Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Физиологические механизмы регуляции процессов размножения у животных 10
1.2. Биологическая сущность апоптоза, механизмы апоптотической смерти клеток 21
1.3. Методы исследования апоптоза 34
2. Собственные исследования 44
2.1. Материал и методы исследований 44
2.2. Результаты исследований 51
2.2.1. Апоптоз клеток гранулезы и функциональная активность гипофи-зарно-овариальной системы у свиней в период полового созревания 51
2.2.2. Апоптоз клеток гранулезы и функциональная активность гипофи-зарно-овариальной системы у свиней в возрастном аспекте 56
2.2.3. Особенности атрезии фолликулов в яичнике свиней 60
а) Общая характеристика процесса атрезии фолликулов в яичниках свиней 60
б) Процесс атрезии фолликулов в яичниках свиней после введения гонадотропного препарата 64
2.2.4. Роль апоптоза в процессе атрезии фолликулов в яичниках сивней 67
2.2.5. Влияние экзогенных гонадотропинов на течение апоптоза в клетках гранулезы яичников свиней 74
а) Полуколичественная оценка апоптоза в клетках гранулезы фолликулов в яичниках свиней 74
б) Количественная оценка апоптоза в клетках гранулезы фолликулов в яичниках свиней 81
в) Влияние гонадотропного препарата на процесс апоптоза в клетках гранулезы в фолликулах, находящихся на разных этапах развития 85
2.2.6. Иммуногистохимическая характеристика апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней после введения сурфагона 87
3. Обсуждение результатов исследований 95
4. Выводы 105
5. Практические предложения 107
6. Список используемой литературы 108
7. Приложения 132
- Физиологические механизмы регуляции процессов размножения у животных
- Биологическая сущность апоптоза, механизмы апоптотической смерти клеток
- Материал и методы исследований
- Апоптоз клеток гранулезы и функциональная активность гипофи-зарно-овариальной системы у свиней в период полового созревания
Введение к работе
Актуальность темы. Значительный nporptcc, достигнутый в понимании молекулярной биологии клетки, позволил по-иному оценить многие процессы, протекающие в ней. Более детально изучены механизмы контроля клеточного деления, поддержания генетической стабильности, путей передачи сигналов от рецепторов в ядро. Одним из таких механизмов, участвующих в поддержании гомсостаза на тканевом и системном уровнях, является аполтоз - особый вид гибели клеток, который наблюдается как в условиях нормальной, так и патологической жизнедеятельности животных.
Исследование молекулярных механизмов запрограммированной гибели клеток стало в настоящее время одной из самых актуальных проблем биологических наук, поскольку сбои в реализации программы апоптоза в клетках лежат в основе патогенеза и прогрессии ряда заболеваний. Нарушение генетически запрограммированных процессов клеточной гибели, а именно ингибищш апоптоза может привести к неуправляемой со стороны гормональной системы организма клеточной пролиферации и развитию новообразований, возникновению аутоиммунных заболеваний.
Апоптоз стал неотъемлемым инструментом для осуществления наследственного и приобретенного, гуморального и клеточного ответа иммунной системы. Изучение процесса апоптоза открывает новые перспективы в клеточной биологии и иммунологии.
В последние годы у исследователей повысился интерес к процессам апоптоза, протекающего в репродуктивных органах самок, в частности тканях матки и яичников. Ученых интересует роль апоптоза в развитии фолликулов и их атрезии, какова его интенсивность в течение полового цикла, и какое влияние оказывают на него гонадотропные и половые гормоны. Осуществляются попытки регуляции апоптоза в фолликулах яичников с использованием различных ингибиторов (СВ. Стрижикова, 2000; L. Zhong-Hua et al., 2002; L. Chang-Куп, 2002). Однако имеющиеся в источниках литературы сведения не многочисленны, выполнены на разных видах животных и нередко носят противоречивый характер.
Цель и задачи исследований. Принимая во внимание актуальность и научно-практическую значимость указанной проблемы, целью настоящей работы являлось изучение особенностей процесса апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней и его взаимосвязь с функциональной активностью гипофизарно-овариальной системы. Исходя из этого были посгавлены следующие задачи:
1. Изучить морфологическое проявление апоптоза клеток гранулезы фолликулов и гормональную активность аденогипофиза и яичников у свиней до полового созревания.
-
Установить особенности апоптоза клеток гранулезы фолликулов и гормональной активности аденогипофиза и яичников у свиней в возрастном аспекте.
-
Выяснить роль апоптоза клеток гранулезы в процессе атрезии фолликулов в яичниках свиней.
-
Изучить влияние экзогашых гонадотропных препаратов на активность процесса апоптоза в клегках гршгулезы в фолликулах яичников свиней.
-
Получить иммуногистохимическую характеристику апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней после введения ліолиберина.
Научная новизна. На основании результатов морфологических и иммуногисто-химических исследований выяснено, что клетки гранулезы подвергаются апоптозу на разных стадиях развития фолликулов в яичниках свиней. Показано, что атрезия клеток гранулезы фолликулов тесным образом связана с функциональной активностью аденогипофиза и яичников и зависит от содержания в крови гонадотропных и половых гормонов. Впервые выявлены особенности апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней, находящихся на разных стадиях атрезии. Получены новые данные о влиянии на апоптоз клеток граігулезьі экзогенных гонадотропных препаратов и люлиберина.
Отличие результатов исследований от результатов, полученных другими авторами, заключается в том, что исследования были вьшолнены не на модулируемых системах и лабораторных животных, а на свиньях разного возраста и физиологического состояния. При этом использовались комплекс методов: гистологические, иммуногистохимические, гормональные. Это позволило изучить особенности апоптоза клеток гранулезы и гормонального статуса у неполовозрелых и половозрелых свинок, выяснить роль апоптоза в процессе атрезии фолликулов и изучить влияние экзогенных гонадотропинов и люлиберина на процесс апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследований особенностей апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней существенно дополняют представления о механизме атрезии фолликулов и интерьерных перестройках, происходящих в репродуктивной системе самок в возрастном аспекте.
Полученные данные можно использовать при разработке новых средств биологической стимуляции овуляции у свиноматок, а также в учебном процессе при изучении курсов физиологии и ветеринарного акушерства.
Реализация результатов исследований. Основные научные положения и предложения производству вошли в рекомендации «Физиологические особенности формирования половой функции у свиней» (Курск, 2007).
Основные положения выносимые на защиту:
Результаты качественных и количественных показателей проявления апоптоза клеток гранулезы на разных стадиях развития фолликулов в яичниках свиней.
Особенности процесса апоптоза клеток гранулезы у свиней в возрастном аспекте и его взаимосвязь с функциональной активностью гипофизарно-овариальной системы.
Взаимосвязь процессов апоптоза клеток гранулезы и атрезии фолликулов в яичниках свиней.
Иммуногистохимическая характеристика процесса апоптоза клеток гранулезы в фолликулах свиней после введения экзогенных гонадотропинов и люлиберина.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на международных научно-практических конференциях «Региональные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса» (Курск, 2006), «Вклад молодых ученых в реализацию приоритетного национального проекта развития агропромышленного комплекса» (Троицк, 2007), «Ветеринарная медицина - теория, практика и обучение» (Санкт-Петербург, 2007), «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (Белгород, 2007), «Проблемы и перспективы развития аграрного производства» (Смоленск, 2007), «Актуальные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса» (Курск, 2007), «Трансферт инновационных технологий в животноводстве» (Орел, 2008), «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Курск, 2008); всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений Министерства сельского хозяйства РФ в номинации «Ветеринарные науки» (Белгород, 2008), научных конференциях профессорско-преподавательского состава Курской ГСХА имени И.И. Иванова (Курск, 2005-2008);
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 134 страницах компьютерного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы. Список литературы включает 238 источников, в том числе 167 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 26 рисунками. По результатам исследований опубликовано 10 научных статей, в том числе 1 в издании, рекомендованном ВАК РФ.
Физиологические механизмы регуляции процессов размножения у животных
Функция размножения у животных обеспечивается деятельностью многих органов PI систем, которые связаны воедино нейрогуморальной регу-ляторной системой. Она включает в себя так называемую триаду: гипоталамус, гипофиз и гонады. Регуляторная триада «работает» в автономном режиме, что не означает ее полную изолированность от других регуляторных систем и от высших отделов головного мозга. Это объясняется тем, что репродуктивная система подобно дыхательной, пищеварительной, сердечнососудистой и другим системам организма является функциональной.
Впервые теорию о функциональных системах организма сформулировал П.А. Анохин. По его представлению функциональная система представляет собой совокупность органов и тканей, принадлежащих и различным анатомо-физиологическим образованиям, но обеспечивающих определенную форму приспособительной деятельности организма (П.А. Анохин, 1975).
Если функциональная активность других жизненно важных систем организма направлена на поддержание гомеостаза, необходимого для существования индивидуума, то репродуктивная система обеспечивает воспроизводство, т.е. дальнейшее существование вида.
Репродуктивная система у самок животных организована по иерархическому принципу, в ней выделяют пять уровней, каждый из которых регулируется вышележащими структурами по механизму обратной связи (рис.1).
Первым уровнем являются «ткани-мишени» - точки приложения действия гормонов. К ним относятся половые органы и молочные железы. Клетки этих органов содержат рецепторы к половым гормонам. При этом цито-золрецепторы - рецепторы цитоплазмы," обладают строгой специфичностыо к эстрадиолу, прогестерону, тестостерону, а ядерные рецепторы могут быть акцепторами таких молекул, как инсулин, глюкагон, аминопептиды (А.Н. Смирнов и др., 1975; N.R. Adams et al., 1986; В.Б. Розен и др., 1985). Рецепторы к половым гормонам обнаружены во всех структурах репродуктивной системы, а также центральной нервной системе, коже, жировой и костной ткани, молочной железе (А.Н. Смирнов и др., 1975; 1976; Н. Д. Фанченко и др., 1978; М. Slomczynska et al., 2001; W. Van den Broeck et al., 2002; S. Sukjumelong et al., 2003).
Установлено, что свободная молекула стероидного гормона захватывается специфическим цитозолрецептором белковой природы, и образующийся комплекс транслоцируется в ядро клетки. В ядре возникает новый комплекс с ядерным белковым рецептором, этот комплекс связывается с хроматином, регулирующим транскрипцию мРНК, участвующим в синтезе специфического тканевого белка (В.Б. Розен и др., 1981; S. Masood et al., 1992).
Содержание рецептора эстрадиола в гипофизе определяет чувствительность его клеток к эстрогенам, т.е. способность отвечать торможением или стимуляцией выделения ФСГ и ЛГ (В.Н. Бабичев и др., 1990; R.N. Clayton et al., 1983).
Рецепторы к гонадотропным гормонам обнаружены в яичниках, точнее в гранулезных клетках зреющего фолликула. Они определяют чувствительность яичников к гонадотропинам и регулируют соответственно процессы фолликулогенеза и стероидогенеза (Н.М. Schoeneman et al., 1985; Н.А. Garverick et al., 1985; К. Derecka et al., 1999).
Содержание стероидных рецепторов в эндометрии варьирует в зависимости от возраста животного и фазы полового цикла.
По данным О.Б. Сеина (1996), концентрация рецепторных белков к эс-традиолу-17р и прогестерону в эндометрии свинок крупной белой породы была наименьшей у животных 6-месячного возраста и составляла для эстрадиола- 17Р - 2042,0±946,0 фмоль/мг ДНК, а для прогестерона - 1748,7 ±228,5 фмоль/мг ДНК. Однако у свинок-аналогов, но половозрелых содержание ре 13 цепторов было больше и соответсвенно составляло 3343,3±23232 и 208б,7±224,3 фмоль/мг ДІЖ.
О том, что концентрация рецепторов эстрадиола и прогестерона может изменяться в репродуктивных органах самок в связи с половой цикличностью в своих работах указывают P. Stanchev et al., 1984; М. Koziorowski et al., 1985; I. Zaoral et al., 1987; Y. Thilander et al., 1990; A. Meikle et al., 2001; W. Van den Broeck et al., 2002 и другие исследователи.
В тканях молочной железы содержатся рецепторы к эстрадиолу прогестерону, окситоцину, пролактину, которые в конечном итоге регулируют ее способность к секреции молока (А. Коун, 1988; М. Yamoto et al, 1986; А. Okano et al., 1996; R. Ivell et al., 2000).
Второй уровень репродуктивной системы - яичники. В них происходят сложные процессы синтеза стероидов и развития фолликулов. Процесс фол-ликулогенеза происходит в яичнике непрерывно. Он начинается в постна-тальном периоде и продолжается в течение репродуктивного цикла самки. При этом основная масса фолликулов претерпевает атретические изменения, и только небольшая их часть проходит полный цикл развития от приморди-ального до преовуляторного фолликула, которые овулируют и затем превращаются в желтое тело (О.В. Волкова и др., 1983; J. Zitny et al., 2004; G.A. Presicce et al., 2005).
До настоящего времени еще не выяснены факторы, вызывающие атре-зию фолликулов, а также причины, по которым происходит отбор и развитие доминантных фолликулов из огромного числа примордиальных.
Известно, что в доминантных фолликулах к моменту овуляции происходит значительное увеличение объема фолликулярной жидкости и содержания в ней эстрадиола и ФСГ. Подъем уровня эстрадиола стимулирует выброс ЛГ и овуляцию. Ко времени овуляции в ооците возобновляется процесс мей-оза (Н.М. Ткаченко, 1978; Н.А. Fahmi et al., 1985; A.R. Peters et al., 1985; A. AH et al., 2000; S. Kamimura et al., 2004).
Процесс овуляции представляет собой разрыв базальной мембраны до минантного фолликула и кровотечение из разрушенных капилляров, окружающих текаклетки. Изменения в стенке преовуляторного фолликула, обеспечивающие ее истончение и разрыв, происходит под влиянием фермента коллагеназы. Определенную роль также играют простагландины, протеоли-тические ферменты (образующиеся в гранулезных клетках), окситоцин и релаксин (Д.Т. Брейд 1987; A.I. Zeleznik, 1993; G.A. Presicce et al., 2005).
После выброса яйцеклетки в полость фолликула быстро врастают формирующиеся капилляры, а гранулезные клетки подвергаются лютеинизации. В них увеличивается объем цитоплазмы и образуются липидные включения. Эти измеения приводят к образованию желтого тела, клетки которого секре-тируют прогестерон (Э.Н. Грига, 2002; О.П. Фомина, 2001; H.N.; Mihm et al., 2002). Полноценное желтое тело развивается только в тех случаях, когда в преовуляторном фолликуле образуется адекватное число гранулезных клеток с высоким содержанием рецепторов ЛГ. Увеличение размеров желтого тела после овуляции происходит в основном за счет увеличения размеров гранулезных клеток, в то время как- число их не увеличивается из-за отсутствия митозов.
Механизмы регрессии жёлтого тела изучены недостаточно, известно, что выраженным лютеолитическим действием обладают простагландины (В.В. Корхов, 1994; L. Dusza et al., 1988; В. Fisch et al., 1994).
Биологическая сущность апоптоза, механизмы апоптотической смерти клеток
Апоптоз, или запрограммированная гибель клетки - генетически детерминированный и регулируемый процесс клеточной смерти, заключающийся в специфической деградации ядерного материала, дисфункции митохондрий, изменении физико-химических свойств мембран, реализация которого осуществляется при участии специфических протеаз и нуклеаз (А.В. Светлаков и др., 2002).
Впервые об апоптозе, как о биологическом явлении, заговорили после того, как в 1972 году в журнале «British Journal of Cancer» была опубликована статья J.F.R.KeiT, A.H.Wyllie и A.R.Currie «Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics». В этой работе авторы представили морфологические доказательства существования отличающегося от некроза особого вида гибели клеток, которую они назвали «апоптоз». С помощью электронной микроскопии авторы показали, что в эмбриональной мезенхиме, надпочечниках, печени животных, различных новообразованиях человека и животных при разных условиях наблюдаются стереотипные по ультраструктуре смертельные повреждения одиночных клеток. Авторы сообщили, что структурные изменения клеток при апоптозе проходят две стадии: первая - образование апоптозных тел, вторая - их фагоцитоз и разрушение другими клетками. Авторы статьи высказали суждение о распространенности апоптоза и его биологической значимости. Апоптоз - это регулируемая гибель клеток, одна из сторон клеточного гомеостаза (вторая - деление клеток) в различных тканях млекопитающих при многих условиях в нормальном онтогенезе, тератогенезе, канцерогенезе, при терапевтически обусловленной регрессии новообразований, атрофии и инволюции тканей и органов. J.F.R.Kerr и соавт. подчеркнули, что апоптоз является активным и контролируемым процессом, хотя о факторах и механизмах апоптоза почти ничего не было известно.
Однако, J.F.R.Kerr и соавторов нельзя считать «первооткрывателями» апоптоза, как биологического явления. Еще в 1857 году Р. Вирхов в сформулированном законе «ommis cellulae cellulae», где организм представлялся как сумма клеток, указывал на гибель клеток, как биологическое явление. В 1971 году Р. Вирхов уже более детально обсуждает факт гибели клеток в своем классическом труде « Целлюлярная патология как учение о физиологической и патологической гистологии». Поскольку в те годы еще не использовалась гистологическая окраска препаратов, то гибель клеток рассматривалась Р. Вирховым как дегенерация, омертвение, некроз (И.В. Давыдовский, 1956).
С появлением возможности окраски гистосрезов вопрос изучения гибели клеток перешел на другой, более высокий уровень.
Так, В.Флемминг в начале 1879 года описал деление клеток в разных тканях саламандры и ее личинок, назвав ее митозом, а затем в 1885, изучая фолликулы яичников млекопитающих, наблюдал морфологическую картину гибели клетки, которая в настоящее время интерпретируется как апоптоз. Это явление В.Флемминг обозначил термином «хроматолиз», поскольку в поврежденной клетке наблюдалось исчезновение ядра. Годом позже хроматолиз был зафиксирован в лактирующей молочной железе. В 1914 году Л. Грепер опубликовал статью «Новый взгляд на физиологическую элиминацию клеток», в которой высказал суждение о том, что в организме, особенно в эпителиальной ткани, должен существовать механизм, уравновешивающий митоз, и этим механизмом удаления клеток является хроматолиз, по В.Флеммингу. При этом остатки клетки либо поглощаются окружающими эпителиальными клетками, либо слущиваются в просвет органа. Термин «хроматолиз» позднее был адаптирован нейрогистологами для обозначения другого явления: уменьшения или исчезновения базофильного вещества цитоплазмы нейронов при патологических процессах в них, вызванных интоксикацией, ишемией, повреждением аксона. Однако оригинальное содержание термина сохранилось в эмбриологии: эмбриологи рассматривали этот вид гибели как физиологический в качестве морфогенетического механизма при развитии организма (Е.Ф. Лушников, 2001).
С помощью морфологических методов (световая и электронная микроскопия) было установлено (J.F.R. Kerr et al., 1972; J.F.R. Kerr et al., 1980; A.H. Wyllie, 1980), что апоптозу, как правило, подвергаются рассеянные одиночные клетки. На светооптическом уровне апоптоз можно обнаружить как в обычных гистологических препаратах, так и в полутонких срезах. Несомненно, что гистологические препараты должны быть достаточно тонкими (4-5 мкм), чтобы можно было выявить характерные признаки апоптоза, отличающие его от некроза. В гистологических препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, при малом увеличении микроскопа такими признаками являются уплотнение и уменьшение размера клетки, отграничение ее от окружающей ткани светлым ободком.
Более детальную характеристику можно получить при большом увеличении, при котором заметны особенности строения ядра и цитоплазмы. В 1987г. A.H. Wyllie сформулировал четыре основных признака апоптоза: 1. Уменьшение объема апоптотирующей клетки; 2. Конденсация и фрагментация хроматина на ранних стадиях апоптоза с формированием апоптотических телец; 3. Изменение мембраны апоптотирующей клетки, приводящее к распознаванию ее фагоцитами; 4. Сопряженность апоптоза с активным белковым синтезом.
Указанные изменения служат самым ранним проявлением апоптоза, предшествующим процессам деградации (А.А. Демин и др., 1983). Позднее в ядерной мембране образуются инвагинации, и хроматиновые фрагменты от-шнуровываются от ядра. Такие фрагменты, окруженные мембраной, называют апоптотическими тельцами. В цитоплазме происходит конденсация и сморщивание гранул без их разрушения, расширение эндоплазматического ретикулума. Для апоптоза характерна потеря клеточной мембраной микроворсинок и нормальной складчатости, отделение клетки от субстрата, формирование на ее поверхности пузырей (А.Ю. Барышников и др., 1994).
Учитывая морфологические сходства апоптоза и некроза, необходимо остановиться на краткой электронно-микроскопической характеристике некроза и особенностях, позволяющих отличить последний от апоптоза.
Ранние изменения в некротизирующихся клетках происходят в первую очередь из-за нарушения функции мембранных ионных каналов, что приводит к повреждению клеточных мембран и снижению синтеза АТФ. Нарушение целости мембран приводит к высвобождению лизосомальных ферментов, которые усиливают дезинтеграцию и кариолизис, что сопровождается воспалением с образованием рубца (B.V. Harmon et al., 1990). Некроз связан с полным метаболическим коллапсом, который приводит к отеку клетки, ранней потере целостности ее мембраны, повреждению митохондрий и других орга-нелл, что в конечном счете заканчивается лизисом остатков клетки (G. Majno et al., 1995). Некроз клетки становится причиной повреждения и воспаления окружающих клеток и виден на срезе тканей, он не связан с потреблением энергии и синтезом белка (W. Lieberthal et al., 1996).
Материал и методы исследований
Работа выполнена в период с 2005 по 2008 гг. на базе межкафедральной научно-исследовательской лаборатории факультета ветеринарной медицины и учебно-опытного хозяйства «Знаменское» Курской государственной сельскохозяйственной академии имени профессора И.И. Иванова; лаборатории Курского областного бюро патологической анатомии.
Объектом исследований являлись ремонтные свинки крупной белой породы. Животных подбирали по принципу аналогов с учетом происхождения, массы тела, возраста и развития.
Материалом для исследований служили яичники, которые получали от свинок после убоя или овариоэктомии в условиях хозяйства или мясокомбината.
Экспериментальная часть работы состояла из трех серий опытов, которые выполнялись по схеме, представленной на рисунке 2.
В первой серии опытов изучали особенности апоптоза в клетках грану-лезы фолликулов в яичниках свиней в возрастном аспекте. С этой целью проводили отбор яичников у неполовозрелых и половозрелых свинок 5-месячного возраста, а также у 7-, 9-, 12- и 24-месячного возраста. У неполовозрелых свиней яичники получали во время стадии уравновешивания полового цикла.
У всех подопытных животных брали кровь, в которой определяли общие гематологические показатели (СОЭ, гематокрит, содержание эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина), содержание эстрадиола-17(3 и прогестерона.
Вторая серия опытов была посвящена изучению процессов апоптоза и атрезии фолликулов в яичниках свиней. Данные процессы исследовали у свинок 5-месячного возраста.
В третьей серии опытов изучали влияние экзогенных гонадотропи-нов и люлиберина на течение апоптоза в клетках гранулеза фолликулов в яичниках свиней.
В качестве гонадотропинов был выбран препарат «Фоллимаг». Опыты проводили на свинках 9-месячного возраста, из которых было сформировано 5 групп. В первую группу входили контрольные животные; во 2 группу входили свинки, у которых отбор яичников проводили на первые сутки после введения препарата; в 3 группу - на третьи сутки; в 4 группу - на пятые сутки; в 5 группу - на седьмые сутки после введения препарата. Препарат вводили внутримышечно в дозе 1000 ИЕ/гол.
В качестве люлиберина был выбран препарата «Сурфагон». Для выяснения его влияния на течение апоптоза в клетках гранулезы было сформировано четыре группы свинок 6-месячного возраста. Свинки 1, 2 и 3 группы являлись опытными, им вводили внутримышечно и однократно сурфагон в дозе 50 мкг/гол. Свинки 4 группы являлись контрольными, им вводили стерильный физиологический раствор. У свинок всех групп проводили овари-эктомию с целью отбора яичников для исследования.
У свинок 1 опытной группы яичники отбирали через 6 часов после введения препарата, у свинок 2 и 3 группы - соответственно через 24 и 48 часов. У контрольных животных овариэктомию проводили через 24 часа после введения физиологического раствора.
Во всех случаях яичники после извлечения подвергали визуальному исследованию, а также определяли массу, объем, подсчитывали фолликулы и желтые тела и устанавливали их размер.
В ходе выполнения диссертационной работы использовали комплекс методов. Получение материала для анализа. Яичники у свиней отбирали после овариоэктомии или убоя. Овариоэктомию проводили после предварительной голодной диеты и обработки операционного поля. Для обезболивания применяли инфильтрационную анестезию 0,5% раствором новокаина после премедикации 2,5% раствором аминазина (1мл/25кг). Оперативный доступ к яичникам осуществляли с правой стороны в области подвздоха. Место разреза определяли на 2-Зсм ниже маклока в подвздошно-паховом треугольнике. После рассечения кожи, подкожной клетчатки, разъединения тупым способом мышц перфорировали брюшину. Затем указательным и средним пальцами находили рог матки и извлекали его наружу. Передвигаясь по рогу, обнаруживали яичник. На связку и бахромку яичника накладывали гемо-статический пинцет. Под каждый пинцет подводили лигатуру и перевязывали связки яичников, а затем над пинцетом каждый яичник вместе с бахромкой отрезали скальпелем. Рога матки вправляли в брюшную полость, вводили туда антибиотик и на брюшину накладывали стежки узловатого шва. Мышцы не зашивали, а кожную рану закрывали 3-4 стежками узловатого шва. Края раны смазывали раствором йода, а раневую поверхность присыпали антибиотиком. Швы снимали на 7-10 день.
Масса, линейные и объемные параметры. Их определяли при оценке состояния яичников. Массу устанавливали с использованием электронных весов. Диаметр яичников и фолликулов измеряли штангенциркулем. Объем определяли путем погружения в мерный сосуд с водой.
Гистологические исследования. Изготовление гистологических препаратов осуществляли по общепринятой схеме: фиксация материала, обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации и ксилоле, заливка в парафин, приготовление парафиновых срезов на санном микротоме, окрашивание препаратов (Д.С. Саркисов, 1996).
Для фиксации материала применяли 10% нейтральный формалин, жидкость Штиве и Карнуа. Окрашивали гистопрепараты гематоксилин-эозином. Морфометрическую оценку изучаемых объектов осуществляли с использованием винтового окуляр-микрометра, который предварительно калибровали посредством объектив-микрометра по общепринятой методике.
Иммуно гистохимические исследования. Иммуногистохимические исследования проводили стрептавидин-биотиновым иммунопероксидазным методом на парафиновых срезах ткани яичников с использованием моно-клональных мышиных антител к PCNA - Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen, Clone bcl-2 (1:300, Dako); Clone Ki-67 (1:25, Dako); p53, DO-7 (1:25, Dako). Демаскировку антигена проводили в цитратном буфере (рН=6,0) в бытовой СВЧ-печи «SAMSUNG -M1774R» с постоянным объемом раствора для восстановления антигена (TRSarget Retrieval Solution), постоянным временем нагревания и с обязательным учетом режима мощности (7 минут при 850 Вт; 8 минут при 650 Вт). Для приготовления препаратов использовали стекла, покрытые силаном (DAKO S 2024).
Апоптоз клеток гранулезы и функциональная активность гипофи-зарно-овариальной системы у свиней в период полового созревания
Анализ гистологических препаратов фолликулов в яичниках у 5-месячных неполовозрелых и половозрелых свинок показал, что клетки гранулезы, подверженные апоптозу, отличаются от жизнеспособных клеток. Это связано с тем, что у апоптозных клеток уплотняется цитоплазма, происходит фрагментация и конденсация хроматина в ядре. Микроскопия гистологических препаратов при малом увеличении позволила обнаружить позднюю фазу апоптоза клеток гранулезы, когда в клетках происходят деструктивные изменения. При этом существенных различий в течении апоптоза в клетках гранулезы у половозрелых и неполовозрелых свиней выявлено не было. Как у первых, так и у вторых процесс апоптоза осуществлялся по одному «сценарию» и сопровождался характерными признаками: уменьшение клетки подверженной апоптозу в размере, отграничение ее от окружающей ткани светлым ободком и образование апоптозных телец (рис.4а).
Особый интерес представляют апоптозные тельца, которые состоят из остатков цитоплазмы и фрагментов ядра клетки. В гистологических препаратах апоптозные тельца преимущественно выглядели в виде округлых образований, четко отграниченных от окружающих тканей участками просветления (рис.4б). Применение большого увеличения позволило выявить в апоптозных клетках изменения в ядре и цитоплазме. Было установлено, что ядерный хроматин в этих клетках конденсируется в виде отдельных крупных глыбок, которые локализуются преимущественно около ядерной мембраны (рис.4в). После разрушения ядерной мембраны хроматин выходит в цитоплазму и равномерно располагается в ней. Вследствие уплотнения цитоплазмы в апоптозных клетках она окрашивается более интенсивно по сравнению с окружающими клетками (рис.4г).
Апоптозные тельца в гистопрепаратах встречаются как в одиночном состоянии, так в виде групп. При этом в одних тельцах встречаются как ядерные, так и цитоплазматические структуры, а другие тельца состоят только из фрагментов цитоплазмы. При микроскопии препаратов обнаруживались чаще единичные клетки с признаками апоптоза, наличие групп апоптозных клеток свидетельствовало о изменениях в зернистом слое. Напротив, апоптотические тельца чаще встречались группами. Количество, размер, а также их место расположения были различными. Апоптотические тельца обнаруживались в межклеточном пространстве, в фолликулярной жидкости, а некоторые в соединительно-тканном слое.
В процессе исследований гистопрепаратов яичников свиней нам приходилось наблюдать, наряду с апоптозом клеток гранулезы, также апоптоз клеток теки. Однако процесс апоптоза в клетках теки, был не значительно выражен. Так, если в клетках внутренней и наружной теки встречались единичные клетки с признаками апоптоза, то в гранулезе обнаруживались сравнительно большое количество апоптотических клеток. В определенной степени это указывает на первичность процесса апоптоза в клетках гранулезы по сравнению с текальными клетками.
Несмотря на однотипность изменений в гранулезе и в общем «механизме» апоптоза у неполовозрелых и половозрелых свиней, нам удалось выявить, что интенсивность процесса апоптоза у первых была более высокой, чем у вторых. О чем свидетельствуют результаты определения индекса апоптоза: у неполовозрелых свинок (1,88±0,3 - 2,10±0,44) он был выше по сравнению с половозрелыми (1,65±0,5 - 1,78±0,85).
В свою очередь было установлено, что интенсивность апоптоза в клетках гранулезы фолликулов свиней тесным образом связана с функциональной активностью аденогипофиза и яичников. Как следует из рисунков 5, 6, у свинок с относительно низким содержанием в крови гонадотропных гормонов и эстрадиола -173 индекс апоптоза был выше, чем у животных с более высоким содержанием этих гормонов.
Исследование процесса апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней в 5, 7, 9, 12 и 24 месяцев показало, что он был практически однотипным и не имел существенных различий в возрастном аспекте. В большинстве случаев в гистопрепаратах встречались одиночные клетки с признаками апоптоза и редко обнаруживались группы апоптозных клеток. При этом в погибающих клетках гранулезы наблюдалась конденсация хроматина в виде крупных глыбок. Цитоплазма клеток была уплотнена и более эозинофиль-на по сравнению с цитоплазмой окружающих клеток, в ней происходило сморщивание гранул без их разрушения (рис.7а). Конденсированный хроматин в одних случаях занимал всю поверхность среза такого фрагмента, в других располагался в виде «полулуния» (рис.7б). Апоптотические изменения наблюдались как в одиночных, так и в целой группе клеток. Отмечалась потеря межклеточных контактов, при этом клетка выходила в фолликулярную жидкость (рис.7в). В более поздних стадиях наблюдали распад клетки на группу апоптотических телец, которые состояли преимущественно из остатков цитоплазмы (рис.7г), другие же содержали окруженные плазматической мембраной фрагменты ядра (рис.8а). Апоптотические тельца имели сферическую, овальную или неправильную форму. Количество и размер, а также их место расположения варьировали. При этом апоптотическая клеточная гибель не сопровождалась явлениями воспаления.
