Введение к работе
Актуальность исследования
Дизрегуляция динамического равновесия между процессами жизни и смерти на уровне клетки является причиной возникновения различных заболеваний. Гибель нервных клеток на ранних этапах индивидуального развития играет важную роль в процессах структурно-функционального созревания мозга. Вместе с тем большинство постмитотических нейронов по окончании периода созревания существуют на протяжении всей жизни организма. Аберрантная гибель нейронов является основной причиной нейродегенеративных болезней. Увеличение доли людей, страдающих этими заболеваниями, делает изучение причин и механизмов развития нейродегенеративных процессов одной из ведущих задач, стоящих перед биологией. Несмотря на значительный, накопленный к настоящему времени, фактический материал, сегодня отсутствует ясное понимание механизмов, лежащих в основе этих заболеваний.
Исследование механизмов развития церебральных патологий невозможно без использования адекватных моделей, которые позволяют воспроизводить клиническую картину заболеваний человека. Успехи молекулярной генетики позволили выявить связь ряда нейродегенеративных болезней с мутациями в определенных генах (Иллариошкин, 2003; Шадрина, Сломинский, 2006; Григоренко, Рогаев, 2007; Thomas et al., 1995; Carrel, Lomas, 1997; Selkoe, 2001). Данные о связи мутаций в генах, кодирующих некоторые белки, с развитием патологии позволили создать модели нейродегенеративных заболеваний на животных с получением линий трансгенных мышей и крыс. В то же время большинство случаев таких заболеваний являются спорадическими, т.е. такими, при которых манифестация болезни и ее развитие не являются строго детерминированными нарушениями функции генов. Это обусловливает необходимость создания новых моделей, которые позволяли бы изучать механизмы нейродегенерации, не связанные с изменениями генома. В качестве подхода к моделированию нейродегенеративных нарушений может быть предложено использование токсических агентов, принимающих участие в патогенезе
заболевания. Для болезни Альцгеймера (БА ) таким веществом может быть Р-амилоидный пептид (АР).
Ар является продуктом протеолитического расщепления крупного трансмембранного белка предшественника Ар (АРР). В обычных условиях Ар может выполнять функции регуляторного пептида, который воздействует на процессы возбуждающей нейротрансмиссии (Kamenetz et al., 2003), синаптической (Walsh et al., 2002) и структурной (Morgan, 2007) нейропластичности. В то же время Ар наиболее известен как один из основных участников патогенеза Б A (Hardy, Allsop, 1991; Hardy, Selkoe, 2002; Hardy, 2009). Ар представляет собой пептид массой 4 кДа, состоящий из 40-42 аминокислот. После расщепления АРР Р- и у-секретазами Ар секретируется в ликвор (Seubert et al., 1992). БА характеризуется накоплением в мозге нерастворимых бляшек, основным белковым компонентом которых и является АР(1-42) (Glenner, Wong, 1984). В настоящее время установлено, что АР(1-42), находящийся в составе бляшек, может подвергаться модификации (например, рацемизации), в результате чего он становится растворим и доступен действию различных протеаз (Kaneko et al., 2001; Kubo et al., 2002). Итогом такого протеолиза является образование укороченных фрагментов Ар, среди которых важное место занимает ундекапептид АР(25-35). Исследование физиологических и патологических аспектов биологической активности этого пептида является актуальным, поскольку это может открыть новые перспективы для понимания механизмов патогенеза БА и поиска путей патогенетически направленной коррекции этого заболевания.
Патологические процессы при нейродегенеративных заболеваниях протекают в разных структурах мозга и сопровождаются дисфункцией и дегенерацией специфических популяций нейронов, таких как холинергические нейроны при БА или дофаминергические нейроны при болезни Паркинсона. Активные исследования в этой области обнаружили комплексные патологические изменения в клетках, включая
1 Список сокращений: АФК - активные формы кислорода; БА - болезнь Альцгеймера; ГАМК - у-аминомасляная кислота; КК - каиновая кислота; НАДФНд - НАДФН диафораза; СВЗ - субвентрикулярная зона; СГЗ - субгранулярная зона; СПА - супероксидперехватывающая активность; ТБКРП - продукты, реагирующие с 2-тиобарбитуровой кислотой; УР - условный рефлекс; УРПИ - условная реакция пассивного избегания; ХАТ - холинацетилтрансфераза; А(3 - (3-амилоидный пептид; ANOVA - дисперсионный анализ; АРР - белок предшественник амилоида; BrdU - 5-бромо-2-дезоксиуридин; Dcx - доблкортин; IL-4 - интерлейкин-4; ISI - промежуточное ядро перегородки; LSD - латрально-дорзальное ядро перегородки; MS - медиальное ядро перегородки; iNOS - индуцибельная синтаза окисда азота; nNOS - нейрональная синтаза окисда азота; PTZ -пентилентетразол; TNFa - фактор некроза опухолей-a; TUNEL - опосредованное терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой присоединение дезоксиуридин трифосфата к З'-ОН концу.
нарушения биохимических процессов, регуляции генов, ответов на внешние стимулы и т.д. Несмотря на различия в клинической картине нейродегенеративных болезней, избирательной гибели отдельных популяций нейронов, можно предположить, что на клеточном и молекулярном уровнях механизмы нейродегенерации, лежащие в основе этих болезней, являются сходными и затрагивают в первую очередь процессы нейропластичности (Угрюмов, 2010; Mesulam, 1999; 2000; Arendt, 2001). Известно, что при нейродегенеративных процессах различной природы наблюдаются признаки окислительного стресса, т.е. нарушения баланса между биохимическими механизмами образования и элиминации активных форм кислорода (АФК). Вместе с тем остается неясным, является ли окислительный стресс последствием дегенеративного процесса, вызванного другими факторами, или это одно из наиболее ранних проявлений патологии, которое вносит определенный вклад в этиологию болезни (Moreira et al., 2008; Sultana et al., 2009).
При изучении механизмов нейродегенерации важной является проблема взаимодействия процессов хронического окислительного стресса и нейровоспаления (Salminen et al., 2009). Нейровоспаление характеризуется активацией микроглии, которая выполняет роль резидентных макрофагов в мозге. Активированные микроглиоциты высвобождают наряду с супероксидным анион-радикалом оксид азота (NO). Накопление в ткани свободного NO и супероксида приводит к образованию высокореактивного соединения - пероксинитрита, который вместе с АФК вступает в реакции окисления и нитрования (нитрозативный стресс). Оксиданты вызывают экспрессию генов провоспалительных цитокинов в микроглии, создавая тем самым порочный круг.
Окислительный стресс и воспалительный каскад приводят к снижению когнитивных функций и репаративных возможностей нервной ткани. Существенный вклад в оба эти процесса вносит нейрогенез, включающий пролиферацию и дифференцировку новых нейронов в зрелом мозге (Gage, 2002; Gould, 2007). Известно, что в мозге взрослых млекопитающих нейрогенез происходит в двух основных областях - субвентрикулярной зоне боковых желудочков и субгранулярной зоне зубчатой извилины. Предполагается, что образовавшиеся вновь нейроны способны мигрировать из этих областей в регионы повреждения, что может представлять значительный интерес с точки зрения использования способности мозга
к самовосстановлению для терапии неиродегенеративных заболеваний. Принимая во внимание эти факты, были сформулированы цель и задачи исследования.
Цель работы
Учитывая актуальность изучения физиологических эффектов Ар, целью представленной работы явилось исследование влияния АР(25-35) и других соединений, вызывающих нейродегенерацию, на поведение животных и механизмы, связанные с развитием изменений поведения, с применением комплекса нейрофизиологических, нейрохимических, и гистологических методов.
Задачи работы
Исходя из указанной цели работы, были поставлены следующие конкретные задачи:
изучить влияние АР(25-35) на процессы обучения и памяти у крыс при его интрацеребровентрикулярном введении;
оценить показатели свободнорадикального окисления в отделах мозга крыс при моделировании нейродегенерации, вызванной интрацеребровентрикулярным введением АР(25-35), нейротоксина AF64A и системным введением каиновой кислоты или пентилентетразола;
исследовать влияние АР(25-35) на процессы пролиферации и дифференцировки клеток в мозге взрослых животных;
- провести сравнительный анализ провоспалительной и антивоспалительной
модуляции неиродегенеративных изменений, вызванных интрагиппокампальным
введением АР(25-35).
Научная новизна
В работе впервые проведено систематическое исследование эффектов АР(25-35) на обучение и память у крыс, установлены временные параметры возникновения изменений поведения. Показано, что наиболее чувствительными к действию АР(25-35) являются зависимые от гиппокампа формы пространственной памяти, а память, сформировавшаяся в результате выработки оборонительных форм поведения, является более устойчивой.
Впервые показано, что в условиях in vivo токсическое воздействие АР(25-35) на структурные элементы ЦНС опосредовано окислительным стрессом. Интенсивность и характер развития окислительного стресса различаются в
исследованных отделах мозга. Наиболее сильно выражены процессы окислительного стресса в гиппокампе и неокортексе. Показано, что важная роль в повреждении нейронов при нейродегенерации принадлежит N0, синтезируемому нейронной изоформой NO-синтазы.
В работе показано, что окислительный стресс является основным звеном патогенеза нейродегенерации, вызванной не только АР(25-35), но и другими нейротоксинами, такими как AF64A, каиновая кислота, или хемоконвульсант пентилентетразол.
Выявлено влияние АР(25-35) на процессы нейрогенеза в пролиферативных отделах мозга взрослых животных. Установлено, что АР(25-35) может ингибировать процессы пролиферации в гиппокампе и замедлять дифференцировку новообразованных клеток по нейронному фенотипу.
Впервые в экспериментах in vivo установлена возможность модуляции нейротоксических эффектов АР(25-35) провоспалительным и антивоспалительным цитокинами. При этом установлено, что провоспалительный цитокин усиливает токсическое воздействие АР(25-35), а антивоспалительный - снижает повреждающий эффект этого пептида.
Теоретическое и научно-практическое значение работы
В результате проведенной работы предложена новая «инъекционная» модель амнезии Альцгеймеровского типа на крысах. Проведенный в работе экспериментальный анализ нарушений поведения животных после введения АР(25-35), а также нейродегенеративных изменений в мозге позволяет использовать предложенную модель в качестве модели ранних этапов БА.
В работе установлено, что окислительный стресс является центральным звеном патогенеза хронических нейродегенеративных процессов различной природы, что может служить теоретическим обоснованием разработки новых подходов к антиоксидантной терапии заболеваний подобного рода.
Новые данные о модуляции нейротоксичности АР(25-35) провоспалительными и антивоспалительными цитокинами открывают новые возможности для разработки противовоспалительной терапии при БА.
Основные положения, выносимые на защиту
1. При моделировании нейродегенерации с использованием различных
нейротоксических веществ Р-амилоидный пептид, холинотоксин AF64A, каиновая
кислота и пентилентетразол индуцируют окислительный стресс, временная
динамика и выраженность показателей которого специфичны для каждого вида
воздействия и отдела мозга.
2. Введение Р-амилоидного пептида вызывает нарушения мнестических функций,
которые на начальных этапах развития экспериментальной патологии сопровождаются нарушением нейрогенеза, а на более поздних этапах -нейродегенеративными изменениями в мозге.
3. Гибель нервных клеток, вызванная введением Р-амилоидного пептида,
сопровождается усилением воспалительных процессов, проявляющихся в виде активации нейроглии и усиления генерации свободных радикалов, в том числе оксида азота. Развитие нейродегенерации зависит от баланса про- и антивоспалительных цитокинов, при этом антивоспалительные цитокины уменьшают степень нейро дегенеративных изменений в мозге. Апробация работы
Основные результаты работы доложены на съезде федерации Европейских физиологических обществ (Маастрихт, 1995), 1-м региональном конгрессе FAONS (Патайя, 1996), 1-м Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996), XXXIII Международном конгрессе физиологических обществ (Санкт-Петербург, 1997), конференциях Американского общества по нейронаукам (Вашингтон, 1996, Новый Орлеан, 1997), 12-м съезде Европейского нейрохимического общества (Санкт-Петербург, 1998), Европейском форуме по нейронаукам (Берлин, 1998), Международной конференции, посвященной 150-летию И.П. Павлова «Новое в концепциях о механизмах ассоциативного обучения и памяти» (Москва, 1999), Международной школе по биокибернетике «Память и эмоции» (Неаполь, 1999), конференции «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 1999), XXX Всероссийском Совещании по проблемам высшей нервной деятельности (Санкт-Петербург, 2000), 14, 15, 17, 18 Съездах Европейского нейрохимического общества «Достижения в изучении молекулярных механизмов неврологических заболеваний» (Перуджа, 2001, Варшава, 2003; Саламанка, 2007; Лейпциг, 2009), XVIII-XX Съездах Физиологического
общества им. И.П. Павлова при РАН (Казань, 2001; Екатеринбург, 2004; Москва, 2007), I Съезде РНО «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), 20 Съезде Международного нейрохимического общества (Инсбрук, 2005), 5-7 Европейских Форумах по нейронаукам (Вена, 2006; Женева, 2008; Амстердам, 2010), Международных симпозиумах «Гиппокамп и память» (Пущино, 2006, 2009) и апробированы на межлабораторной конференции ИВНДиНФ РАН (Москва, 2010).
Публикации
По теме диссертации опубликованы 33 статьи, из них 8 в международных изданиях.
Структура и объем диссертации
