Влияние глипролинов на стрессогенные нарушения поведения крыс Эдеева Саглар Евгеньевна

Содержание к диссертации

Введение

Литературный обзор:

I. Стресс и поддержание гомеостаза 10

1.1. Стресс-система 11

1.2. Стресс-лимитирующие системы 26

1.3. Стрессорные патологии 28

II. Глипролины 39

Материалы и методы 53

I. Экспериментальные модели стрессорного воздействия 53

II. Методы оценки поведения животных 54

III. Исследование кинетики поступления меченного тритием PGP ([3H]PGP) в органы и ткани крыс 57

IV. Исследование биодеградации [3H]PGP методом высоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 58

V. Использованные препараты 59

VI. Статистическая обработка данных 60

Результаты и обсуждение 61

I. Кинетика поступления меченного тритием PGP ([ H]PGP) в органы и ткани крыс при разных способах введения 61

II. Исследовавние биодеградации ([ H]PGP) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 63

III. Влияние глипролинов на поведение крыс 68

III. 1. Влияние глипролинов на поведение интактных животных 68

III.2. Влияние глипролинов на постстрессорные нарушения поведения... 69

III.2.1. Исследование возможных протекторных (профилактических) противострессорных эффектов шлипролинов 71

III.2.1.1. Протекторные противострессорные эффекты пептидов при внутрибрюшинном введении. Стресс - неизбегаемое плавание 71

Исследование протекторных противострессорных эффектов аминокислот глицина и пролина 76

Протекторные противострессорные эффекты глипролинов при их интраназалъном введении 83

Дозозависимость протекторных противострессорных эффектов глипролинов 88

Временная динамика протекторных противострессорных эффектов глипролинов 92

III.2.1.2. Протекторные противострессорные эффекты пептидов на модели эмоционального стресса - введения ХЦК-4 96

III.2.1.3.Влияние глипролинов на устойчивость животных к острой гипобарической гипоксии и протекция ими постгипоксических нарушений поведения 103

III.2.2. Исследование возможных лечебных (терапевтических) противо-стрессорныхэффектов глипролинов 109

III.2.2.1. Лечебные противострессорные эффекты глипролинов. Стресс - неизбегаемое плавание 109

Временная динамика лечебных противострессорных эффектов глипролинов 113

III.2.2.2. Лечебные противострессорные эффекты глипролинов на модели эмоционального стресса - введения ХЦК-4 119

Заключение 129

Выводы 132

Список литературы 133

• Стрессорные патологии
• Методы оценки поведения животных
• Кинетика поступления меченного тритием PGP ([ H]PGP) в органы и ткани крыс при разных способах введения
• Протекторные противострессорные эффекты пептидов при внутрибрюшинном введении. Стресс - неизбегаемое плавание

Введение к работе

Актуальность проблемы.

Несмотря на многочисленность исследований, посвященных проблемам стресса и вызванных им патологий, в мире наблюдается перманентно растущий уровень заболеваний, напрямую или косвенно опосредуемых стрессом.

Стрессорное воздействие является угрозой гомеостазу организма и адаптация к изменениям окружающей среды позволяет достигнуть преимущества в выживании. При этом для успешной адаптации необходима не только способность реагировать на стрессогенное воздействие, но и способность правильно регулировать выраженность стрессорного ответа.

Адекватность стрессорного ответа обеспечивается балансом в работе стресс-активирующих и стресс-лимитирующих систем организма.

Нарушения адекватной реакции на стрессогенные условия могут служить причиной целого ряда функциональных расстройств центральной нервной системы (ЦНС) и, соответственно, поведенческой активности, связанных с повышенной тревожностью и развитием фобических и депрессивных состояний. Постстрессорные изменения в работе ЦНС, в свою очередь, сопровождаются нарушением работы центральных регуляторных механизмов, приводя к развитию целого ряда патологий на периферическом уровне: гипертонии, язве желудка, ишемической болезни сердца и ряда других.

В связи с этим изучение реакции организма на стрессогенные воздействия и поиск возможных путей коррекции постстрессорных нарушений являются актуальной задачей современной физиологии.

Для предупреждения и лечения постстрессорных повреждений в организме могут использоваться два подхода:

1. Применение препаратов периферического действия, направленное на нормализацию работы конкретных органов, пострадавших в результате неадекватной стресс-реакции;

2. Использование препаратов центрального действия, способных предупредить или восстановить постстрессорные нарушения в работе ЦНС.

Второй подход кажется нам наиболее перспективным, так как направлен на нормализацию регуляторных механизмов и устранению тем самым основной причины развития патологических нарушений в работе вегетативных систем.

В настоящее время имеется широкий набор психотропных препаратов антидепрессантного, анксиолитического действия. Однако ни один не является универсальным. Кроме того, большинство из них представляют собой экзогенные (чужеродные для организма) соединения, их применение сопровождается рядом отрицательных побочных эффектов. Поэтому, до сих пор остается актуальным поиск новых препаратов, способных снизить или устранить постстрессорные нарушения функций ЦНС.

В последнее время ведется активное исследование семейства коротких пролинсодержащих олигопептидов - глипролинов (ГП), которые представляют собой фрагменты коллагена, состоящие из аминокислот глицина и пролина. К числу наиболее изученных представителей этого семейства относятся пептиды PGP, GP и PG.

Наше внимание эти пептиды привлекли в связи с тем, что среди широкого спектра присущих им физиологических эффектов отмечается способность предотвращать или ослаблять ряд постстрессорных повреждений в организме. Так предварительное введение ГП предотвращает или существенно ослабляет стрессогенное язвообразование (Жуйкова и др., 2003; Жуйкова и др., 2004; Бадмаева и др., 2004), нарушения микроциркуляции в брыжейке (Копылова и др., 2003; Копылова и др., 2006) и постстрессорную активацию тучных клеток (Умарова и др., 2003; Смирнова и др., 2003). Отчасти эти эффекты могут быть обусловлены прямым действием ГП на периферические структуры, в результате чего повышается их устойчивость к действию стрессогенных факторов. На это указывает наличие у ГП прямого сосудорасширительного действия (Бакаева и др., 2003), способности снижать

7 реактивность тучных клеток на действие синактена (фрагмент АКТГ]_24),

наличие у них антикоагулянтных, фибринолитических (Пасторова и др.,

1998; Ляпина и др., 2006) и противовоспалительных свойств (Умарова и др.,

2006; Жуйкова и др., 2003; Труфанова и др., в печати).

С другой стороны, уменьшение постстрессорных нарушений может быть связано с действием ГП на структуры ЦНС, участвующие в формировании стресс-реакции.

В литературе практически нет сведений о влиянии ГП на структуры ЦНС. Попытки выявить влияние ГП на поведение интактных животных дали отрицательный результат (Левицкая и др., 2000; Козловская и др., 2002).

Однако, отсутствие влияния на поведение интактных животных, не исключает возможности влияния этих пептидов на структуры ЦНС, участвующие в формировании стресс-реакции.

Очень мало известно и о формакокинетике глипролинов при разных способах введения и их способности преодолевать гемато-энцефалический барьер (ГЭБ). Тем не менее, в работе Васьковского и соавт. было показано, что при использовании меченого тритием пептида PGP радиоактивная метка обнаруживалась в структурах мозга через 15 мин, 3 часа и даже через 5 часов после внутрибрюшинного введения (Васьковский и др., 2003). Это еще в большей степени повышает вероятность того, что протекторные эффекты ГП в отношении постстрессорных повреждений могут быть связаны с их прямым действием на структуры ЦНС и коррекцией интенсивности стресс-реакции.

Непосредственным результатом интегративной деятельности ЦНС является характер поведенческой активности животного, а его изменения под влиянием фармакологических агентов могут служить показателем способности данных агентов влиять на функции ЦНС.

Целью данной работы было изучение влияние пептида PGP и его метаболитов на постстрессорные нарушения поведения крыс.

8 В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать фармакокинетику PGP при разных способах введения и его способность преодолевать ГЭБ.

2. Изучить влияние PGP и его метаболитов на постстрессорные нарушения поведения с использованием различных моделей стрессирования животных (неизбегаемое плавание, фармакологическая модель эмоционального стресса - введение ХЦК-4, острая гипобарическая гипоксия).

а) выяснить наличие протекторного (профилактического) эффекта при
введении пептидов до действия стрессора;

б) выяснить наличие терапевтического (лечебного) эффекта при введении
пептидов после действия стрессора, на фоне уже развившихся нарушений
поведения.

3. Определить длительность профилактического и терапевтического эффектов пептидов.

4. Сопоставить эффективность действия PGP и его метаболитов.

5. Выяснить влияние PGP на устойчивость животных к острой гипобариче-ской гипоксии.

Научная новизна работы.

Изучена фармакокинетика меченого тритием PGP при внутривенном, внутрибрюшинном и интраназальном способах введения.

Показана способность PGP и/или его метаболитов преодолевать ГЭБ и попадать в ткани головного мозга.

Впервые обнаружена возможность предотвращения (протекторный, профилактический эффект) постстрессорных нарушений поведения при действии ГП, а также возможность коррекции (устранения или ослабления) уже сформировавшихся постстрессорных нарушений - терапевтический, лечебный эффект. Сопоставлена эффективность действия PGP и его метаболитов (GP, PG, аминокислот глицина и пролина). Определена минимальная эффективная доза и изучена дозозависимость этих эффектов. Впервые

9 показано, что пептид PGP повышает устойчивость крыс к острой гипобари-

чекой гипоксии за счет ускорения восстановительных процессов.

Научное и практическое значение исследования.

Полученные данные расширяют представления о регуляторной роли ГП в организме, демонстрируя возможность их влияния на структуры ЦНС, участвующие в формировании стресс-ответа. Результаты данного исследования и сделанные на их основании обобщения и выводы могут служить основой для планирования дальнейших исследований этой проблемы. Они могут быть использованы также при чтении спецкурсов по соответствующим разделам физиологии.

Обнаруженные в работе центральные протекторные (профилактические) и лечебные (терапевтические) эффекты ГП делают перспективным их дальнейшее изучение в плане разработки и создания новых лекарственных средств для предотвращения и устранения негативных последствий стресса.

Апробация диссертации - материалы исследования обсуждались на: I Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 17-19 ноября 2003); III конференции с международным участием, посвященной 175-летию В. Овсянникова (Россия. Санкт-Петербург, 29 сентября-1 октября 2003); конференции молодых ученых "Ломоносов-2004" (Москва, 2004); конференции молодых ученых "Ломоносов-2005" (Москва, 2005); II Internati-nal conference "Neuro-humoral and Cellular Regulatory Mechanisms of Digestion Proccesses" (Kyiv, Ukraine, 5-7 октября 2005); II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санк-Петербург, 25-27 мая 2005), III Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Пущино, 17-21 сентября 2007).

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Стресс и поддержание гомеостаза

Стресс - это явление, присущее всему живому без исключения. Стресс неотделим от жизни. Это объясняется тем, что жизнь - сложное динамическое равновесие организма с окружающей средой. При этом непременным условием сохранения жизни является поддержание постоянства внутренней среды, или гомеостаза (Меерсон, Пшенникова, 1988; Пшенникова и др., 2000; Black, 2002; Greenberg et. al., 2002). Гомеостаз - это поддержание физиологических, биохимических, биоэлектрических и других параметров организма на относительно постоянном уровне, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность организма. Поэтому стресс можно рассматривать как состояние нарушенного гомеостаза в результате действия различных факторов -стрессоров.

Стрессоры могут быть как внешние, или экзогенные (физические - жара, холод, травма и психические - опасность, конфликт, сильные эмоции), так и внутренние или эндогенные, формирующиеся в организме (боль, очаг воспаления). У человека и животных с высокоразвитой нервной системой психо-эмоциональные факторы служат не только частыми стрессорами, но и опосредуют действие большинства физических стрессоров.

При любом воздействии различных экстремальных факторов в организме возникают однотипные биохимические изменения, направленные на преодоление действия этих факторов путем адаптации (аллостазиса) организма к предъявленным требованиям (O'Connor et. al., 2000; Pacak, Palkovits, 2001). Выраженность этих изменений зависит от интенсивности предъявляемых требований и от функционального состояния организма. Таким образом, стресс - процесс необходимый, а представление о "вредности" стресса обусловлено теми патологическими состояниями, которые возникают при сильных и/или длительных воздействиях стрессора,

приводящих к повреждению, или при нарушениях в работе систем, ответственных за осуществление стресс-реакции и формирование адаптации.

1.1. Стресс-система

При формировании адаптивной реакции стрессор через высшие регуля-торные центры активирует стресс-систему, которая объединяет определенные отделы нервной и эндокринной систем и "неспецифически" активируется в ответ на действие любого стрессора. Кроме этого, стрессорное воздействие активирует функциональную систему, объединяющую органы и ткани, "специфически" ответственные за приспособления к конкретному стрессору (холоду, гипоксии и др.).

Стресс-система находится в постоянной тонической активности, но если физический или эмоциональный стрессоры превышают допустимый критический порог, происходит повышение ее активности.

Стресс-система состоит из центрального звена и двух периферических ветвей, которые осуществляют связь центрального звена со всем организмом. К центральному звену относится гипоталамус и ряд структур ствола мозга. Гипоталамус ответственен за нервную регуляцию эндокринных функций и "запускает" работу стресс-системы.

Центральное звено стресс-системы объединяет следующие основные группы нейронов: ^ нейроны паравентрикулярного ядра гипоталамуса (КРГ-нейроны),

которые вырабатывают кортикотропин-рилизинг-гормон (КРГ). КРГ

стимулирует секрецию АКТГ в гипофизе и активирует гипоталамо-

гипофизарно-адреналовую систему - ось; / нейроны паравентрикулярного ядра гипоталамуса, вырабатывающие

гормон аргинин-вазопрессин - АВ-нейроны;

12
S нейроны, синтезирующие катехоламины, главным образом

норадреналин, в стволе мозга, гипоталамусе и других отделах; ключевую роль играет центр норадренергических нейронов - "синее пятно".

Кортикотропин-рилизинг гормон (КРГ) - "ключевой медиатор стресса" - вовлечен в регуляцию как физиологических, так и поведенческих ответов организма на любое воздействие (Engler et. al., 1999; Esposito et. al., 2002; Stout et. al., 2002; Hauger et. al., 2003; Nishikawa et. al., 2004; Garlow et. al., 2005; Majzoub, 2006; Smith, Vale, 2006). В последние годы возрос интерес к этому нейропептиду в связи с его участием в патогенезе различных тревожных расстройств и депрессии (Stout et. al., 2002; Claes, 2004; Garlow et. al., 2005; Gillespie, Nemeroff, 2005). В мозге животных система КРГ-связанных пептидов представлена 4 пептидами: собственно КРГ и урокорти-нами 1, 2 и 3 (Wang et. al., 2002; Pelleymounter et. al., 2004; Heinrichs, Koob, 2004; Jamieson et. al., 2006). КРГ-содержащие нейроны обнаружены во многих отделах мозга и, прежде всего в тех, которые вовлечены в формирование ответной реакции организма на действие стрессора: в паравентрику-лярном и вентромедиальном ядрах гипоталамуса, миндалине, ядрах шва, стволе мозга, коре головного мозга и др. (Holmes A. et. al., 2003; Hori et. al., 2004; Henri et. al., 2006). Введение экзогенного фрагмента КРГ в мозг крыс приводит к повышению тревожности и дезрегуляции работы гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы (Pelleymounter et. al., 2002; Van Gaalen et. al., 2002).

Выделяют два подтипа рецепторов пептидов данного семейства, связанных с G-белками: КРГ(1) и КРЦ2) (Kishimoto et. al., 1995; Bale et. al., 2002; Aguilera et. al., 2004; Chen et. al., 2005). КРГ(1) рецепторы - наиболее многочисленные - обнаружены в аденогипофизе, мозжечке, неокортексе, "синем пятне", таламусе и полосатом теле; КРГ(2) - в периферической сосудистой сети и сердце, а на уровне ЦНС - в подкорковых структурах

13 мозга (перегородке, миндалине, гиппокампе и др.) (Chalmers et. al.,

1995; Rominger et. al., 1998; Van Pett et. al., 2000; Higelin et. al., 2001).

Оба подтипа рецепторов играют важную роль в регуляции стрессорно-го поведения. Однако каким образом данные рецепторы модулируют поведенческий и эндокринный ответы на стресс, до сих пор остается неясным (Pelleymounter et. al., 2002). Показано, что у линии мышей, нокаут-ных по гену КРГ(1) типа рецепторов была значительно снижена ответная реакция на стрессорное воздействие (иммобилизационный стресс): не происходило значимого повышения тревожности (Smith et. al., 1998; Contarino et. al., 2000). У таких животных нарушена активация гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы, приводящая в итоге к снижению секреции АКТГ (Contarino et. al., 2000; Bale et. al., 2002). Антагонисты КРГ(1) типа рецепторов могут быть использованы в качестве анксиолитиков, устраняя вызванные стрессом проявления тревоги и паники (Deak et. al., 1999; Okuyama et. al., 1999; Arborelius et. al., 2000; Griebel et. al., 2002).

В отличие от данной линии мышей, мыши нокаутные по гену КРГ(2) типа рецепторов демонстрируют повышенную тревожность и гиперреакцию на стрессогенное воздействие. У таких животных ответная стресс-реакция развивается не только быстрее, но и с большей амплитудой (Bale et. al., 2000; Coste et. al., 2000; Kishimoto et. al., 2000; Pelleymounter et. al., 2002).

В работе Pelleymounter (2002) было выдвинуто предположение о том, что секретируемый при стрессе КРГ через КРГ(1) подтип рецепторов опосредует физиологические эффекты стресса через активацию гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы, тогда как КРГ(2) подтип рецепторов регулирует только поведенческую составляющую стресс-ответа.

При нормальном состоянии поддерживается баланс между КРГ-пептидами и плотностью КРГ-рецепторов. Стресс приводит к гиперсекреции КРГ и последовательному уменьшению рецепторов в аденогипофизе.

Аналогичная картина наблюдается и при хроническом введении корти-костерона, который дозозависимо уменьшает количество рецепторов КРГ в аденогипофизе. Напротив, повреждение парвентрикулярного ядра гипоталамуса, приводит к сокращению секреции КРГ нейронами гипоталамуса и увеличивает плотность рецепторов КРГ в гипофизе (Habib, 2001).

Аргинин-вазопрессин синтезируется в нейронах супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса. Его основные эффекты на периферии - регуляция водного метаболизма и сосудистого тонуса (Смирнов, 2006; Verbalis, 2007) и поддержание гомеостаза глюкозы (Aoyagi et. al., 2007).

Стресс стимулирует выделение данного пептида из соответствующих нейронов гипоталамуса, аксоны которых направляются в заднюю долю гипофиза ("нейрогипофиз") и образуют синаптоподобные контакты с кровеносными сосудами. Аргинин-вазопрессин, синтезированный в телах нейронов, аксонным транспортом переносится к окончаниям аксонов и накапливается в пресинаптических везикулах, секретируется в кровь при возбуждении нейрона, запуская активацию гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы (Aguilera, 2000; Volpi et. al., 2004b; Wigger et. al., 2004). Перемещение нейропептида по аксону осуществляется с помощью специфического белка-переносчика - нейрофизина.

Вне гипоталамуса, значительное количество нейронов, содержащих аргинин-вазопрессин, находится в миндалине и гиппокампе (Aguilera, Rabadan-Diehl, 2000; Holmes et. al., 2003). В этих отделах мозга аргинин-вазопрессин опосредует свои эффекты через Уїьтип рецепторов (Birnbaumer, 2000; Volpi et. al., 2004a). Вазоконстрикция и гликогенолиз регулируются через Via, а водный обмен через V2 типы рецепторов (Смирнов, 2006).

Обнаружена повышенная экспрессия рецепторов аргинин-вазопрессина и его секреция у животных и людей с признаками депрессии (Zhou et. al.,

15 2001; Wigger et. al., 2004); у мышей, нокаутных по гену рецептора Vib

снижено агрессивное поведение (Wersinger et. al., 2002).

Полученные данные свидетельствуют о том, что нарушение функции

гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы при депрессии и тревожных

состояниях может быть связана с увеличением продукции аргинин-

вазопрессина, и его антагонисты могут быть эффективны в отношении

данных заболеваний (Griebel et. al., 2002; Serradeil-Le Gal et. al., 2002; Winter

et. al., 2003; Wigger et. al., 2004).

Таким образом, аргинин-вазопрессин и КРГ действуют синергично в

отношении секреции АКТГ, однако, аргинин-вазопрессин секретируется в

меньших количествах, чем КРГ. Данные нейропептиды взаимодействуют на

уровне гипоталамуса и стимулируют секрецию друг друга (O'Connor et. al.,

2000; Habib M. et. al., 2001; Lolait et. al., 2007).

Периферические ветви стресс-системы представлены двумя основными отделами: 1) гипоталамо-гипофизарно-адреналовой осью, конечным продуктом активации которой являются гормоны глюкокортикоиды, выделяющиеся из коры надпочечников под влиянием АКТГ; 2) симпато-адреналовой системой, в которую входит симпатическая нервная система и мозговой слой надпочечников; конечными продуктами активации этой системы являются катехоламины норадреналин и адреналин (Chrousos, Gold, 1992; Harbuz, Lightman, 1992; Chrousos, 1998; O'Connor et. al., 2000; Sapolsky et. al., 2000; Pacak, Palkovits, 2001).

Выход на периферию стресс-система имеет также и через парасимпатическую нервную систему, однако ее роль в осуществлении стресс-реакции изучена недостаточно. Так, электрическая стимуляция афферентных окончаний блуждающего нерва приводила к увеличению уровня АКТГ и кортикостерона в плазме крови и увеличение экспрессии мРНК КРГ в гипоталамусе, что свидетельствует о возможности участия блуждающего

нерва в регуляции активности гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси и стресс-системы в целом (Hosoi et. al., 2000).

Симпато-адреналовая система включается сразу после начала действия стрессора и вызывает мобилизацию различных систем организма. О включении симпатической системы в развитие стресс-ответа свидетельствуют следующие реакции: расширение зрачка, учащение дыхания и пульса, перераспределение кровотока, усиление мышечной активности, ослабление моторики желудка и кишечника и др.

Гипоталамо-гипофизарно-адреналовая - ключевая система регуляции стресс-ответа - включается несколько позже и может действовать на протяжении многих часов и даже суток. Она оказывает влияние на все без исключения органы и ткани, включая головной мозг (Erkut et. al., 1998; De Kloet, 2004; Cerqueira et. al. 2005).

Конечными продуктами активации стресс-системы являются гормоны надпочечников - глюкокортикоиды и катехоламины.

Глюкокортикоиды играют ключевую роль в управлении активности гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси и в завершении ответа на стресс (Lim et. al., 2002; Raison, Miller, 2003; Chrousos et. al., 2004; De Kloet, 2004; Schmidt et. al., 2005). Ингибирующая обратная связь глюкокортикоидов на секрецию АКТГ действует таким образом, чтобы ограничить постстрессор-ные нарушения (Erkut et. al., 1998; Ziegler, Herman, 2002). В организме действует двойная система рецепции к глюкокортикоидам, относящаяся к суперсемейству ядерных рецепторов. Тип (I) рецепторы - высокоаффинные минералокортикоидные - реагируют на низкие физиологические флуктуации уровня глюкокортикоидов, тогда как тип II рецепторы отвечают на высокие стрессовые уровни (Habib, 2001; Raison, Miller, 2003; Wang et. al., 2005). Сродство глюкокортикоидов к рецепторам типа І в 10 раз выше, чем к рецепторам типа II (O'Connor et. al., 2000). В ЦНС минералокортикоидные

рецепторы обнаруживаются преимущественно в нейронах лимбической системы, преимущественно в гиппокампе, тогда как глюкокортикоидные рецепторы более широко представлены в структурах мозга, причем не только в нейронах, но и глиальных клетках (Berger et. al., 2006).

Глюкокортикоиды обладают разносторонним действием на организм и являются одними из важнейших регуляторов гомеостаза (Ziegler, Herman, 2002). Рецепторы к глюкокортикоидам присутствуют практически во всех тканях (Green et. al., 1997; O'Connor et. al., 2000). Глюкокортикоиды регулируют секрецию цитокинов (интерлейкинов, простагландинов, ростовых факторов и др.): уменьшают продукцию 11-1,11-2,11-6 и INF-y (Bethin et. al., 2000; Black, 2002). Под воздействием кортикостероидов в организме происходит усиление обменных процессов (Sapolsky et. al., 2000), изменение концентрации медиаторов (норадреналина, серотонина, вазопрессина, ГАМК) в различных отделах мозга (Kvetnansky et. al., 1993; Komesaroff, Funder, 1994; Rabadan-Diehl et. al., 1997; Orchinik et. al., 2001; Di et. al., 2005), подавление иммунных реакций (Stark et. al., 2001). Вместе с тем эффекты глюкокортикоидов на иммунную систему неоднозначны (Galon et. al., 2002; Franchimont, 2004; Zhang, Daynes, 2007). Проявление иммуностимулирующего или иммуносупрессивного эффекта зависит от концентрации глюкокорти-коидного гормона в крови: в сравнительно низких концентрациях глюкокортикоиды оказывают скорее иммуностимулирующее действие, тогда как в более высоких концентрациях они обладают противоположным эффектом (Chrousos, 1999; Elenkov et. al., 2000; Sternberg, 2001; Perez et. al., 2005; Stolte et. al., 2006; Liberman et. al., 2007). Кроме иммуномодулирующего действия, глюкокортикоиды способны регулировать процессы воспаления (Sapolsky et. al., 2000; Boers, 2004; Walsh, 2005; Barnes, 2006) и аллергической реакции (Yamaguchi et. al., 2001; Hiragun et. al., 2005). Они тормозят активность различных разрушающих ткани ферментов - протеаз и нуклеаз, матриксных

18 металлопротеиназ, гиалуронидазы и других медиаторов воспаления

(Marchetty et. al., 2002; Flaster et. al., 2007), а также тормозят экссудацию в

очаге воспаления (Meduri et. al., 2002).

Противоаллергическое действие глюкокортикоидов обеспечивается за счет снижения продукции IgE, повышения гистаминсвязывающей способности крови, стабилизации мембран тучных клеток и др. (Yamaguchi et. al., 2001; Andrade et. al., 2004).

Глюкокортикоиды могут модулировать иммунные и воспалительные ответы различными путями: через генную экспрессию, процессы транскрипции, трансляции, белковой секреции и др. Так, ингибирование секреции цитокинов происходит через изменение стабильности мРНК и уровня генной экспрессии. Этот эффект может быть прямым или опосредованным. Действуя напрямую, глюкокортикоиды понижают транскрипцию генов 11-6,11-1 и 11-0, приводя к уменьшению их продукции иммунными клетками. Опосредованный иммунносупрессивный эффект глюкокортикоидов может осуществляться за счет ингибирования транскрипции провоспалительных факторов, таких как ядерный фактор-кВ, который активирует экспрессию генов многих цитокинов, энзимов и других провоспалительных агентов (O'Connor et. al., 2000).

Глюкокортикоиды, действуя на генетическом уровне, активизируют глюконеогенез и трансаминирование, а тем самым преобразование аминокислот в глюкозу - для обеспечения клеток энергией (Меерсон, Пшенникова, 1988; Wang et. al., 2000; Watts et. al., 2005). Кроме того, глюкокортикоиды повышают уровень глюкозы в крови через подавление активности инсулина (Nielsen et. al., 2004; Almon et. al., 2005; McMaster, Ray, 2007), тормозят захват и утилизацию глюкозы клетками периферических тканей (Opherk et. al., 2004), угнетают активность ключевых ферментов гликолиза (Probst et. al., 2003), повышают синтез гликогена в печени и скелетных мышцах (Ruzzin,

19 Jensen, 2005), усиливают катаболизм белков и уменьшают их синтез

(Sapolsky et. al., 2000; Marik, Zaloga, 2002; Pickering et. al., 2003).

Глюкокортикоидные гормоны оказывают определённое

минералокортикоидное действие - способствуют задержке катиона натрия, аниона хлора и воды, усилению выведения катионов калия и кальция (Marissal-Arvi, Mormede, 2004).

Избыточный уровень глюкокортикоидов в крови повышает риск развития висцерально-абдоминального ожирения (Livingstone et. al., 2000; Kershaw et. al., 2005) и метаболического синдрома, включающего в себя такие основные симптомы как гиперинсулинемия, нарушение толерантности к глюкозе, гипертриглицеридемия и артериальная гипертензия (Friedman et. al., 1996; Morton et. al., 2005).

Катехоламины (норадреналин, адреналин, дофамин) синтезируются в мозговом веществе надпочечников, в симпатической нервной системе и в мозге.

Основными источниками норадреналина в мозге является "синее пятно", гипоталамус и структуры лимбической системы (Дубынин и др., 2003; De Wardener, 2001). В малых дозах в ЦНС катехоламины обладают нейропро-текторным эффектом, действуя как антиоксиданты, тогда как в высоких дозах они нейротоксичны (Noh et. al., 1999; Ishige et. al., 2001).

Норадреналин отличается от адреналина гораздо более сильным сосудосуживающим и прессорным действием, значительно меньшим стимулирующим влиянием на сокращения сердца, слабым действием на гладкую мускулатуру бронхов и кишечника и на обмен веществ (отсутствием выраженного гипергликемического, липолитического и общего катаболиче-ского эффекта). Норадреналин является основным нейромедиатором в адренергических системах ЦНС, в отличие от адреналина, который практически не играет роли в передаче нервных импульсов в адренергических

20 системах и выполняет в большей степени роль гормонального

(гуморального) регулятора, чем нейромедиатора.

Под влиянием адреналина происходит повышение содержания глюкозы в крови и усиление тканевого обмена. Адреналин усиливает глюконеогенез, тормозит синтез гликогена в печени и скелетных мышцах, усиливает захват и утилизацию глюкозы тканями, повышая активность гликолитических ферментов (Kjaer et. al., 2000; Watt et. al., 2001). Также адреналин усиливает липолиз (распад жиров) и тормозит их синтез (Demas, Bartness, 2001). В высоких концентрациях адреналин усиливает катаболизм белков (Farias-Silva et. al., 1999; Fazaa et. al., 1999; Schommer et. al., 2003). Адреналин обладает выраженным противоаллергическим и противовоспалительным действием, тормозя высвобождение гистамина, серотонина, кининов и других медиаторов аллергии и воспаления из тучных клеток (McLean-Tooke et. al., 2003). Одним из физиологических механизмов ограничения воспалительных и аллергических реакций является повышение секреции адреналина мозговым слоем надпочечников, происходящее при многих острых инфекциях, воспалительных процессах, аллергических реакциях.

Из всех нейронов ЦНС только незначительная часть вырабатывает дофамин (биологический предшественник адреналина и норадреналина). Известно несколько дофаминовых ядер, расположенных в стволе мозга. Это аркуатное ядро, дающее свои отростки в срединное возвышение гипоталамуса, дофаминовые нейроны черной субстанции посылающие аксоны в хвостатое ядро и миндалину, а также нейроны, находящиеся в области вентральной покрышки, дающие проекцию к прилежащим ядрам. Разрушение дофаминовых нейронов в области чёрной субстанции приводит к развитию характерных для болезни Паркинсона двигательных нарушений (Ашмарин, 1999); в области лимбической системы - к постепенному снижению мотивации, способности испытывать положительные эмоции (агедония) и, в конечном счёте, к развитию хронической депрессии; в

21 области лобных долей коры - к снижению памяти, обучаемости и, в

конечном счёте, к развитию органического слабоумия - деменции. Дофамин на периферии обладает рядом физиологических свойств, характерных для адреналина и норадреналина (Guzman et. al., 2001; Debavyey, Van den Berghe, 2004). Он вызывает повышение сопротивления периферических сосудов (менее сильное, чем под влиянием норадреналина), систолического артериального давления и сердечного выброса, а также увеличение силы сердечных сокращений. Особенность влияния дофамина на сердечнососудистую систему в том, что в низких концентрациях он вызывает вазодилатацию и понижение системного кровяного давления, тогда как в высоких дозах он оказывает противоположные эффекты: вазоконстрикцию и повышение давления (Reitsamer, Kiel, 2002; Giantomasso et. al., 2004). В результате специфического связывания с дофаминовыми рецепторами почек дофамин уменьшает сопротивление почечных сосудов, увеличивает в них кровоток и почечную фильтрацию (Asif et. al., 2004). Наряду с этим повышается натрийурез. Происходит также расширение мезентериальных сосудов. Этим действием на почечные и мезентериальные сосуды дофамин отличается от других катехоламинов (норадреналина, адреналина и др.).

Катехоламины, также как и глюкокортикоиды принимают участие в регуляции продукции моноцитами/макрофагами провоспалительных веществ (Li et. al., 2003; Elenkov et. al., 2000). Так, норадреналин и адреналин тормозят секрецию TNF-a (Feldman et. al., 2000; Kavelaars et. al., 2000), 11-12 (Chrousos, 1999) и INF-y антигенпрезентирующими клетками, но увеличивают секрецию 11-6 (Liao et. al., 1995; Black, 2002), 11-10 и TGF-P (Elenkov et. al., 2000). Показано, что катехоламины ингибируют активность некоторых компонентов клеточного иммунитета, в частности натуральных киллеров; фагоцитарную активность нейтрофилов; снижают генерацию лейкоцитами супероксида и кислородных радикалов (Chrousos, 1999).

Таким образом, основным результатом активации стресс-системы является увеличенный выброс глюкокортикоидов и катехоламинов -главных стресс-гормонов, которые способствуют мобилизации функции органов и тканей, ответственных за адаптацию. Катехоламины и глюкокор-тикоиды взаимодействуют друг с другом по типу "плюс-плюс", т. е усиливают секрецию друг друга.

Основные звенья стресс-системы тесно взаимодействуют с тремя другими отделами ЦНС:

1. Мезокортикальной и мезолимбической дофаминовыми системами, которые включают префронтальную кору головного мозга и nucleus accum-bens;

2. Комплексом миндалина-гиппокамп;

3. Опиоидергическими нейронами аркуатного ядра гипоталамуса, иннерви-руемого норадреналин-содержащими волокнами, идущими от норадреналин-содержащих нейронов "синего пятна" и других норадренергических структур ствола мозга.

Эти отделы имеют особое значение при эмоциональном стрессе и связанных с ним патологических состояниях, так как они вовлечены в феномены "оборонительной реакции", страха, в изменении болевой чувствительности, развития привыкания, в том числе к наркотическим веществам, и влияют на эмоциональный тонус (Шульговский, 1997; Симонов, 1999; Wallace, 2002; Lyubashina, 2004).

Сигналы о внешних стрессорах поступают в стресс-систему от коры головного мозга, через ассоциативную кору и мезокортико-лимбическую систему. Выход сигналов из центрального звена стресс-системы направлен не только к органам через периферические ветви стресс-системы, но также и к другим отделам ЦНС.

Исследование реакции на эмоциональные стрессоры указывает как на общность физиологических изменений, возникающих при действии физиче-

23 ских и психических стрессоров, так и на важные различия в механизме

формирования этих изменений. Так, если при действии физических стрессоров стресс-реакция возникает в ответ на непосредственное влияние стресси-рующего агента, то в случае действия эмоциональных стрессоров стресс-реакция опосредуется через сложные психические процессы. Эти процессы включают оценку воздействующего фактора и сопоставление его с предыдущим опытом. Таким образом, если физический фактор, как правило, это "стрессор для всех", то психический фактор может являться стрессором для одного индивидуума и быть полностью индифферентным для другого (Соколова и др., 1996).

Следует отметить то, что эмоциональный стресс как целостное состояние организма имеет центральное происхождение и первично формируется в эмоциогенных зонах мозга. В формировании эмоциональной стресс-реакции участвуют такие структуры головного мозга как фронтальный отдел неокортекса, гиппокамп, ядра миндалины и гипоталамус (Пшенникова, 2000; Sapolsky, 2001; Wesierska et. al., 2005).

Главная функция в формировании центрального механизма эмоционального стресса принадлежит гипоталамусу, как и при формировании любого вида стресса.

Эмоциональная стресс-реакция формируется в результате поступления эндогенного (внутреннего) или экзогенного (внешнего) стрессорного сигнала. При формировании эмоций эндогенным путем гипоталамус в ответ на гуморальные и нервные стимулы, поступающие из организма, вовлекает в возбуждение надгипоталамические лимбические структуры, и затем возбуждение достигает корковых клеток и реализуется в поведенческие реакции организма. При формировании эмоциональной стресс-реакции в ответ на внешний эмоциональный (информационный) стрессор гипоталамус получает сигнал от коры мозга, так как первично в ответ на внешний стимул возбуж-

24 дение возникает в коре и далее распространяется на гипоталамус и

лимбические структуры мозга.

Существует определенная связь между норадренергическими нейронами "синего" пятна и проявлением при эмоциональном стрессе "тревоги и страха" (Пшенникова, 2000). Нейроны синего пятна с проекцией через кору головного мозга и подкорковые структуры, включая гиппокамп, миндалину, таламус и гипоталамус, образуют нейроанатомическую структуру, которая ответственна за поведенческие и вегетативные компоненты эмоциональной стресс-реакции (Bremner, 2006).

Среди патологических факторов, вызывающих стрессорные повреждения, можно выделить несколько основных, в числе которых дефицит функциональных нейроэндокринных резервов, энергетический дисбаланс с нарастанием проявлений анаэробного катаболизма, активация процессов свободнорадикального окисления и истощение потенциала эндогенной антиокислительной системы.

Молекулярно-клеточные механизмы развития стрессорных состояний включают в себя мобилизацию функций клеток вследствие внутриклеточного повышения концентрации ионов кальция (Nilius, Droogmans, 2001; Smith, Pilati, 2002), а также активации ключевых регуляторных ферментов -протеинкиназ (Kiriakis, Avruch, 2001; Fukuda et. al., 2005). При затянувшейся стрессорной реакции избыток ионов кальция оказывает повреждающее действие, которое в отношении кардиомиоцитов, проявляется в "кальциевой триаде", состоящей из необратимых контрактурных повреждений миофиб-рилл (Li et. al., 2004), нарушения функций митохондрий и активации миофибриллярных протеаз и митохондриальных фосфолипаз (Ahlbom et. al., 2000), что приводит к развитию очаговых некрозов миокарда (Saeed, 2001; Sjaastad et. al., 2003; Madamanchi et. al., 2005). Это сопровождается активацией процессов свободнорадикального окисления, и в первую очередь — перекисного окисления липидов (ПОЛ), индуцируемого любой напряженной

25 деятельностью, требующей от организма повышенного расхода

энергии (Барабой и др., 1992; Пшенникова, 2000; Maier, 2002; Kim et. al.,

2005; Aragno et. al., 2006).

Процесс перекисного окисления липидов можно рассматривать как элемент неспецифического повреждения тканей, наблюдающийся при целом ряде патологических состояний. Активация ПОЛ приводит к нарушению структурной организации липидного бислоя биологических мембран, что влечет за собой нарушение важнейших клеточных функций (Haggendal et. al., 1987; Tavazzi et. al., 2000; Takabe et. al., 2001). Так, в работе Грибанова Г.А. было показано, что в ответ на водно-иммерсионный стресс у крыс происходят значительные изменения липидного компонента в мозжечке и продолговатом мозге стрессированных крыс, свидетельствующие об активном распаде липидов (Грибанов, 1999). Развивающиеся процессы липопероксидации могут привести в итоге к гибели клетки (Shibata et. al., 2006).

В последнее время в развитии стрессорных патологий важную роль уделяют тучным клеткам (Умарова и др., 2003; Копылова и др., 2006). Участие тучных клеток как в нормальной жизнедеятельности, так и в ряде патологических процессов, опосредуется наличием в них большого количества биологически активных медиаторов, которые обеспечивают полифункциональность их действия (Умарова и др., 1993; Умарова и др., 1994). Гранулы тучных клеток содержат вазоактивные, провоспалительные и ноцицептивные медиаторы: гистамин, гепарин, различные протеазы, триптазы и другие медиаторы. Кроме того, тучные клетки в процессе активации могут синтезировать и секретировать цитокины, лейкотриены и простагландины (Wede-meyer, Galli, 2000; Theoharides, Cochrane, 2004; Theoharides, Kalogeromitros, 2006). Тучные клетки являются основными эффекторными клетками в аллергическом ответе организма (Teoharides, Kalogeromitros, 2006) и воспалении различной этиологии (Умарова и др., 2006; Theoharides, Cochrane, 2004).

26 1.2. Стресс-лимитирующие системы

При действии сильного и длительно действующего раздражителя, стрес-сорные механизмы нейрогуморальной регуляции оказываются в состоянии продолжительного и сильного возбуждения, в крови длительно поддерживается высокий уровень катехоламинов и глюкокортикоидов, а также других биологически активных веществ. В этих условиях высокий уровень катехоламинов и кортикостероидов обусловливает развитие повреждений внутренних органов, и приводит к возникновению различных нарушений, вплоть до развития патологических состояний (Bhargava et. al., 2000; Raison, Miller, 2003; Julian et. al., 2004; Gillespie, Nemeroff, 2005).

Стресс-лимитирующие системы - системы, способные ограничивать чрезмерную стресс-реакцию на центральном и периферическом уровнях (Малышев, Манухина, 1998; Пшенникова и др., 2000; Curtis et. al., 2001; Yates et. al., 2001).

К основным центральным стресс-лимитирующим системам относятся:

система ГАМК-нейронов, продуцирующих гамма-аминомасляную (ГАМК) кислоту, оказывающую тормозное влияние на нейроны спинного и головного мозга;

опиоидная система, объединяющая нейроны в гипоталамусе и секреторные клетки в гипофизе, продуцирующие опиоидные пептиды - эндорфи-ны, энкефалины и др.

Выделяющиеся при активации стресс-системы норадреналин, аргинин-вазопрессин, КРГ и др. стимулируют высвобождение ГАМК и опиоидов. Это приводит к ограничению активности стресс-системы в целом (Пшенникова, 2000; Calogero, 1995). Ингибиторное влияние ГАМК и агонистов бензодиазепиновых рецепторов на функцию КРГ-нейронов осуществляется в основном за счет угнетения высвобождения КРГ из терминалей КРГ-нейронов (см. рис 1).

27
Тормозное действие ГАМК и опиоидов на катехоламины

осуществляется не только в ЦНС, но и на периферии: рецепторы для ГАМК и

опиоидов локализованы на аксонах симпатических нейронов, иннервирую-

щих органы и ткани. Доказана совместная локализация стресс-гормонов и

опиоидов: катехоламинов и энкефалинов - в хромаффинных пузырьках

медуллы надпочечников (Keating et. al., 2004; Fulop et. al., 2005), вазопресси-

на и динорфина - в нейронах гипоталамуса (Roper et. al., 2004; Brown et. al.,

2006), глюкокортикоидов и энкефалинов в коре надпочечников, а также

наличие ГАМК-ергических нейронов в энтеральной нервной системе (Krantis

et. al., 2000).

В результате, выброс стресс-гормонов может сопровождаться выходом опиоидов, причем интенсивность этого выхода прямо пропорциональна степени активации стресс-системы. Доказано также, что в гипофизе АКТГ и опиоиды (р-эндорфины) образуются из общего предшественника (проопио-меланокортина) и выделяются при стрессе в равных количествах (Смирнов, 2006; Burbach et. al., 2001).

Действие стресс-системы на уровне органов и тканей ограничивают системы местной регуляции - локальные стресс-лимитирующие системы. Это системы простагландинов, аденозина, опиоидов и других соединений в самих органах и других периферических нейроэндокринных структурах (Малышев, Манухина, 1998). В последнее время к стресс-лимитирующим системам относят систему образования оксида азота (NO). Показано, что центральные и периферические звенья стресс-системы снабжены NO-ергической иннервацией. NO может ограничивать активацию стресс-системы за счет угнетения выброса катехоламинов из надпочечников и нервных окончаний (Addicks et. al., 1994; Schwarz et. al., 1995).

Важную роль в ограничении активации стресс-ответа и повреждений играют также относящиеся к локальным стресс-лимитирующим системам антиоксидантные системы в органах и тканях.

28 Таким образом, стресс-реакция регулируется с помощью

изменения продукции медиаторов и гормонов элементами стресс-системы и

сопряженными с ней элементами стресс-лимитирующих систем организма.

1.3. Стрессорные патологии

В основе стрессорных патологий лежит нарушение способности организма отвечать на действие стрессоров адекватной защитной реакцией. Если фактор является стрессором, то эффект его действия, т. е. выраженность стресс-реакции, будет зависеть от: интенсивности стрессора (сила и продолжительность действия), степени устойчивости организма к действию фактора и индивидуального опыта, определяющего значимость стрессора. Гипервозбуждение стресс-системы сопровождается значительным увеличением уровня КРГ и может приводить к развитию различных патологических состояний, проявляющихся со стороны ЦНС в виде депрессии, повышения тревожности, подавления пищевых, оборонительных и половых реакций. У линии крыс Fisher с исходно повышенным уровнем КРГ обнаруживалась уязвимость в отношении восприимчивости к инфекции и опухолевому росту, но наблюдалось снижение восприимчивости к воспалению и аутоиммунным заболеваниям. Снижение содержания КРГ в гипоталамусе также влечет за собой сдвиги в работе стресс-системы и приводит к развитию патологических состояний.

Так, у линии крыс Lewis, с исходно низкой активностью КРГ-нейронов наблюдаются повышенная чувствительность к воспалительным и аутоиммунным заболеваниям и нарушения поведенческого ответа (Sternberg et. al., 1992; Patchev et. al., 1992; O'Connor et. al., 2000). У человека гипоактивность гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси наблюдается при сезонных аффективных расстройствах, синдроме хронического ожирения и при никотиновой отмене у курильщиков (Joseph-Vanderpool et. al., 1991; Demi-track et. al., 1991).

Пара вентрикулярное ядро гипоталамуса КРГ, АВ

"синее пятно"/центр норад-ренергических нейронов Норадрсналин

Симпатический ганглий

Спиномозговые ганглии

неиропсптиды

Рис. 1 Основные компоненты стресс-системы (по Chrousos, 1999, с изменениями)

ПОМК - проопиомеланокортины АСТН - адренокортикотропный гормон КРГ - кортикотропин-рилизинг гормон АВ -аргинин-вазопрессин ГАМК- гамма-амино-масляная кислота

Механизмы возникновения стрессорных патологий напрямую связаны с центральными структурами стресс-системы. Важную роль в их возникновении играют изменения в центральных ядрах миндалины и гиппокампа, тесно связанных со стресс-системой (McEwen, Sapolsky, 1995). Ядра миндалины и гиппокамп - структуры лимбической системы мозга - одни из важнейших регуляторов мотивационных и эмоциональных реакций (Fanselow, Gale, 2003; Chen et. al., 2006). Электрическая и химическая стимуляция ядер миндалевидного комплекса приводит к изменениям как на периферическом: изменение кровяного давления, работы сердца, ЖКТ, эндокринной системы, так и на центральном уровне - возникновению поведенческих реакций, сходных с таковыми при эмоциональном стрессе (Goldstein et. al., 1996; Kim et. al., 2005). Показано, что выключение базолатерального ядра миндалины вызывает снижение уровня кортикостерона в крови и предупреждает его повышение при эмоциональном стрессе (Ikegaya et. al., 1996; Muller et. al., 1997). Разрушение ядер миндалины приводило и к изменениям поведенческих реакций, характерных для посттравматического стрессорного расстройства (Goldstein et. al., 1996).

Гиппокамп - главная структура мозга, ответственная за обучение и память (Wittenberg, Tsien, 2002; Kim, Diamond, 2002), тревожность (Wittington, Virag, 2006; Sarnyai et. al., 2000) и агрессию (van Riel et. al., 2002) и др. При поражении гиппокампа могут возникать различные патологии, одной из которых является синдром Корсакова - заболевание, при котором больной при сравнительной сохранности следов долговременной памяти утрачивается память на текущие события. Уменьшение объёма гиппокампа является одним из ранних диагностических признаков при болезни Альцгеймера (Гаврилова, 2001; Fukutani et. al., 2000; Kril et. al., 2002). Посттравматическое стрессовое расстройство (Bremner, 2006; Carrion et. al., 2007) и обширная депрессия (Sapolsky, 2001) также характеризуются уменьшением объема гиппокампа.

Вызванные стрессом нарушения функций ЦНС приводят к нарушению центральных механизмов поддержания гомеостаза, что, в конечном счете, может спровоцировать развитие различных соматических патологий.

При избыточной стресс-реакции могут возникать различные нарушения физиологических систем организма. Со стороны сердечно-сосудистой системы это риск развития внезапной сердечной смерти, инфаркта миокарда, гипертонии, инсульта и др. Повышение АД, ЧСС и сократительной функции сердца, "рабочая гиперемия" являются необходимым звеном адаптации к стрессору, однако при его избыточном действии растет риск развития патологий (Меерсон, 1993).

Одной из основных причин патологий внутренних органов является нарушение их адекватного кровоснабжения, связанное со стрессогенными изменениями микроциркуляции. Было показано, что стрессогенные воздействия различной природы вызывают нарушение сократительной активности лимфатических сосудов брыжейки крыс (Копылова и др., 2003; Копылова и др., 2006). Микроциркуляторное русло представляет собой разветвленную сеть кровеносных и лимфатических сосудов. В регуляции работы микроцир-куляторного русла принимают участие местные механизмы (растяжение сосудистых стенок, действие химических веществ и газов крови), так и центральные - через стимуляцию баро-, хемо- и механорецепторов (Смирнова, 2003). Адекватный уровень микроциркуляции поддерживается миоген-ными, нейрогенными и гуморальными механизмами. При активации стресс-системы в организме резко возрастает уровень стрессорных гормонов, которые оказывают влияние на сократимость и проницаемость сосудистых стенок, что сказывается в итоге на функционирование микроциркуляторного русла (Plante, 2002).

Поскольку катехоламины являются активаторами тромбоцитов, то при стрессе происходит повышение активности тромбоцитов и усиление их

32 агрегационной способности (Birk et. al., 2003; Blann et. al., 2003), что

приводит к развитию так называемой стрессовой гиперкоагулемии. Происходит ускорение процесса образования протромбиназы и тромбина, увеличивается количество фибриногена в крови, нарастает активность XII фактора плазмы, повышается агрегация тромбоцитов, одновременно снижается активность антитромбинов (Raikkonen et. al., 1996а; Montrucchio et. al., 2000; Chung, Lip, 2006). Тромбин, связываясь со своими рецепторами на тромбоцитах - PAR-I, вызывает их агрегацию. Кроме того, тромбин, связанный с тромбомодулином, блокирует фибринолиз, активируя ингибитор фибриноли-за (TAFI) (Nesheim et. al., 1997). Избыток глюкокортикоидов приводит к подавлению синтеза эндотелиальными клетками сосудов простациклина и NO и увеличению продукции тромбоксана А₂ (Jun et. al., 1999; Wallerath et. al., 1999; Rogers et. al., 2002). Простациклин - мощный вазодилататор, обладает антиагрегационной активностью и ингибирует аккумуляцию липидов в интиме сосудов (Kaplan, Manuck, 1994); тромбоксан А₂ - индуктор агрегации тромбоцитов (Black, 2002). Увеличение в крови ингибитора активации плазминогена I (PAI-I), сопровождающееся уменьшением тканевого активатора плазминогена (ТРА) может спровоцировать риск развития инфаркта миокарда и тромбозов (Black, 2002; Lowe et. al., 1998; Vrijkotte et. al., 1999; Raikkonen et. al., 1996b). Вызванное стрессом повышение активности ренин-ангиотензиновой системы также провоцирует повышение уровня PAI-I, что также, в свою очередь, повышает риск развития сердечно-сосудистых патологий (Ridker et. al., 1993).

Очевидна роль стресса и в этиологии язвенной болезни желудка, двенадцатиперстной кишки и других патологий ЖКТ. Язвы желудка, инволюция тимуса и разрастание коры надпочечников входят в "триаду" стрессорных повреждений по Селье. Степень стрессорных повреждений желудка зависит от физиологического статуса организма (устойчивости к действию стрессора), интенсивности и типа стрессорного воздействия (физический, психиче-

33 ский стрессоры) (Белкина и др., 2001; Бадмаева и др., 2004; Жуйкова и др.,

2004; Yelken et. al., 1999; Mayer, 2000).

Стрессорные язвенные повреждения СОЖ являются по своей природе ишемическими и возникают в результате вазоконстрикции в желудке, вызванной стрессорной адренергической активацией. При этом происходит торможение активности блуждающего нерва и соответственно выделение желудочного сока. Затем, когда активность блуждающего нерва восстанавливается после окончания действия стрессора и соответственно восстанавливается желудочная секреция пепсина и соляной кислоты, ишемизированные участки подвергаются "перивариванию" и изъязвляются (Пшенникова, 2000).

Процесс язвообразования в желудке при стрессе может быть тесно связан с нарушением активности центральных стресс-лимитирующих систем. Показано снижение содержания ГАМК в гипоталамусе при иммобилизаци-онном стрессе, вызывающем язвообразование, тогда как предварительное введение аналогов ГАМК его предупреждало (Krantis, 2000; Giampaolo et. al., 2007). Выявлено снижение активности нейронов гиппокапма при синдроме раздраженного кишечника (Mayer, 2000).

Стресс вызывает изменения и со стороны иммунной системы, которая совместно с нейроэндокринной системой играет важную роль в адаптации организма (Chrousos, 1999; Sternberg, 2001; Chrousos, Kino, 2005). Интенсивное стрессорное воздействие ингибирует активность иммунной системы (Herbert, Kohen, 1993; Kawamura et. al., 2001; Shao et. al., 2003). В основе иммунной депрессии лежит интенсивная секреция КРГ в гипоталамусе с последующим увеличением влияния глюкокортикоидов, симпатической системы и катехоламинов на иммунокомпетентные органы и клетки (Dhabhar, 1998; Sapolsky et. al, 2000; Sternberg, 2001). Все это приводит, в итоге, к повышению восприимчивости организма к инфекциям и может спровоцировать развитие ряда заболеваний, в том числе онкологических (Sternberg, 1997; Moraska et. al., 2002; Friedman, Lawrence, 2002). Иногда

острое стрессорное воздействие может вызвать и патологическое увеличение иммунореактивности, результатом чего является развитие стрессорных аутоиммунных состояний (Sternberg, 2001; Dhabhar, 2003; Harbuz et. al., 2006).

Выявлено значительное влияние стресса на воспалительные процессы (Black, 2002). При воспалении, как и при стрессе, происходит увеличение секреции КРГ, приводящее к активации гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси. Острое воспаление вызывает также увеличение уровня в крови катехоламинов и глюкокортикоидов (Black, 2002). Выявлена значительная роль тучных клеток в регуляции воспалительного процесса (Умарова и др., 2006; Умарова и др., в печати).

Известно, что одним из главных проявлений стрессорной патологии человека, которое определяет и вегетативные стрессорные патологии, является нарушение психического статуса.

Тревога - центральный элемент психического стресса, активирущий механизмы так называемой психической адаптации, которая в зависимости от особенностей организма может протекать либо в виде пассивного приспособления, либо в виде активного процесса. При острых психических (аффективно-шоковых) состояниях выраженность тревоги настолько велика, что приводит к нарушению сознания, дезорганизации поведения (паника или ступор), развитию депрессии. Острый стресс может инициировать также и развитие психотических расстройств (реактивных психозов). Среди состояний, определяющихся непосредственно выраженной тревогой, выделяются генерализованное тревожное расстройство, эпизодическая тревога и тревож-но-фобические расстройства (Мосолов, 1995; Пшенникова, 2000).

Тревога и депрессия являются самыми распространенными (первичными) человеческими эмоциональными реакциями на стрессорные воздействия. Неудивительно, что они часто встречаются вместе, хотя представляют собой

35 совершенно разные явления (Мосолов, 1995). Тревога отражает состояние

повышенной готовности организма (hyper-arousal) к быстрому ответу на возможные внешние стрессорные факторы; тогда как депрессия - состояние подавленности, угнетения, часто вследствие осознания безвыходности ситуации. Нередко депрессия развивается вторично, после длительного состояния тревоги, поддерживаемой не разрешающейся стрессовой ситуацией, и тогда депрессия не позволяет организму справиться со стрессом.

Существуют и биохимические показатели депрессивного состояния, например, примерно у половины депрессивных больных повышено содержание в крови гидрокортизона и обнаруживается отсутствие эффекта дексаме-тазона на секрецию гидрокортизона - так называемый "патологический дексаметазоновый тест". При тяжелой депрессии выделение гидрокортизона в организме не подавляется и его содержание после приема дексаметазона не изменяется. Нормализация этого теста может быть предвестником выздоровления (Шейдер, 1998).

Показано, что при депрессивном состоянии происходит изменение концентрации иммуноглобулина и комплимента в сыворотке и плазме крови, например, концентрации IgA, IgM, комплемента СЗ и С4. Наблюдается увеличение концентрации цитокинов, интерлейкина-1, INF-a и снижение уровня 11-2. Все это, в конечном итоге, приводит к дискоординированному выделению КРГ, пролактина, АКТГ и кортизола и активации стресс-системы (Белопольская, 2003).

Есть также данные об изменении (уменьшении) плотности опиатных рецепторов в мозге больных депрессиями (Bhargava, 1994), что свидетельствует об участии опиатных нейропептидов в развитии данного заболевания. Интенсивный и/или длительный стресс может спровоцировать развитие панических расстройств, одним из разновидностей которых являются фобии. Вегетативными проявлениями фобий, также как и других стрессорных патологий являются тахикардия, повышение АД и др.

Анализ фармакологических стредств, применяемых в настоящее время для коррекции постстрессорных нарушений, показывает, что центральное место среди них занимают препараты, направленные на снижение активности стресс-системы, либо препараты, повышающие активность стресс-лимитирующих систем. В том и другом случае результирующий эффект выражается в ограничении стресс-реакции.

Среди таких средств следует назвать, прежде всего, препараты, активирующие функцию ГАМК-ергической системы или дублирующие ее (Воронина, 1998; Соколова, 1996). К традиционным анксиолитикам относят прямые агонисты ГАМК_А-бензодиазепинового рецепторного комплекса (производные бензодиазепина). К новому поколению препаратов данного класса относят серотонинергические, глутаматергические анксиолитики, гормональные вещества (мелатонин), |3-адреноблокаторы, анксиолитики на основе пептидов и др. У разных препаратов этой подгруппы эти эффекты выражены в различной степени.

Препараты бензодиазепинового ряда, связываясь с бензодиазепиновыми рецепторами, повышают аффинность ГАМК-рецепторов и тем самым активируют тормозную функцию ГАМК-ергической системы. Поэтому основным специфическим эффектом данных психотропных средств является анксиолитический, транквилизаторный эффект, который облегчает переживание сильного эмоционального стресса, что выражается в устранении тревоги, страха, беспокойства, волнения. Но вместе с тем данные препараты могут давать побочные эффекты: снотвоворный, седативный, миорелаксант-ный и др.

Несмотря на низкую токсичность и хорошую переносимость многих препаратов бензодиазепинового ряда, при их бесконтрольном длительном применении в высоких дозах повышается угроза развития синдрома отмены,

37 а также психологической и психической зависимости. Синдром отмены

может характеризоваться обострением основной болезни, появлением

депрессивных расстройств, бессонницы и тахикардии (Воронина, Середенин,

2002).

Существенный интерес представляют так называемые ноотропные препараты. В 1963 году бельгийскими фармакологами С. Giurgea и V. Skondia был синтезирован первый препарат этой группы — пирацетам, ныне известный также как "ноотропил" (Воронина, Середенин, 1998; Воронина, Молодавкин и др., 2000; Giurgea, 1972).

В 1972 году К. Giurgea был предложен термин ноотропы для обозначения класса препаратов, улучшающих высшие функции головного мозга и не имеющих значительных побочных эффектов.

Нет единого механизма действия для всех ноотропов. Известно, что ноотропные эффекты могут быть вызваны:

4. непосредственным воздействием на нейроны;

5. улучшением мозгового кровотока и микроциркуляции крови в мозге;

6. антиагрегационным, антигипоксическим, противоотечным действием.

Основными механизмами действия ноотропных средств считаются влияние на метаболические и биоэнергетические процессы в нервной клетке и взаимодействие с нейромедиаторными системами мозга (моноаминергиче-ской, холинергической, глутаматергической) (Воронина, Середенин, 1998). Ноотропы оказывают также и другие воздействия, среди которых: мембрано-стабилизирующее (регуляция синтеза фосфолипидов и белков в нервных клетках, стабилизация и нормализация структуры клеточных мембран); антиоксидантное (ингибирование образования свободных радикалов и перекисного окисления липидов клеточных мембран); антигипоксическое (снижение потребности нейронов в кислороде в условиях гипоксии);

38 нейропротективное (повышение устойчивости нервных клеток к воздействию

неблагоприятных факторов различного рода).

Еще один класс соединений, используемых для фармакотерапии различных стрессорных патологий - антидепрессанты. Общим для всех известных современных антидепрессантов является то, что все они тем или иным способом — либо, блокируя обратный захват моноаминов, либо, блокируя их разрушение моноаминоксидазой (МАО) - повышают содержание одного или нескольких медиаторных моноаминов (норадреналина, серотонина, дофамина и других) в синаптической щели (Hjors et. al., 2000; Moret, Briley, 2000; Goldstein et. al., 2003; Hubalek et. al., 2003).

Эффективность антидепрессантов зависит от тяжести депрессии и степени резистентности к антидепрессантам (опыта предыдущего лечения). Внезапная их отмена может приводить к появлению тревоги, беспокойства, бессонницы, ослаблению внимания и многих вегетативных расстройств (тахикардии, диспепсическим расстройствам, анорексии, тремору и др.).

Препятствием к более широкому применению и использованию препаратов данного класса являются побочные эффекты, иногда небезопасные, в связи с их взаимодействием с некоторыми лекарствами и пищевыми продуктами, содержащими тирамин, а также тяжелые отравления при передозировках. В связи с указанным применение неселективных ингибиторов МАО требует большой осторожности (Cusson et. al., 1991; VanDenBerg et. al., 2003).

Таким образом, фармакотерапия постстрессорных патологий требует дальнейшего расширения и усовершенствования. Так, бензодиазепиновые производные быстро купируют тревогу, но обладают низкой эффективностью в лечении депрессии. Кроме того, они малопригодны для длительного применения, поскольку вызывают зависимость и когнитивные нарушения. Трициклические антидепрессанты (дезипрамин, имипрамин, амитриптилин)

39 вызывают большое количество побочных эффектов (прежде всего, антихоли-

нергических и со стороны сердечно-сосудистой системы), они потенциально опасны при передозировке препарата, дают излишнюю седацию без истинного анксиолитического эффекта и в некоторых случаях в начале лечения могут обострять симптомы тревоги.

Кроме того, большинство препаратов, используемых для лечения стрес-сорных патологий, представляют собой синтетические, соединения. Поэтому до настоящего времени остается актуальным поиск препаратов - эндогенных регуляторов, обладающих минимумом побочных эффектов при эффективной способности устранять или ослаблять постстрессорные нарушения.

II. Глипролины

В последние время внимание исследователей привлекло новое семейство коротких ди- и трипептидов, содержащих в своей последовательности глицин и пролин - глипролины (ГП). У пептидов данного семейства (PGP, PG, GP, цикло-PG и др.) обнаружен широкий спектр биологической активности. Они участвуют в поддержании гомеостаза слизистой оболочки желудка (СОЖ) (Абрамова и др., 1996; Ашмарин и др., 1999; Жуйкова и др., 2004; Бакаева, Самонина, 2005; Samonina et. al., 2000), регулируют активность элементов системы кровесвертывания и тромбообразования (Пасторова и др., 1998; Ляпина и др., 2002; Ляпина, Пасторова и др., 2006; Lyapina, Pastorova et. al., 2000), влияют на процессы воспаления (Жуйкова, Бадмаева и др., 2003; Умарова и др., 2006; Труфанова и др., в печати). Кроме того, ГП обладают способностью регулировать активность лейкоцитов (Асташкин и др. 2003; Watanabe et. al., 1994; Haddox et al., 1999; Haddox et. al., 2001) и фибробластов (Postlethwaite et. al., 1978), систему микроциркуляции (Копылова и др., 2003; Копылова и др., 2006), секреторную активность тучных клеток (Умарова и др., 2003; Смирнова и др., 2003). На модели аллоксанового диабета выявлен антигликемический эффект PGP (Ляпина и др., 2002).

40 Все эти данные свидетельствуют о значительной роли глипролинов в

поддержании гомеостаза.

Глипролины имеют два возможных источника образования - эндогенный (главным образом в процессе синтеза и деградации коллагена и эластина) и экзогенный (расщепление пищевых белков, в том числе коллагена, казеина и др.) (Ашмарин, Каменский и др., 2002; Дубынин и др., 2004; Samonina et. al., 2002; Iwai et. al., 2005). Особенностью молекулы коллагена является высокое содержание глицина (33%) и пролина (12%), которые образуют последовательности PG, GP, PGP и др. Перед секрецией из фибробластов коллаген проходит стадию созревания, состоящую в частичном протеолизе уже собранных полипептидов. При этом около 90% продуктов деградации коллагена секретируется в виде малых пептидов (< 5 аминокислот) (Bienkowski et. al., 1978; Ашмарин и др., 2006). Авторы полагают, что деградация только что синтезированного коллагена является тем механизмом, посредством которого клетки контролируют количество и качество продуцируемого коллагена: они распознают его "дефектные" молекулы и разрушают их непосредственно перед секрецией (Berg et. al., 1980; Imberman et. al., 1982; Rennard et. al., 1982). По всей видимости, данный процесс может являться источником эндогенных глипролинов (Ашмарин и др., 2002; Ашмарин и др., 2006).

Другим источником эндогенных ГП может быть процесс катаболизма коллагена и эластина - другого белка, особенно богатого фрагментами GP и PG. Содержание глицина и пролина в эластине составляет около 25-28% и 14% соответственно (Мазуров, 1974). Катаболизм эластина также сопровождается выходом простейших глипролинсодержащих ди- и трипептидов. Процентное содержание глипролинов при этом неизвестен (Ашмарин и др., 1998а; Ашмарин и др., 2002). В здоровом организме этот процесс практически не изучен, вероятно, он может быть связан с обновлением коллагеновых структур. Существуют данные о значительном увеличении уровня GP и

41 других дипептидов, содержащих на С-конце пролин и оксипролин в моче при

заболеваниях кожи (Faull et. al., 1976; Le et. al., 1999) и образовании PGP при

разрушении сетчатки глаза (Pfister et. al., 1995; Pfister et. al., 2000).

Вполне вероятно существование в организме и других белков-предшественников, помимо коллагена и эластина, являющихся возможными источниками глипролинов. Одним из них может быть Р-казеин - белок коровьего молока.

Глипролины входят в состав не только коллагена, эластина и р-казеина, но и других белков - энтеростатинов, липотропинов, (3-казоморфинов, фибриногена и др. Повторяющийся мотив -PGP- встречается в структуре рецепторов пролактина (Bazan, 1989; O'Neal, Yu-Lee, 1993; Soman et. al., 1997; Wang et. al., 1997), иммуноглобулиновых рецепторов (Snyder et. al., 1999; Albrandt et. al., 1987), а также в составе трансмембранных гликопротеи-нов на поверхности антиген-презентирующих клеток (Griffith et. al., 1988).

Последовательность Gly-Ala-Gly-Pro входит в состав а.г_с а-цепи адрено-рецепторов (Hein et. al., 1999; Kirstein, Insel, 2004) и рецепторов холецистоки-нина (Song et. al., 1993).

Глипролины широко представлены в структурах регуляторных олиго-пептидов, обладающих разнообразным спектром биологической активности. Примерами служат трипептиды Gly-Pro-Glu, Gly-Pro-Leu, Leu-Gly-Pro, Gly-Pro-Arg, Ac-Pro-Gly-Pro, Gly-Pro-Gly-NH2 (Ашмарин, 2007). Так, пептид Gly-Pro-Glu, образующийся из специализированного предшественника -инсулинового ростового фактора - IGF-I, оказывает нейропротекторное лечебное действие в отношении ишемических повреждений мозга, вызванных гипоксией (Sizonenko et. al., 2001; Guan et. al., 2004).

Были обнаружены хемоатрактантные свойства в отношении нейтрофи-лов у пептида Ac-Pro-Gly-Pro, образующегося из коллагена при воспалительных процессах в роговице глаза (Haddox et. al., 1999).

42 Глипролинсодержащие трипептиды, такие как Gly-Pro-Leu, Leu-Gly-Pro

оказались эффективными ингибиторами одного из ведущих индукторов

гипертензии - ангиотензин-1-превращающего фермента (Ашмарин, 2007;

Saiga et. al., 2006).

Пептид Gly-Pro-Gly-NH2, образованный в результате модификации гли-пролина Gly-Pro-Gly, подавлял развитие ретровирусов HIV в клеточных культурах (Ашмарин, 2007). В работе Учакиной были выявлены цитокин-стимулирующее и интерферон-индуцирующее иммунотропные эффекты самого PGP (Учакина, 2006).

К сожалению, нет никаких сведений о доле и динамике образования эндогенных простейших пролинсодержащих пептидов.

Экзогенным источником ГП могут быть коллаген, эластин и другие белки, поступающие с пищей (Ашмарин и др., 2002; Iwai et. al, 2005). В последнее время были получены данные о том, что некоторые пептиды, состоящие из остатков пролина и оксипролина, и некоторые другие малогид-ролизуемые (или резистентные к гидролизу) ди- и трипептиды всасываются частично или полностью в нерасщепленном виде. При повреждении слизистой оболочки ЖКТ в результате некоторых патологий или при сильном стрессе в кровь могут проникать и более длинные молекулы (Низов и др., 1996; Мазо и др., 1997; Дубынин и др., 2004). Высказывалось предположение, что в зависимости от типа белков всасывание интактных пептидов может составлять до 30% (Gardner, 1988). Было выявлено присутствие в апикальной мембране кишечных клеток кролика специальной транспортной системы, переносящей ди- и трипептиды - PepTl (Тимофеева и др., 2000). В литературе имеются некоторые данные, свидетельствующие о способности пептида PGP преодолевать гемато-энцефалический барьер (Васьковский и др., 2003, Золотарев и др., 2003). Интересными оказались результаты, полученные Васьковским и соавт. (2003), по исследованию перераспределения радиоактивной метки, связанной с PGP, между органами при 10-

43 тиминутном иммобилизационном стрессе. Было обнаружено увеличение

радиоактивности мозга у стрессированных животных по сравнению с

интактным контролем в 4,5 раза (Васковский и др., 2003). Увеличение

проницаемости ГЭБ в отношении веществ белковой природы при действии

умеренного стресса наблюдали также Banks и Kastin (1987).

В результате исследований гидролизатов казеинов были выделены пептиды - Р-казоморфины - фрагменты |3-казеинов. Высокая устойчивость 0-казоморфинов к действию пептидаз обусловлена именно наличием в их молекуле большого количества пролиновых остатков, что хорошо прослеживается в структуре (З-казоморфина-7 - Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile (Дубынин и др., 2004).

В результате многочисленных исследований был выявлен обширный спектр физиологической активности ГП, направленный на поддержание нормального функционирования различных систем организма.

Подробно исследованы противоязвенные эффекты глипролинов (Жуйкова, Бакаева и др., 2003; Самонина и др., 2003; Жуйкова и др., 2004; Бакаева, Самонина, 2005; Samonina et. al., 2000).

Так было показано, что пептиды PGP, GP и PG в разной степени обладают протекторным действием в отношении стрессорных, этаноловых, индометациновых повреждений СОЖ и повреждений, вызванных введением вещества 48/80 (Абрамова и др., 1996; Жуйкова, Бакаева и др., 2003; Бакаева и др., 2004; Жуйкова, Бадмаева и др., 2004; Samonina, Lyapina et. al., 2000). Дальнейшее исследование глипролинов выявили особенности их протекторного противоязвенного действия на различных моделях язвообразования. Пептид PGP обладал выраженным протекторным эффектом в отношении всех типов повреждений СОЖ. Пептид PG в эквимолярной PGP дозе обладал протекторным действием в отношении этаноловых и индометациновых язв, тогда как пептид GP эффективно предотвращал развитие стрессорных и индометациновых язв, а также язв, вызванных введением вещества 48/80

44 (Жуйкова, Бакаева и др., 2003; Жуйкова и др., 2004; Самонина и др., 2003).

Увеличение дозы PG и GP приводило к проявлению их протекторных противоязвенных эффектов в отношении стрессорных язв для PG и этаноло-вых язв в отношении GP (Жуйкова, Бакаева и др., 2003; Жуйкова и др., 2004; Samonina et. al., 2000).

На ацетатной модели язвообразования были обнаружены лечебные (терапевтические) эффекты ГП. Пептиды PGP, PG и GP при хроническом введении в течение 5 (Жуйкова, Бадмаева и др., 2003; Жуйкова и др., 2004) или 3-х дней (Бакаева, Самонина, 2005; Труфанова и др., в печати) ускоряли заживление ацетатных язв, вызванных аппликацией ледяной уксусной кислоты. При этом было обнаружено, что ГП изменяют гистоморфологиче-скую картину ацетатной язвы. Ускоряя заживление ацетатных язв, они приводят к более ранней и полной дифференцировке поверхностного эпителия и желез слизистой желудка, и способствуют формированию на месте регенерирующей слизистой оболочки фибробластов и значительному уменьшению числа макрофагов (Жуйкова и др., 2003; Труфанова и др., в печати).

Было изучено влияние глипролинов PGP, PG и GP на секрецию желудочного сока. Язвообразование является результатом рассогласования работы агрессивных (секреция кислоты и пепсина) и защитных систем (слизе-бикарбонатная секреция) желудочного сока. Глипролины участвуют в поддержании гомеостаза слизистой оболочки желудка, нормализуя базальную секрецию кислоты и бикарбонатов. Противоязвенные эффекты ГП могут быть связаны с уменьшением стимулированной кислой секреции и увеличением секреции бикарбонатов (Бакаева и др., 2004; Жуйкова и др., 2003).

В ряде работ выявлено значительное влияние ГП на систему кровоснабжения.

Было обнаружено влияние пептидов на кровоток в стенке желудка. Показано, что глипролины PGP и PG способны восстанавливать уменьшенный

45 индометацином кровоток. Кроме того, предварительное введение пептида

PGP предотвращало снижение кровотока, вызванного внутрижелудочным

введением этанола (Жуйкова и др., 2001; Самонина и др., 2001; Самонина,

Бакаева, 2001).

Пептид PGP оказывал вазодилататорное действие, уменьшая сопротивление перфузируемого изолированного сосудистого бассейна задней лапы крысы (Абрамова и др., 1997).

Стабилизирующее влияние на кровоток может быть связано с прямым сосудорасширительным эффектом ГП. На модели кольцевого препарата аорты крысы пептиды PGP, PG и GP вызывали вазодилатацию сосуда в широком диапазоне концентраций (10" - 10" М). Было показано, что эффекты пептидов PGP и PG эндотелийзависимы, тогда как сосудорасшири-тельные эффекты GP сохранялись и при разрушенном эндотелии. То есть, GP способен действовать непосредственно на гладкомышечные клетки стенки сосудов (Бакаева и др., 2003).

Широко изучены эффекты глипролинов на систему гемостаза.

В экспериментах in vivo ГП изменяли параметры противосвертывающей системы. Это проявлялось в усилении антикоагулянтных, фибринолитиче-ских, антифибринстабилизирующих и антитромбоцитарных свойств плазмы крови (Пасторова и др., 1998; Пасторова и др., 2001; Ашмарин и др., 1998b; Ашмарин и др., 2002; Ляпина и др., 2006; Lyapina et. al., 2000; Samonina et. al., 2000; Samonina et. al, 2002).

В экспериментах in vitro ГП (PGP, PG и GP) также оказывали влияние на противосвертывающую систему, проявляя фибриндеполимеризационную и антикогулянтную активность, и уменьшая агрегацию тромбоцитов (Ашмарин и др., 1998b; Ляпина и др., 2006). Полученные данные свидетельствуют о прямых эффектах ГП на некоторые механизмы поддержания гемостаза. В то же время, почти все ГП обнаруживают некоторые опосредованные эффекты. Так, только в условиях in vivo они вызывают значительное повышение в

46 плазме крови активности тканевого активатора плазминогена (ТРА) (Ляпина

и др., 2006).

Наибольшим противосвертывающим эффектом обладают ди- и трипеп-тиды PG и PGP (Пасторова и др., 2001; Ляпина и др., 2002; Ляпина и др., 2006).

Предполагается, что одним из механизмов противосвертывающего действия ГП может быть их взаимодействие с рецепторами на тромбоцитах, в том числе и со специфичным для коллагена рецептором - гликопротеином VI, препятствуя его взаимодействию с фибриногеном (Siljander et. al., 2004) и, тем самым, ингибируя агрегацию тромбоцитов.

В литературе также имеются данные о том, что преинкубация полимор-фонуклеарных лейкоцитов периферической крови человека в иминодипепти-де, содержащим в С-терминальном положении пролин и/или в N-терминальном положении Pro-Pro, Gly-Pro, Pro-Gly, Ala-Pro и Pro-Ala значительно и дозозависимо увеличивают генерацию супероксида в нейтро-филах (Watanabe et. al., 1994).

В работе Смирновой было показано, что стрессогенные воздействия различной природы вызывали нарушения функционального состояния микро-циркуляторного русла брыжейки крыс. Эти нарушения развивались на фоне усиленной секреторной активности тучных клеток. Со стороны лимфатической системы эти изменения заключались в том, что лимфатические сосуды временно теряли способность реагировать на норадреналин, снижалась длительность сократительного ответа на норадреналин, а также уменьшился процент ответивших на него сосудов. Кроме того, стресс вызывал общее замедление лимфотока, вплоть до полной его остановки.

Со стороны кровеносной системы наблюдались явления венозного застоя - ткани кишечника отличались бледностью, иногда с цианотичным оттенком, кровоток в капиллярах заметно подавлялся.

О существенной роли тучных клеток в развитии стрессогенных нарушений микроциркуляции свидетельствовал тот факт, что неселективный активатор тучных клеток - вещество 48/80 вызывал нарушения микроциркуляции, сходные с таковыми при стрессе, тогда как предварительная стабилизация тучных клеток кетотифеном устраняла стрессогенные нарушения микроциркуляции (Смирнова, 2003).

Предварительное введение пептидов PGP, PG и GP предотвращало активацию тучных клеток и развитие стрессогенных нарушений микроциркуляции (Умарова и др., 2003; Смирнова и др., 2003; Копылова и др., 2003; Копылова и др., 2006). Глипролины снижали реактивность тучных клеток и при активации синактеном - фрагментом АКТГ].₂4 как в условиях in vitro, так и in vivo, что свидетельствует о возможности их прямого стабилизирующего действия на тучные клетки (Умарова и др., 2003; Смирнова и др., 2003).

В работе Умаровой и соавт. (2006) на модели экспериментального перитонита были исследованы противовоспалительные эффекты ГП. В качестве провоспалительного агента использовали внутрибрюшинное введение 40% раствора тиогликолата. Наблюдавшиеся изменения со стороны микроциркуляции были сходными с таковыми при действии стресса.

Введение PGP, PG и GP оказывало протекторное действие на систему микроциркуляции брыжейки, ослабляя течение воспалительного процесса.

На фоне ГП воспалительный ответ со стороны лимфатической системы был менее выражен. Об ослаблении воспалительного процесса свидетельствовало и уменьшение количества экссудата (в 2 раза) у животных, получавших ГП. Наиболее сильное протекторное действие оказывал пептид PGP.

Таким образом, введение ГП существенно улучшало функциональное состояние микроциркуляторного русла брыжейки на модели экспериментального перитонита, вызванного введением тиогликолата (Умарова и др., 2006).

48 Пептид PGP обладал не только протекторным, но и терапевтическим

эффектом, так как устранял или ослаблял нарушения микроциркуляции

брыжейки крыс при введении его на фоне уже развившегося воспаления

(Умарова и др., в печати).

О влиянии ГП на ЦНС известно относительно мало. О его наличии свидетельствует способность ГП преодолевать ГЭБ и накапливаться в структурах мозга (Васьковский и др., 2003; Золотарев и др., 2003; Бакаева и др., 2004); способность предотвращать развитие повреждений СОЖ, вызванных воздействием стрессорных факторов (Жуйкова, Бакаева и др., 2003; Жуйкова и др., 2004; Бадмаева и др., 2004), стрессогенные нарушения микроциркуляции брыжейки крыс и стрессвызванную активацию тучных клеток (Копылова и др., 2003; Умарова и др., 2003; Копылова и др., 2006).

В органотипической культуре спиномозговых ганглиев 10-тидневных эмбрионов цыпленка, являющейся классической тест-системой для обнаружения нейротрофической активности различных веществ, были выявлены собственные нейротрофические эффекты PGP. Введение в среду пептида PGP в концентрации 0,05 нг/мл вызывало увеличение роста нейритов на 82±7% по сравнению с контролем (Комашня и др., 2005).

Пептид PGP в культуре тканей защищает клетки феохромоцитомы крыс PC 12 от окислительного стресса, увеличивая выживаемость клеток на 60% (Сафарова, 2002).

Весьма близок к линейным ГП цикло-Pro-Gly (цикло-PG). Экспериментально доказано наличие эндогенного цикло-PG в мозге крыс; выявлена зависимость между содержанием цикло-PG в мозге и типом реакции животных на эмоционально-стрессовое воздействие. Изучена способность данного пептида стимулировать процессы обучения и памяти; определены его анксиолитические эффекты (Гудашева, Бойко и др., 1996; Гудашева, Константинопольский и др., 2001; Середенин и др., 2002). Также как и

49 линейные ГП он оказывает влияние на свертывание крови (Ляпина и др.,

2006).

Трипептид Gly-Pro-Arg оказался способен подавлять развитие болезни Альцгеймера, предотвращая гибель нейронов гиппокампа под влиянием 0-амилоида, и, также как и ГП, тормозит агрегацию тромбоцитов (Nonaka et. al., 1997).

Известно, что в организме теплокровных животных большинство экзо- и эндопептидаз не расщепляют последовательности, обогащенные пролиновы-ми остатками (Ашмарин и др., 2002; Ashmarin et. al., 2005). Эта особенность послужила одной из причин использования последовательности PGP в качестве стабилизатора некоторых эндогенных регуляторных пептидов. Так, присоединение последовательности PGP к С-концу пептидов АКТГ4.7 и тафцина привело к созданию их стабильных аналогов: семакса и селанка соответственно, что позволило увеличить длительность их действия (Ашмарин и др., 1997).

Эксперименты на животных показали, что введение семакса в низких дозах стимулирует обучение, ослабляет амнезию, нормализует кровообращение в головном мозге и оказывает антигипоксическое действие (Ашмарин и др., 1997; Яковлева и др., 1999; Гусев, Скворцова, 2001; Левицкая, Каменский, 2003; Сафарова и др., 2002; Kaplan et. al., 1996). Семакс является одним из немногих синтетических регуляторных пептидов, прошедших к настоящему времени все стадии от фундаментальных разработок до практического применения в клинике в качестве ноотропного и нейропротекторного лекарственного средства (Шевченко и др., 2006; Ашмарин и др., 2007).

Обнаружено существование центров связывания семакса с плазматическими мембранами базальных ядер переднего мозга крысы и исследована динамика его деградации при инкубации с данными мембранами. Показано, что в присутствии плазматических мембран время полураспада семакса превышает 1 час. Деградация происходит и с С-, и с N-конца молекулы

50 семакса с доминирующим образованием пентапептидов (Долотов и др.,

2004а, 2004b). В экспериментах по исследованию биодеградации меченого

тритием семакса показано значительное содержание радиоактивной метки в

тканях мозга при внутривенном и интраназальном введении (Шевченко и др.,

2006).

Показано селективное влияние семакса на выживаемость холинергиче-ских нейронов базальных ядер переднего мозга крысы in vitro и увеличение под действием семакса экспрессии нейротрофина BDNF и его высокоаффинного рецептора в первичных культурах нейроглии и в головном мозге крысы (Долотов и др., 2003; Shadrina et. al., 2001).

Также как и ГП семакс обладает протекторным и терапевтическим действием в отношении повреждений СОЖ различного генеза (Жуикова, 2000; Жуйкова и др., 2002; Ashmarin et. al., 2005); предотвращает развитие стрессогенных нарушений микроциркуляции (Копылова и др., 2003; Копылова и др., 2006) и падение кровотока в желудке на фоне индометацина; оказывает стабилизирующее влияние на тучные клетки (Умарова и др., 2003). Сходство с ГП ему придает и влияние на процессы свертывания крови (Ляпина и др., 2006). Также как и PGP семакс защищает клетки феохромоци-томы крысы от окислительного стресса (Сафарова и др., 2002).

Пептид селанк уже проходит заключительную стадию клинических испытаний как препарат, обладающий выраженным анксиолитическим действием (Ашмарин и др., 2007). Были изучены эффекты селанка на ЦНС. Показано, что пептид в широком диапазоне доз устраняет проявления тревоги у мышей линии Balb/c с генетически детерминированным высоким чувством тревоги и "пассивной" формой поведения в условиях избегаемого и неизбегаемого стресса, и не влияет на поведение мышей линии С57В1/6 с низким уровнем тревоги и "активной" формой поведения в тех же условиях. Эффект сопоставим с транквило-активирующей фазой действия бензодиазе-пиновых транквилизаторов, однако в отличие от последних даже более чем

51 15-30-кратное увеличение дозы пептида не вызывает седации, миорелаксант-

ного и других видов побочного действия, свойственного бензодиазепинам

при увеличении дозы (Середенин и др., 1998).

Определены продукты биодеградации селанка, которая преимущественно осуществляется в основном дипептидилкарбоксипептидазами и приводит к отщеплению GP. Распределение меченого тритием селанка и его пептидных метаболитов по разным системам и органам выявило значительное его содержание в тканях мозга при разных способах введения (Павлов, 2006).

Селанк также как и ГП обладал протекторным и терапевтическим эффектом в отношении повреждений СОЖ, вызванных воздействием различных ульцерогенных факторов (Павлов и др., 2004; Павлов и др., 2007); стабилизировал уменьшенный индометацином кровоток (Павлов и др., 2005) и оказывал влияние на некоторые параметры системы кровесвертывания и тромбообразования (Ляпина и др., 2006).

Механизм противострессорных эффектов ГП до сих пор остается невыясненным. Возможны непосредственные воздействия на периферические эффекторные структуры, повышающие их устойчивость к стрессогенным воздействия. На это указывает наличие у глипролинов прямого сосудорас-ширительного эффекта (Бакаева и др., 2003), и тот факт, что ГП при непосредственном нанесении усиливали частоту и амплитуду сокращений лимфатических сосудов брыжейки крыс (Ашмарин, Каразеева и др., 1999). Снижение реактивности тучных клеток in vitro на действие синактена при предварительной инкубации препаратов в растворе PGP, PG или GP позволяет предположить, что ГП могут модулировать реакции, опосредуемые АКТГ.

С другой стороны, уменьшение постстрессорных нарушений может быть обусловлено влиянием глипролинов на структуры ЦНС, участвующие в формировании стресс-реакции и снижением интенсивности стресс-ответа. Так, на культуре клеток феохромоцитомы крысы, используемой как модель

52 нейронов, пептид PGP оказывал нейропротекторное действие, защищая

клетки от окислительного стресса (Сафарова и др., 2002).

О наличии центральных эффектов ГП можно судить по их влиянию на поведение животных.

Тем не менее, попытки выявить влияние ГП на поведение животных до сих пор не дали положительных результатов. В работе Левицкой Н.Г. и др. (2000) не было выявлено заметного эффекта PGP на поведенческие реакции интактных крыс в тестах "Открытое поле", "Норковая камера"; на выработку пищедобывательного рефлекса в Т-образном лабиринте, и при исследовании уровня пищевой мотивации (Левицкая и др., 2000). В работе Козловской М.М и др. отмечено лишь увеличение латентного периода первой иммобилизации в тесте Порсолта и увеличение уровня аффективных реакций в тесте подныривания по Хендерсону у крыс линии Wistar (Козловская и др., 2002).

Тем не менее, отсутствие влияния на поведение интактных животных, не исключает возможности их влияния на те структуры ЦНС, которые участвуют в формировании стресс-реакции и способности тем самым модулировать интенсивность стресс-ответа и, следовательно, стрессогенных повреждений в организме.

53 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проведены на 815 белых беспородных крысах-самцах весом 200-250г. Животные содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде. В течение 3-х дней, предшествующих эксперименту, с животными проводили процедуру "хэндлинга". Эксперименты с животными выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными европейским научным фондом и Хельсинской декларацией о гуманном отношении к животным.

I. Экспериментальные модели стрессорного воздействия

7. "Неизбегаемое плавание". Животное на 10 минут опускали в цилиндрическую емкость объемом 25 л на 2/3 заполненной водой при Т=22-23С. При этом крысы не доставали дна емкости. После плавания крыс тщательно высушивали.

8. Фармакологическая модель эмоционального стресса - введение ХЦК-4. ХЦК-4 вводили внутрибрюшинно в дозе 100мкг/кг в объеме 0,5 мл/200г.

9. Острая гипобарическая гипоксия. Моделирование острой гипобариче-ской гипоксии осуществляли в барокамере. Установка включала в себя камеру из толстого стекла (V = 3,2 л) с плотно закрывающейся резиновой пробкой (рис.1). Одна из трубок была подключена к насосу, при помощи которого производили откачку воздуха из камеры. Другая трубка служила для засасывания воздуха из окружающей среды. Скорость протока воздуха регулировали с помощью зажима. Измерение высоты подъема осуществляли при помощи альтиметра.

Гипоксию создавали разряжением атмосферы до 145 мм рт. ст., что соответствует высоте 11500 м над уровнем моря. Подъем на заданную "высоту" осуществляли за 1 минуту. Во время моделирования гипоксии у животных регистрировали следующие параметры:

Блок - схема экспериментальной установки.

/ Зажим для регуляции
Насос [ У давления в барокамере

Барокамера

Альтиметр

10. время потери позы (ВПП, с);

11. время жизни на "высоте" (ВЖ, с) - время от момента окончания "подъема" до остановки дыхания или первого атонального вдоха;

12. время реституции (ВР, с). Животное быстро извлекали из камеры и считали время от прекращения дыхания до восстановления активной позы.

Для каждого животного рассчитывали коэффициент индивидуальной устойчивости (КИУ) к гипоксии как отношение времени жизни к времени реституции (ВЖ/ВР). Увеличение значений данного коэффициента свидетельствует о возрастании устойчивости организма к действию экстремальной гипобарической гипоксии (Маслова и др., 1999).

II. Методы оценки поведения животных.

Для оценки поведения животных были использованы следующие экспериментальные установки:

1. "Приподнятый крестообразный лабиринт" ("ПКЛ"). Установка состояла из 4-х расходящихся из центра рукавов. В экспериментах использовалась следующая модификация "ПКЛ": длина рукавов - 35 см; высота стенок - 20 см; центральная площадка - 10*10 см. Два противоположных

55 рукава были затемнены и закрыты с боков и торцов стенками; два других -

освещены и открыты. Установка приподнималась на высоту 50 см от пола.

Для облегчения подсчета числа горизонтальных перемещений на свету пол каждого из открытых рукавов, покрытый коричневой краской, был разделен белой линией на 2 равные части. Для оценки двигательной активности определяли число пересеченных линий, учитывая указанную линию, и линию, условно отделяющую выход из рукава на центральную площадку (выходы на открытые рукава лабиринта). В начале эксперимента крысу помещали в центр лабиринта, произвольно ориентируя относительно любого из открытых рукавов, и в течение 3-х минут оценивали следующие параметры:

- общее время пребывания на светлых рукавах лабиринта - время на свету

(с);

число стоек (число подъемов на задние лапы);

число выглядываний из темных рукавов лабиринта;

число свешиваний со светлых рукавов лабиринта;

число выходов на открытые рукава лабиринта;

число переходов через центр лабиринта;

время затаивания (freezing-реакция) (с).

2. "Норковая камера". Экспериментальная камера представляет собой ящик размером 40x40x30 см. Пол камеры имеет 16 круглых отверстий ("норок") и расчерчен на 16 квадратов. Арена камеры освещалась красным светом. При тестировании животное помещали в центр камеры и в течение 3-х минут регистрировали следующие показатели:

а) горизонтальную двигательную активность (длина пробега);

б) число стоек

в) число обследованных норок (число погружений головы в отверстие до
уровня ушей);

Рис. 2. Установка "Приподнятый крестообразный лабиринт".

г) время затаивания (с).

Рис. 3. Установка "Норковая камера"

3. "Метод Порсолта". В эксперименте использовали модифицированный тест принудительного плаванья по Порсолту (Порсолт, 1977). Животное опускали в емкость, заполненную водой так, что крыса не могла касаться дна, и в течение 10 мин регистрировали следующие параметры поведения:

- суммарную длительность активного плавания (крыса совершает активные

плавательные движения, перемещаясь внутри емкости);

суммарную длительность пассивного плавания (крыса производит редкие одиночные движения конечностями и хвостом с целью удержания головы над поверхностью воды);

длительность иммобилизации (животное полностью неподвижно, над поверхностью воды выступает только нос).

III. Исследование кинетики поступления меченого тритием PGP ([³H]PGP) в органы и ткани крыс.

Равномерно меченый тритием пептид PGP - [ H]PGP был получен в институте Молекулярной генетики методом высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО) водорода на тритий. Этот метод позволяет сохранять как физико-химические свойства, так и биологическую активность исходного пептида (Золотарев и др., 2000; Zolotarev, 2003).

В отличие от метки в пептидах, полученных традиционными способами, изотопная метка, введенная в пептиды с использованием реакции ВТКИО, распределена по всей его молекуле, что открывает возможность слежения за всеми продуктами его биодеградации.

[^JH]PGP (ІмКи) вводили внутрибрюшинно, интраназально и внутривенно (в хвостовую вену) из расчета ІмКи на животное в объеме 200 микролитров.

Животных умерщвляли через 3, 6 и 12 минут после введения меченого пептида.

Кровь собирали из яремных вен. Мозг, желудок, сердце, печень, почки извлекали, промывали в физиологическом растворе и подсушивали фильтровальной бумагой. Все образцы сразу же замораживали в жидком азоте. Замороженные образцы взвешивали, гомогенизировали в 10 мл ацетонитри-

58 ла, содержащего 1% трифторуксусной кислоты и центрифугировали в

течение 30 минут (8000 об/мин). Полученный супернатант высушивали при температуре 40С в роторном испарителе. Упаренные образцы заливали 1 мл метанола и откручивали на малой центрифуге в течение 15 минут. Для сцинтилляционного анализа использовали 10 микролитров супернатанта, который добавляли к 5 мл сцинтиллятора Ready Gel и определяли уровень радиоактивности на жидкостном сцинтилляционном счетчике Beckman LS-9800. Эффективность счета составляла 30-32%.

На основании полученных данных и веса образца рассчитывали величину радиоактивности на 1 г массы образца.

IV. Исследование биодеградации [³H]PGP методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Стрессорные патологии

В основе стрессорных патологий лежит нарушение способности организма отвечать на действие стрессоров адекватной защитной реакцией. Если фактор является стрессором, то эффект его действия, т. е. выраженность стресс-реакции, будет зависеть от: интенсивности стрессора (сила и продолжительность действия), степени устойчивости организма к действию фактора и индивидуального опыта, определяющего значимость стрессора. Гипервозбуждение стресс-системы сопровождается значительным увеличением уровня КРГ и может приводить к развитию различных патологических состояний, проявляющихся со стороны ЦНС в виде депрессии, повышения тревожности, подавления пищевых, оборонительных и половых реакций. У линии крыс Fisher с исходно повышенным уровнем КРГ обнаруживалась уязвимость в отношении восприимчивости к инфекции и опухолевому росту, но наблюдалось снижение восприимчивости к воспалению и аутоиммунным заболеваниям. Снижение содержания КРГ в гипоталамусе также влечет за собой сдвиги в работе стресс-системы и приводит к развитию патологических состояний.

Так, у линии крыс Lewis, с исходно низкой активностью КРГ-нейронов наблюдаются повышенная чувствительность к воспалительным и аутоиммунным заболеваниям и нарушения поведенческого ответа (Sternberg et. al., 1992; Patchev et. al., 1992; O Connor et. al., 2000). У человека гипоактивность гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси наблюдается при сезонных аффективных расстройствах, синдроме хронического ожирения и при никотиновой отмене у курильщиков (Joseph-Vanderpool et. al., 1991; Demirack et. al., 1991).

Механизмы возникновения стрессорных патологий напрямую связаны с центральными структурами стресс-системы. Важную роль в их возникновении играют изменения в центральных ядрах миндалины и гиппокампа, тесно связанных со стресс-системой (McEwen, Sapolsky, 1995). Ядра миндалины и гиппокамп - структуры лимбической системы мозга - одни из важнейших регуляторов мотивационных и эмоциональных реакций (Fanselow, Gale, 2003; Chen et. al., 2006). Электрическая и химическая стимуляция ядер миндалевидного комплекса приводит к изменениям как на периферическом: изменение кровяного давления, работы сердца, ЖКТ, эндокринной системы, так и на центральном уровне - возникновению поведенческих реакций, сходных с таковыми при эмоциональном стрессе (Goldstein et. al., 1996; Kim et. al., 2005). Показано, что выключение базолатерального ядра миндалины вызывает снижение уровня кортикостерона в крови и предупреждает его повышение при эмоциональном стрессе (Ikegaya et. al., 1996; Muller et. al., 1997). Разрушение ядер миндалины приводило и к изменениям поведенческих реакций, характерных для посттравматического стрессорного расстройства (Goldstein et. al., 1996).

Гиппокамп - главная структура мозга, ответственная за обучение и память (Wittenberg, Tsien, 2002; Kim, Diamond, 2002), тревожность (Wittington, Virag, 2006; Sarnyai et. al., 2000) и агрессию (van Riel et. al., 2002) и др. При поражении гиппокампа могут возникать различные патологии, одной из которых является синдром Корсакова - заболевание, при котором больной при сравнительной сохранности следов долговременной памяти утрачивается память на текущие события. Уменьшение объёма гиппокампа является одним из ранних диагностических признаков при болезни Альцгеймера (Гаврилова, 2001; Fukutani et. al., 2000; Kril et. al., 2002). Посттравматическое стрессовое расстройство (Bremner, 2006; Carrion et. al., 2007) и обширная депрессия (Sapolsky, 2001) также характеризуются уменьшением объема гиппокампа.

Вызванные стрессом нарушения функций ЦНС приводят к нарушению центральных механизмов поддержания гомеостаза, что, в конечном счете, может спровоцировать развитие различных соматических патологий.

При избыточной стресс-реакции могут возникать различные нарушения физиологических систем организма. Со стороны сердечно-сосудистой системы это риск развития внезапной сердечной смерти, инфаркта миокарда, гипертонии, инсульта и др. Повышение АД, ЧСС и сократительной функции сердца, "рабочая гиперемия" являются необходимым звеном адаптации к стрессору, однако при его избыточном действии растет риск развития патологий (Меерсон, 1993).

Одной из основных причин патологий внутренних органов является нарушение их адекватного кровоснабжения, связанное со стрессогенными изменениями микроциркуляции. Было показано, что стрессогенные воздействия различной природы вызывают нарушение сократительной активности лимфатических сосудов брыжейки крыс (Копылова и др., 2003; Копылова и др., 2006). Микроциркуляторное русло представляет собой разветвленную сеть кровеносных и лимфатических сосудов. В регуляции работы микроцир-куляторного русла принимают участие местные механизмы (растяжение сосудистых стенок, действие химических веществ и газов крови), так и центральные - через стимуляцию баро-, хемо- и механорецепторов (Смирнова, 2003). Адекватный уровень микроциркуляции поддерживается миоген-ными, нейрогенными и гуморальными механизмами. При активации стресс-системы в организме резко возрастает уровень стрессорных гормонов, которые оказывают влияние на сократимость и проницаемость сосудистых стенок, что сказывается в итоге на функционирование микроциркуляторного русла (Plante, 2002).

Методы оценки поведения животных

Опыты проведены на 815 белых беспородных крысах-самцах весом 200-250г. Животные содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде. В течение 3-х дней, предшествующих эксперименту, с животными проводили процедуру "хэндлинга". Эксперименты с животными выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными европейским научным фондом и Хельсинской декларацией о гуманном отношении к животным. I. Экспериментальные модели стрессорного воздействия 1. "Неизбегаемое плавание". Животное на 10 минут опускали в цилиндрическую емкость объемом 25 л на 2/3 заполненной водой при Т=22-23С. При этом крысы не доставали дна емкости. После плавания крыс тщательно высушивали. 2. Фармакологическая модель эмоционального стресса - введение ХЦК-4. ХЦК-4 вводили внутрибрюшинно в дозе 100мкг/кг в объеме 0,5 мл/200г. 3. Острая гипобарическая гипоксия. Моделирование острой гипобариче-ской гипоксии осуществляли в барокамере. Установка включала в себя камеру из толстого стекла (V = 3,2 л) с плотно закрывающейся резиновой пробкой (рис.1). Одна из трубок была подключена к насосу, при помощи которого производили откачку воздуха из камеры. Другая трубка служила для засасывания воздуха из окружающей среды. Скорость протока воздуха регулировали с помощью зажима. Измерение высоты подъема осуществляли при помощи альтиметра. Гипоксию создавали разряжением атмосферы до 145 мм рт. ст., что соответствует высоте 11500 м над уровнем моря. Подъем на заданную "высоту" осуществляли за 1 минуту. Во время моделирования гипоксии у животных регистрировали следующие параметры: 2. время реституции (ВР, с). Животное быстро извлекали из камеры и считали время от прекращения дыхания до восстановления активной позы. Для каждого животного рассчитывали коэффициент индивидуальной устойчивости (КИУ) к гипоксии как отношение времени жизни к времени реституции (ВЖ/ВР). Увеличение значений данного коэффициента свидетельствует о возрастании устойчивости организма к действию экстремальной гипобарической гипоксии (Маслова и др., 1999). II. Методы оценки поведения животных. Для оценки поведения животных были использованы следующие экспериментальные установки: 1. "Приподнятый крестообразный лабиринт" ("ПКЛ"). Установка состояла из 4-х расходящихся из центра рукавов. В экспериментах использовалась следующая модификация "ПКЛ": длина рукавов - 35 см; высота стенок - 20 см; центральная площадка - 10 10 см. Два противоположных рукава были затемнены и закрыты с боков и торцов стенками; два других освещены и открыты. Установка приподнималась на высоту 50 см от пола. Для облегчения подсчета числа горизонтальных перемещений на свету пол каждого из открытых рукавов, покрытый коричневой краской, был разделен белой линией на 2 равные части. Для оценки двигательной активности определяли число пересеченных линий, учитывая указанную линию, и линию, условно отделяющую выход из рукава на центральную площадку (выходы на открытые рукава лабиринта). В начале эксперимента крысу помещали в центр лабиринта, произвольно ориентируя относительно любого из открытых рукавов, и в течение 3-х минут оценивали следующие параметры: - общее время пребывания на светлых рукавах лабиринта - время на свету (с); - число стоек (число подъемов на задние лапы); - число выглядываний из темных рукавов лабиринта; - число свешиваний со светлых рукавов лабиринта; - число выходов на открытые рукава лабиринта; - число переходов через центр лабиринта; - время затаивания (freezing-реакция) (с). 2. "Норковая камера". Экспериментальная камера представляет собой ящик размером 40x40x30 см. Пол камеры имеет 16 круглых отверстий ("норок") и расчерчен на 16 квадратов. Арена камеры освещалась красным светом. При тестировании животное помещали в центр камеры и в течение 3-х минут регистрировали следующие показатели: а) горизонтальную двигательную активность (длина пробега); б) число стоек в) число обследованных норок (число погружений головы в отверстие до уровня ушей); г) время затаивания (с). 3. "Метод Порсолта". В эксперименте использовали модифицированный тест принудительного плаванья по Порсолту (Порсолт, 1977). Животное опускали в емкость, заполненную водой так, что крыса не могла касаться дна, и в течение 10 мин регистрировали следующие параметры поведения: - суммарную длительность активного плавания (крыса совершает активные плавательные движения, перемещаясь внутри емкости); - суммарную длительность пассивного плавания (крыса производит редкие одиночные движения конечностями и хвостом с целью удержания головы над поверхностью воды); - длительность иммобилизации (животное полностью неподвижно, над поверхностью воды выступает только нос).

Кинетика поступления меченного тритием PGP ([ H]PGP) в органы и ткани крыс при разных способах введения

В тесте "ПКЛ" предупреждалось значительное снижение уровня ОИР и повышение тревожности: не наблюдалось существенного снижения времени на свету, числа стоек, выглядываний и свешиваний, и увеличения времени затаивания. Все оцениваемые показатели поведенческой активности практически не отличались от соответствующих показателей нормы. В тесте "Норковой камеры" на фоне предварительного введения PGP и GP также практически все показатели поведенческой активности достоверно не отличались от нормы.

Предварительное введение пептида PG было менее эффективным. Однако по некоторым показателям интраназальное введение PG оказало более выраженное протекторное действие, чем внутрибрюшинное. Особенно это заметно в тесте "Норковая камера", где все показатели поведенческой активности остались в пределах нормы. При этом протекторные эффекты PG были сопоставимы с протекторными эффектами PGP и GP. Однако в тесте "ПКЛ" наблюдалась лишь некоторая тенденция к ослаблению стрессогенно-го влияния на поведение животных, протекторные эффекты обнаружены только в отношении числа выглядываний и числа стоек.

Сопоставление результатов внутрибрюшинного и интраназального введений показало, что эффективность протекторного действия PGP и GP при интраназальном способе введения сопоставима с таковой при внутрибрюшинном. Эффективность протекторного действия PG при интраназальном введении была даже более выраженной, хотя, как и при внутрибрюшинном введении, этот пептид действовал слабее, чем PGP и GP.

Исходя из того, что протекторные эффекты ГП при их интраназальном введении, были сопоставимы с таковыми при их внутрибрюшинном введении, во всех последующих сериях опытов пептиды вводили интраназально. Дозозависимость протекторных противострессорных эффектов глипролинов.

Целью следующей серии экспериментов было определение минимальной эффективной дозы ГП и характера изменений эффектов при возрастании дозы. Пептиды PGP, GP и PG вводили интраназально в дозах 0,37, 3,7 и 37 мкМ/кг. Контрольные животные получали эквивалентный объем физиологического раствора. Результаты экспериментов представлены в таблице 12 и на рис. Ни 15.

Как продемонстрировано в таблице и на рисунках, стресс вызывал выраженные изменения поведения крыс, приводивших к повышению тревожности и снижению ОИР. В тесте "ПКЛ" значительно уменьшилось время пребывания на свету (в 2 раза) и существенно увеличилось время затаивания (более чем в 5 раз); остальные параметры, характеризующее общий уровень поведенческой активности, также значительно уменьшились. В тесте "Норковая камера" резко снизилось число обследованных норок (в 4 раза) и число стоек (в 2 раза) и более чем в три раза возросло время затаивания.

Введение пептида PGP в дозе 0,37 мкМ/кг не оказало достоверного влияния на выраженность стрессогенных нарушений поведения. Однако если стрессорное воздействие осуществляли на фоне предварительного введения PGP в дозе 3,7 мкМ/кг, постстрессорные изменения поведения практически отсутствовали. Как в "ПКЛ", так и в "Норковой камере" практически все показатели поведенческих реакций в этом случае достоверно не отличались от нормы. При увеличении дозы пептида до 37 мкМ/кг выраженность протекторного противострессорного действия PGP несколько возрастала; достоверные отличия от дозы 3,7 мкМ/кг наблюдались в отношении числа стоек, свешиваний, выходов на открытые рукава и времени затаивания в "ПКЛ" и числа обследованных норок и стоек в "Норковой камере".

Практически аналогичная картина наблюдалась и при предварительном введении пептида GP: доза 0,37 мкМ/кг была неэффективна, а доза 3,7 мкМ/кг практически полностью предотвращала стрессогенные нарушения поведения. При использовании дозы 37 мкМ/кг выраженность протекторного противострессорного действия GP несколько возрастала, однако достоверных отличий от дозы 3,7 мкМ/кг выявлено не было.

Таким образом, при интраназальном введении минимальной эффективной дозой для PGP и GP, обеспечивающей достоверное протекторное действие, является доза 3,7 мкМ/кг.

Пептид PG во всех трех исследованных дозах оказывал более слабое и менее стабильное протекторное действие, чем PGP и GP - уменьшал постстрессорные изменения одних поведенческих показателей, но практически не влиял на другие. Кроме того, для эффекта PG не было выявлено какой-либо определенной зависимости от дозы.

Протекторные противострессорные эффекты пептидов при внутрибрюшинном введении. Стресс - неизбегаемое плавание

Ранее были получены данные о том, что глипролины, в том числе PGP, уменьшают постстрессорные нарушения микроциркуляции в брыжейке (Копылова и др., 2003, Копылова и др., 2006), препятствуют снижению кровотока в тканях желудка, вызванному введением индометацина и этанола (Самонина, Копылова и др., 2001; Самонина, Жуйкова, 2001; Жуйкова и др., 2003), обладают прямым сосудорасширяющим действием (Бакаева и др., 2003, Абрамова и др., 1997), усиливают сократительную активность лимфатических микрососудов брыжейки (Ашмарин и др., 1999), улучшают реологические свойства крови (Пасторова и др., 1998, Ляпина и др., 2006).

В развитии постстрессогенных нарушений системы микроциркуляции существенная роль принадлежит тучным клеткам, так как вызванная стрессом активация тучных клеток приводит к выделению из них ряда вызоактивных субстанций, в том числе гистамина. Непосредственная активация тучных клеток веществом 48/80 вызывала изменения в микроцир-куляторном русле брыжейки крыс, аналогичные тем, какие наблюдаются после стресса (Копылова и др., 2006), а стабилизация тучных клеток кетоти-феном существенно ослабляла посстрессорные нарушения (Копылова и др., 2006). Имеются данные о том, что активация тучных клеток при остром стрессорном воздействии приводит к увеличению проницаемости ГЭБ и его повреждению, тогда как у линии мышей, дефицитных по тучным клеткам, повышение проницаемости ГЭБ при стрессе не происходит (Esposito et. al., 2002; Theoharides et. al., 2004).

Активация тучных клеток играет важную роль в изменении состояния микроциркуляторного русла и при гипоксии. Обнаруживающиеся при гипоксии нарушения микроциркуляции происходят вследствие продукции химически активных форм кислорода, увеличения лейкоцитарно эндотелиальной адгезии, повышения проницаемости сосудов и выхода лейкоцитов в периваскулярное пространство (Steiner et. al., 2003). Стабилизатор тучных клеток кромалин, предотвращая значительную дегрануляцию тучных клеток, уменьшал количество свободных радикалов, адгезию лейкоцитов и как следствие предотвращал повышение проницаемости сосудов (Steiner et. al., 2003; Theoharides, Cochrane, 2004; Theoharides, Kalogeromitros, 2006).

В то же время в ряде работ было выявлено стабилизирующее влияние глипролинов на тучные клетки. На фоне предварительного введения глипролинов значительно уменьшалась постстрессорная активация тучных клеток, а также их активация, вызванная введением синактена (Копылова и др., 2003; Смирнова и др., 2003). Известно, что тучные клетки играют важную роль в поддержании тканевого гомеостаза при воспалении. Было показано, что пептид PGP обладает протекторным действием в отношении нарушений сократительной активности лимфатических сосудов брыжейки крыс в условиях воспалительного ответа. При этом протекторное действие PGP в значительной мере обусловлено его способностью предотвращать активацию тучных клеток (Умарова и др., в печати).

Снижение под влиянием глипролинов реактивности тучных клеток и уменьшение выброса вазоактивных субстанций в ходе развития стресс-ответа может быть одним из механизмов, ограничивающих постстрессорные нарушения микроциркуляции и развитие связанных с ними патологических состояний, в том числе и в ЦНС.

Не исключена и возможность прямого нейропротекторного действия пептидов на клеточные структуры мозга. На это указывают данные, полученные в работе Сафаровой и др. (Сафарова и др., 2002), в которой сообщается о том, что пептид PGP обладает антигипоксическими свойствами, так как в культуре тканей защищает клетки феохромоцитомы крыс PC 12 от окислительного стресса, увеличивая выживаемость клеток на 60% (Сафарова и др., 2002).

Одним из важных направлений нейропротекции является разработка и внедрение в клиническую практику препаратов с выраженными нейротрофи-ческими свойствами.

Нейротрофины, или факторы роста нервной ткани, - регуляторные белки класса цитокинов, синтезирующиеся в нейронах и клетках глии, необходимые для существования и развития нервной системы. Они передают сигналы через два типа рецепторов на поверхности клетки - Trk (рецептор тирозин киназы) и р75 (нейротрофиновый рецептор). Наиболее изученными нейро-трофинами являются фактор роста нервов (NGF), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) и нейротрофический фактор 3 (NT-3) (Сафина и др., 2007). Изучение функциональной роли нейротрофинов может внести существенный вклад в понимание причин развития целого ряда тяжелых нейродегенеративных заболеваний (ишемический инсульт, болезни Альц-геймера, Паркинсона и др.), так как важное значение в развитии процессов ишемического повреждения ткани мозга имеет недостаточность трофического обеспечения (Крыжановский, Луценко, 1995; Gwag, Canzoniero, 1999).

Естественной защитной реакцией мозга в первые минуты ишемии является синтез трофических факторов и рецепторов к ним. При быстрой и активной экспрессии генов, кодирующих нейротрофины, ишемия мозга может длительно не приводить к инфарктным изменениям. Введение нейротрофинов в гиппокампальные структуры перед введением глутамата многократно уменьшает количество погибших нейронов (Takeda, Onodera, 1992).

В последнее время появились данные, указывающие на возможность пептида PGP повышать уровень экспрессии гена BDNF и его рецептора ТгкВ в культивируемых корковых нейронах при гиперстимуляции глутаматных рецепторов, которая имеет место при ишемических/гипоксических поражениях мозга (Баязутдинова и др., 2007). Инкубация нейронов с PGP до и во время действия глутамата достоверно дозозависимо снижает количество нейронов с отсроченной Са -дезрегуляцией, вызывает двукратное увеличение мРНК генов нейротрофинов и уменьшает гибель нейронов (Пинелис и др., 2007). В работе Дмитриевой В.Г. (2007) и соавт. было изучено влияние PGP на экспрессию мРНК генов нейротрофинов BDNF, нейротрофического фактора 3 (NT-3) и их рецепторов в условиях фокальной ишемии мозга крыс. Как оказалось, пептид PGP повышает относительный уровень мРНК BDNF в очаге ишемии и достоверно увеличивает содержание транскриптов TrkB и ТгкС. В условиях экспериментальной глобальной ишемии PGP также существенно увеличивал количество транскриптов мРНК гена ТгкВ и мРНК генов NT-3 и ТгкС в лобной коре и мозжечке крыс. Эти данные свидетельствуют о возможном участии нейротрофинов и их рецепторов в обеспечении нейропротекторных свойств PGP.

Похожие диссертации на Влияние глипролинов на стрессогенные нарушения поведения крыс

Структурно-функциональные основы нарушений поведения на модели посттравматического стрессового расстройства у крысБезнин Глеб Владимирович

Нарушения поведения и структурно-функциональные изменения в мозге крыс при моделировании нейродегенерацииСтепаничев, Михаил Юрьевич

Механизмы влияния нейропептидов на адаптивное поведение крыс разного возрастаКарантыш Галина Владимировна

О механизмах регуляции полового поведения и эрекции у самцов крыс. Влияние CRF4-6 и октадеканейропептидаАндреев-Андриевский Александр Александрович

Влияние эритропоэтина на поведение и гомеостаз белых крыс в норме и при стрессогенных воздействияхАндреева, Анна Константиновна

Влияние геморрагического шока на процессы обучения и поведение крыс в постреанимационном периодеБастрикова, Наталия Александровна

Влияние периферического введения лоперамида на центральные механизмы пищевого поведения крысЧумакова, Юлия Алексеевна

Влияние опиоидных пептидов пищевого происхождения на поведение детенышей белых крысБеляева Юлия Андреевна

Влияние вазопрессина и его аналогов на поведение и вегетативные реакции белых крыс Шамакина Инна Юрьевна

Влияние дофаминергической и опиоидной систем на зависимое от матери поведение детенышей белых крысСтоволосов, Игорь Сергеевич