Механизмы активации пролиферативной активности и дифференцировки будущих нейробластов в настоящее время находятся на стадии активного изучения [Temple, 2001; Kempermann et al.., 1998; Furuta et al.., 2005; Doetsch et al.., 1997, 1999].
Нейродегенерация и типы клеточной гибели
Прежде чем приступить к описанию морфофункциональных изменений и гибели клеток нервной ткани следует определить ряд базовых понятий.
Под нормой в данной работе понимается наиболее часто встречаемый вариант состояния признака, либо наиболее обычные особенности протекания онтогенетического развития. Термин норма должен относиться не к организму, а к состоянию того или иного признака, поскольку совпадение нормального состояния всех признаков в пределах одного организма практически никогда не реализуется. Менее часто встречаемые варианты строения и развития (отклонение от нормального состояния), независимо от их влияния на жизнеспособность и выполнение тех или иных функций организма, обозначаются как аномальное состояние признака. Причиной появления аномального состава и строения нервной ткани может являться нарушение её формирования в онтогенезе. В литературе часто употребляется термин патогенез и патология в значении отклонения от нормального состояния снижающее жизнеспособность организма [Жаботинский, 1965], что в данной работе понимается как синоним аномального состояния. В настоящей работе под термином дегенерация понимается комплекс наблюдаемых изменений морфофункциональных характеристик клетки, в ответ на патологическое (повреждающее, нарушающее нормальное протекание развития) воздействие. Дегенеративные изменения могут быть как обратимы, так и необратимы, некоторые из них имеют адаптивный, другие дезадаптивный характер [Жаботинский, 1965]. Дегенерацию не следует путать с гибелью клеток, поскольку гибель клетки не всегда сопровождается визуально наблюдаемыми морфологическими изменениями [Graeber et al., 2002]. В настоящее время терминология, связанная с гибелью клетки и её морфофункциональными изменениями не вполне определена и находится на стадии разработки, потому в настоящей работе используются рекомендации Номенклатурного Комитета Гибели Клетки [Kroemer et al., 2005]
Процесс гибели клеток в развивающемся мозге изучен недостаточно. Известно, что в некоторых герминативных зонах, например в субэпендимальных зонах конечного мозга или субгранулярной зоне гиппокампа происходит гибель клеток, сопровождающаяся пикнозом ядер [Резников, 1981], напоминающая гибель нейронов в результате неблагоприятных воздействий. Механизм гибели пролиферируещих клеток остаётся невыясненным, предполагается, что основным типом гибели является апоптоз [Оленев, 1978]. В ходе исследования формирования гиппокампа у крыс и мышей было показано, что существует корреляция между интенсивностью пролиферации камбиальных клеток и гибелью клеток в герминативной зоне [Резников, 1981]. Элиминацию значительной части дифференцирующихся нейронов объясняют недостаточностью установленных синаптических контактов с будущими мишенями [Оленев, 1978]. Было показано, что гибель клеток в период эмбриогенеза играет важную роль в формировании размера и формы отделов головного мозга [Haydaretal., 1999].
Процессы дегенерации и гибели нервных клеток являются предметом длительного и плодотворного изучения, на сегодняшний день накоплен и систематезирован значительный фактический материал касательно механизмов и различных проявлений большого многообразия процессов патологического изменения и гибели нервных клеток.
В своей книге Жаботинский [Жаботинский, 1965] отмечает характерные изменения нервных клеток, связанные, например, с гипоксическим воздействием. В основу классификации положен комплекс изменений нервной клетки, наблюдающиеся при помощи классических методов окраски, например окраски по методу Ниссля. Жаботинский выделил и описал множество типов дегенеративных изменений таких как: аксональная реакция, сморщивание клеток, отечные изменения, ишемические изменения нервных клеток, гомогенизирующее изменение, острое набухание, «тяжелые» изменения нервных клеток, патологическое отложение липидных веществ, атрофия нервных клеток и кальцинация нервных клеток.
При светооптическом методе наблюдения патологических изменений клеток одним из важных показателей состояния клетки является распределение глыбок Нисслевского вещества. Жаботинский [1965] описывает гиперхроматизм, проявляющийся в виде чрезмерно интенсивной окраски, и хроматолиз - исчезновение Нисслевских глыбок и более светлое окрашивание основными анилиновыми красителями. В зависимости от локализации неокрашенных областей хроматолиз может быть центральный, периферический и тотальный. Различные формы хроматолиза отмечаются при всех типах поражений нервных клеток. Гистохимические исследования показали, что хроматолиз связан с прижизненным перераспределением рибонуклеопротеидов в цитоплазме клетки, например вследствие усиления, или снижения синтеза белков. Сам по себе хроматолиз, даже сильно выраженный, не свидетельствует о необратимости и тяжести процесса.
Светооптический метод Ниссля
Морфологические и поведенческие исследования проводили на потомстве, полученном в результате скрещивания лабораторных крыс линии Вистар, разводимых в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова. Момент оплодотворения контролировали по вагинальным мазкам. Оплодотворенных самок содержали в клетках вивария по 4-5 особей. На 13-14-й и на 18-19 дни беременности часть беременных самок (38 животных) подвергали воздействию гипоксии в специальной камере (рис.5) емкостью 100 л, оборудованной системами терморегуляции, вентиляции, газового анализа и адсорбции выдыхаемого СОг. В ходе вытеснения части объёма воздуха в камере азотом, содержание кислорода в ней снижалось с 20,7% до 7,0% и поддерживалось на этом уровне в течение трех часов. Концентрация углекислого газа не превышала 0.1 % , температура была постоянна и поддерживалась на уровне 21-22 С. Животных контрольной группы (18 самок) держали в камере при тех же условиях, но при нормальной концентрации 02. В камеру одновременно сажали не более 10 животных. На 20-й день беременности (за 1 сутки до родов) самок рассаживали по отдельным клеткам в специальной комнате с нормальным освещением и температурой 20-25 С. Для исследования оставляли по 8-Ю крысят из каждого выводка.
Извлечение мозга у контрольных (36 крыс) крыс, и крыс, перенесших гипоксию на Е13.5 (43 крысы) и на Е18.5 (30 крыс) производили на 5, 10, 20, 30, 60 и 90-е сутки постнатального развития, (табл.2). В течение месяца мозг, находящийся в мозговой коробке, фиксировали методом погружения в раствор 10%-го нейтрального формалина на ОДМ фосфатном буфере (рН 7,4), затем мозг извлекали из мозговой коробки и дофиксировали в том же растворе еще один месяц при комнатной температуре.
Перед изготовлением срезов мозг выдерживали неделю в 10%-м растворе сахарозы на ОДМ фосфатном буфере. Фронтальные срезы толщиной 30 мкм изготавливали на санном замораживающем микротоме МС-2 с термоохлаждающим столиком. Срезы окрашивали по модифицированному методу Ниссля по следующей схеме: -» регидратация в 96%, а затем в 70% этиловом спирте -» промывка в дистиллированной воде - погружение в 0,02% водный раствор толуидинового синего (или тионина) на 4-6 минут, при комнатной температуре- промывка в дистиллированной воде - обезвоживание в 70%, а затем в 96% этиловом спирте -» погружение в о-ксилол - заключение препарата в канадском бальзаме
Являясь основным красителем, толуидиновый синий неспецифически окрашивает рибонуклеопротеиды в цитоплазме клетки, практически не окрашивая её отростков. Важно отметить, что данный краситель окрашивает все клетки, а потому позволяет исследовать количественные изменения общего числа клеток. Кроме того, данный метод окрашивания позволяет наблюдать изменение тургора, лизис и перераспределение цитоплазматических органоидов.
Иммуногистохимическое исследование экспрессии проапоптотических белков Р53 и каспазы-3, и белка шипикового аппарата синаптоподин проводилось на 651 срезе от 31 контрольного животного, 672 срезах от 32 крыс, перенесших гипоксию на Е13.5 и 651 срезе от 31 крысы после гипоксии наЕ18.5.
Были использованы два независимых метода визуализации распределения апоптоз-ассоциированных белков: авидин-биотин-пероксидазный метод на парафиновых срезах и иммуно-флюоресцентный, с использованием вторичных антител конъюгированных с флюорохромом на замороженных срезах, анализируемых с помощью конфокальной микроскопии. Оба этих метода дали сходные результаты. Количественное сравнение нервной ткани контрольных и экспериментальных животных проводилось на материале, полученном с использованием иммунофлюоресцентного метода.
Фиксация материала для исследования авидин-биотин-пероксидазным методом производилась путём погружения в 4% раствор параформальдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 6) в течение 20 часов при температуре +4С.
Иммуногистохимическое исследование белка шипикового аппарата синаптоподина
Взрослые крысы, перенесшие пренатальную гипоксию, имели такой же вес (на Е13.5 245,4±3,4г, на Е18.5 - 248,2±9,4г), что и контрольные животные (242,5±6,3г).
Локомоторная активность в открытом поле у крыс, перенесших гипоксию на Е13.5 (27,6±4,2) и Е18.5 (29,5±2,8) не отличалась (р 0,05) от активности контрольных животных (28,2±4,6), что свидетельствует об отсутствии влияния пренатальной гипоксии на двигательную активность взрослых животных.
Исследование поведения животных в двухуровневом восьмилучевом лабиринте. Исследование проводилось на взрослых крысах. Тестировалось три группы животных: 1. контрольные; 2. крысы, перенесшие гипоксию на Е13.5 и 3. крысы подвергнутые гипоксии на Е18.5. Обучение животных из разных групп, выполнению задания занимало в среднем около 3 дней. Результаты исследования даны на рисунке 9. Было показано, что количество ошибочных побежек у крыс, перенесших гипоксию на Е13.5 (18,5±1,19%), как и в случае гипоксии на Е18.5 (18,1±1,27%) было выше (р 0,001) чем у контрольных животных (11,8±1,17%). Статистически значимого различия между группами крыс, перенесших гипоксию на разные сроки эмбриогенеза, обнаружено не было (рис. 9). Таким образом, количество ошибок у взрослых крыс, перенесших пренатальную гипоксию выше, чем у контрольных животных. Принимая во внимание отсутствие различий в двигательной активности взрослых животных в открытом поле, можно предположить, что различие между взрослыми контрольными и экспериментальными крысами, выявленное при помощи теста в восьмилучевом лабиринте свидетельствует о нарушении пространственной памяти. Причиной подобных нарушений может являться изменение морфофункциональной организации нервной ткани головного мозга, прежде всего таких его отделов, как кора больших полушарий и гиппокамп.
С целью подтверждения этого предположения было проведено сравнительное исследование плотности расположения синаптоподин-позитивных дендритных шипиков в нервной ткани неокортекса и аммонова рога контрольных и экспериментальных животных.
Иммунофлюоресцентный метод позволил визуализировать отдельные синаптоподин-позитивные дендритные шипики в виде диффузно расположенных точек в межклеточном пространстве, диаметром около 1 мкм, отличающихся по яркости от фона более чем в 5 раз. Неспецифического окрашивания внутриклеточных структур, отличного по яркости от фонового, в нервной ткани исследуемых отделов конечного мозга обнаружено не было.
Иммуногистохимическое исследование актин-ассоциированного белка шипикового аппарата синаптоподина позволило оценить среднюю плотность расположения синаптоподин-позитивных шипиков в неиропиле различных слоев сенсомоторной коры у контрольных и экспериментальных животных (рис.10; 11).
Плотность расположения синаптоподин-позитивных шипиков в неиропиле всех слоев сенсомоторной коры у контрольных животных повышалась в ходе раннего постнатального онтогенеза, начиная с 10-х суток, что соответствует общей тенденции, описанной в литературе [Оленев, 1978, 1995]. Наиболее быстрое увеличение числа таких шипиков наблюдалось в течение первого месяца постнатального онтогенеза, на более позднем этапе темпы увеличения числа шипиков замедлялись(рис.11).
Распределение синаптоподин-позитивных шипиков по слоям сенсомоторной коры было неравномерно. Наибольшая плотность расположения шипиков, как у контрольных, так и у экспериментальных животных, отмечалась в I (молекулярном) слое. В белом веществе, подстилающем клеточные слои такие шипики отсутствовали.
Гипоксия на Е13.5
Начиная с 20-х суток постнатального онтогенеза, у животных, перенесших гипоксию на Е13.5, было обнаружено статистически значимое снижение средней плотности расположения синаптоподин-позитивных шипиков в I (молекулярном) слое сенсомоторной коры в сравнении с контролем (рис.11). Различие это сохранялось на 30-е и 90-е сутки, достигая максимального значения уже на 30-е сутки.
Статистически значимых различий в плотности расположения синаптоподин-позитивных шипиков в других слоях сенсомоторной коры выявить не удалось.
Гипоксия на Е18.5
Статистически значимого отличия по плотности расположения синаптоподин-позитивных шипиков в молекулярном (I) слое сенсомоторной коры между контрольными животными и крысами, перенесшими гипоксию на Е18.5 обнаружено не было (рис.11).
Таким образом, в постнатальном онтогенезе у крыс, перенесших гипоксию только на Е13.5 наблюдалось снижение плотности расположения синаптоподин-позитивных дендритных шипиков в I слое сенсомоторной коры в сравнении с контролем.
Похожие диссертации на Формирование конечного мозга крыс после нарушения эмбрионального развития, вызванного пренатальной гипоксией
