Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы. Современные методы оценки адаптивных возможностей кардиореспираторнои системы в условиях интенсивных физических нагрузок 13
1.1. Физическая работоспособность - интегральный показатель адаптивных возможностей кардиореспираторнои системы 13
1.2. Гены-кандидаты и их полиморфные варианты, вовлеченные в регуляцию работы сердечно-сосудистой системы 18
Глава II. Организация и методы исследования 47
2.1 Контингент обследованных лиц 47
2.2. Методы исследования 49
Глава III. Результаты исследований. Характеристика адаптивных возможностей кардиореспираторнои системы спортсменов по данным Р\УС,7оиМПК 57
Глава IV. Распределение полиморфных вариантов генов AGT (Met235Thr), AGTR1(A1166C), АСЕ (I/D), MTHFR (Ala222Val), IL-17A (G197A) в обследованных группах 62
4.1 Анализ частот аллелей Met235/235Thr и генотипов гена AGT 62
4.2. Распределение полиморфизмов гена AGTR1 70
4.3. Исследование инсерционо-делеционного полиморфизма гена АСЕ 78
4.4. Ala222/222Val полиморфизмы reHaMTHFR 85
4.5. Частоты аллелей и генотипов гена IL-17A 88
Глава V. Роль Leu28Pro полиморфизмов гена АРОЕ в регуляции липидного обмена и работы сердечно-сосудистой системы 93
Глава VI. Ассоциация PWC170 и МПК квалифицированных спортсменов с генотипами AGT(Met235Thr), AGTR1(A1166C), АСЕ (I/D), MTHFR(Ala222Val) 100
Обсуждение 108
Выводы: 123
Практические рекомендации: 124
Список литературы 1
- Гены-кандидаты и их полиморфные варианты, вовлеченные в регуляцию работы сердечно-сосудистой системы
- Методы исследования
- Исследование инсерционо-делеционного полиморфизма гена АСЕ
- Ассоциация PWC170 и МПК квалифицированных спортсменов с генотипами AGT(Met235Thr), AGTR1(A1166C), АСЕ (I/D), MTHFR(Ala222Val)
Введение к работе
Актуальность исследования. Современный спорт высших достижений требует функционирования всех систем организма в зоне абсолютных физиологических пределов (А.В. Болотов, 2004; Н.И. Волков, 2005; Р.Г. Гаибов, 2005; А.В. Шаханова, 2008; А.А Кузьмин, 2011; С.С. Гречишкина, 2012; Т.Г. Петрова, 2012). Одной из важнейших функциональных систем организма, лимитирующей и определяющей физическую работоспособность, а так же интенсивность и длительность реакций целостного организма на спортивную физическую нагрузку, является кардиореспираторная система. Центральным вопросом физиологии современного спорта является адаптация кардиореспираторной системы к возрастающим физическим нагрузкам (Н.И. Иванова, 2003; Г.М. Маслова с соавт., 2009; В.Д. Сонькин с соавт., 2009; А.А. Кузьмин, 2011; С.С. Гречишкина, 2012; J.P. Boineau, 2007; B. Gutnik, M. Henneberg, 2009; N. Wolanski, 2009). Резервные возможности кардиореспираторной системы определяют функциональный и адаптационный потенциал организма, уровень его физической работоспособности в условиях тренировочной и соревновательной деятельности (А.В. Шаханова, 1998-2000; В.М. Шумихина, 2005; О.А. Бутова с соавт., 2006; Н.И. Шлык, 2010). Высокая физическая работоспособность отражает потенциальные возможности достижения высоких результатов в избранном виде спорта.
Исследования механизмов адаптации кардиореспираторной системы спортсменов к физическим нагрузкам, основанные на системном многоуровневом подходе с использованием современных информативных наукоемких технологий, позволяют определять не только на функциональном, но и генетическом уровнях потенциальные возможности организма к различным видам спортивной деятельности, а также выявить степень сопряженности физической работоспособности с молекулярно-генетическими детерминантами развития адаптивных возможностей кардиореспираторной системы квалифицированных спортсменов (В.А. Рогозкин и др., 2000-2005; И.И. Ахметов, 2006-2009; S. Roth et al., 2007; M.N. Weedon, T.M. Frayling, 2008; M.S. Bray et al., 2009).
В процессе реализации международной программы «Геном человека» идентифицированы молекулярно-генетические детерминанты, ассоциированные с формированием и развитием адаптационных возможностей человека при выполнении интенсивных физических нагрузок (Т. Rankinen et al., 2006, M.S. Bray et al., 2009). В работах отечественных и зарубежных исследователей отмечена корреляция некоторых генов с физической деятельностью. (В.А. Спицын, 2004; В.А. Рогозкин и др., 2000-2005; И.И. Ахметов, 2006-2009; Е.А. Бондарева, 2011; Т. Rankinen et al., 2000-2006; М. Collins et al., 2009). Одним из перспективных направлений современных исследований является изучение ассоциации полиморфизмов генов ренин-ангиотензиновой системы, фолатного цикла с адаптивными возможностями спортсменов в условиях интенсивных нагрузок (И.И. Ахметов, 2011; H. Montgomery et al., 1998; I.V. Nazarov et al., 2001; M.N. Weedon, T.M. Frayling, 2008).
Вместе с тем, проведенные исследования фрагментарны, не обеспечивают целостного представления о механизмах развития функциональных возможностей и физической работоспособности организма, в реализации которых важная роль принадлежит регуляции экспрессии генов посредством широкого спектра мутаций (SNP, аллельных и инсерционно-делеционных вариантов генов). Необходимо учитывать варьирование фенотипических проявлений одних и тех же генетических систем в разных этнических популяциях (В.П. Пузырев, 2007). Это обуславливает необходимость региональных исследований по выявлению информативных молекулярно-генетических детерминант, ассоциированных с развитием и срывом механизмов адаптации кардиореспираторной системы у квалифицированных спортсменов в условиях спортивной гиперкинезии. Поэтому, в последние годы актуальным направлением исследований является также поиск маркеров донозологической диагностики наследственной предрасположенности к развитию профессиональных патологий у квалифицированных спортсменов с использованием современных молекулярно-генетических методов (Е.В. Линде, 2006-2007; Е.А. Дегтярева, 2006; G.G. Neri-Serneri et al., 2001; S.G. Myerson et al., 2001; A. Pellicia et al., 2001-2006). В России исследования по оценке прогностической значимости молекулярно-генетических предикторов немногочисленны и во многом противоречивы.
Установление спектра генов, вовлеченных в регуляцию кардиореспираторной системы и развитие физической работоспособности, актуально для современной физиологии спорта и будет способствовать разработке критериев оценки потенциальных функциональных возможностей организма человека, особенно при выполнении физических нагрузок скоростно-силового характера, что позволит существенно повысить эффективность отбора в спорте высоких достижений, а также снизить риск срыва механизмов адаптации сердечно-сосудистой системы.
Цель диссертационного исследования: определить адаптивные возможности развития кардиореспираторной системы квалифицированных спортсменов с учетом молекулярно-генетические детерминант.
Задачи:
-
Исследовать влияние регулярных спортивных физических нагрузок на уровень общей работоспособности (PWC170) и общей выносливости (МПК) у квалифицированных футболистов, баскетболистов и легкоатлетов Республики Адыгея.
-
Проанализировать характер взаимосвязей полиморфизмов генов, участвующих в регуляции: работы сердечно-сосудистой системы ACE (I/D), AGT (Met235Thr), AGTR1 (A1166C), липидного обмена АРОЕ (Leu28Pro), фолатного цикла MTHFR (Ala222Val) с показателями PWC170 и МПК в обследованных группах. Идентифицировать спектр информативных молекулярно-генетических маркеров адаптации кардиореспираторной системы квалифицированных спортсменов.
-
Определить роль полиморфизмов гена аполипопротеина Е (АРОЕ) в регуляции липидного обмена и функционировании сердечно-сосудистой системы в условиях интенсивных физических нагрузок.
-
Выявить полиморфизмы генов, сопряженные с повышенным риском развития функциональных отклонений в работе сердечно-сосудистой системы у квалифицированных спортсменов.
Теоретико-методологическая основа исследования.
Методологической основой исследования является системный комплексный подход, позволяющий использовать теоретические и эмпирические положения:
- об иерархии механизмов развития индивидуальной адаптации в повышении жизнедеятельности и биологической надежности (Э.М. Казин и др., 2000; Н.А. Агаджанян и др., 1994-2012; Р.М. Баевский, 1979-2005);
- об эффективности использования генетических подходов для анализа физиологических функций организма (В.А. Рогозкин, 2000-2005; И.И. Ахметов, 2006-2009);
- о доминирующей роли наследственности в развитии потенциальных возможностей спортсменов и влияние среды на степень реализации этих возможностей (В.А. Рогозкин, 2000-2005; C. Bouchard et al., 1997; Т. Rankinen et al., 2000-2006; М. Collins et al., 2009).
Теоретическую основу исследования составляют:
- научные идеи о доминирующей роли сердечно-сосудистой системы в процессах адаптации (В.В. Парин, 1962-1967; А.Г. Дембо, 1954-1990; А.А. Виру, 1974-1990; В.Л. Карпман, 1964-1993; Р.М. Баевский, 1980-2005; Н.А. Агаджанян и др., 1994-2003);
- фундаментальные исследования генетических процессов, определяющих динамику и закономерности функционирования организма и отдельных функциональных систем в различных условиях жизнедеятельности (C. Bouchard et al., 1997; Т. Rankinen et al., 2006; М. Collins et al., 2009; M.S. Bray et al., 2009);
- международные исследования по изучению ассоциации полиморфизмов генов с морфофункциональными особенностями людей в ходе онтогенеза и возможностью донозологической диагностики наследственных и мультифакторных заболеваний (Health, Risk Factors, Exercise Training and Genetics, 1995; Human Gene Map for Performance and Health-Related Fitness Phenotypes, 1997-2006; The HuGeNET, 2002-2013);
- концептуальные положения теории подготовки квалифицированных спортсменов: футболистов (А.А. Сучилин 1997; З.Г. Орджоникидзе, В.И. Павлов, 2008), баскетболистов (Ю.М. Портнова, 1997; В.М. Корягин, 1998) и легкоатлетов (В.В. Захарова, 2003; О.Ю. Жарова, 2000; Ф.А. Иорданская, 2006).
Научная новизна работы. На основе комплексного подхода с использованием физиологических и современных молекулярно-генетических методов исследования адаптивных возможностей кардиореспираторной системы впервые получены новые экспериментальные данные:
- о роли полиморфизмов генов ACE, AGT, AGTR1, MTHFR, IL-17A в развитии адаптивных возможностей кардиореспираторной системы;
- характере тесных корреляционных взаимодействий у баскетболистов Ala222Val генотипа MTHFR с общей работоспособностью, а гена АСЕ с аэробными возможностями и их роли в развитии функциональных и адаптивных возможностей организма;
- по ассоциации 28Рro полиморфизма гена АРОЕ с наследственной предрасположенностью к нарушению липидного обмена и атерогенезу;
- по полиморфизмам генов AGT, AGTR1, MTHFR, IL-17A, повышающих риск развития функциональных отклонений в работе сердечно-сосудистой системы у жителей Республики Адыгея.
Положения, выносимые на защиту:
-
Профессиональные занятия баскетболом оказывают существенное влияние на организацию энергетического и вегетативного обеспечения мышечной деятельности, увеличение общей работоспособности и аэробных возможностей организма квалифицированных баскетболистов, о чем свидетельствуют более высокие показатели PWC170 и МПК в сравнении с квалифицированными футболистами и легкоатлетами.
-
Полиморфизмы генов АСЕ и MTHFR ассоциированы с развитием функциональных и адаптивных возможностей кардиореспираторной системы квалифицированных спортсменов Республики Адыгея.
-
У квалифицированных спортсменов Республики Адыгея доминирует DD генотип АСЕ, ассоциированный с развитием функциональных и адаптивных возможностей кардиореспираторной системы, что в условиях интенсивных физических нагрузок является основным фактором «отбора» профессиональных спортсменов.
-
Аллельные варианты генов AGT (235T), AGTR1 (1166C), IL-17A (G197) ассоциированы с нарушением механизмов адаптации сердечно-сосудистой системы квалифицированных спортсменов Республики Адыгея.
Теоретическая значимость. Использование генетических подходов для анализа функций организма, их адаптационного потенциала позволит понять закономерности функционирования организма в целом и его отдельных систем; дополнить и расширить фундаментальные знания по теории адаптации, углубить представление о роли полиморфизмов генов в развитии функциональных возможностей кардиореспираторной системы спортсменов в процессе систематических спортивных нагрузок, позволит приблизиться к раскрытию механизмов индивидуальной адаптации, получить теоретическое обоснование дифференцированного подбора объема спортивных физических нагрузок для квалифицированных спортсменов с использованием физиологических и генетических подходов анализа кардиореспираторной функции организма.
Новые знания по выявлению региональных информативных молекулярно-генетических маркеров будут способствовать дальнейшему развитию методов донозологической диагностики и профилактики предпатологических состояний организма, связанных с профессиональной деятельностью спортсменов; послужат фундаментальной основой для выявления «групп риска» с последующей корректировкой тренировочного процесса.
Практическая значимость. Результаты исследования по распределению частот генов АСЕ, APOE, AGT, AGTR1, IL-17A, MTHFR могут быть рекомендованы в медико-биологических исследованиях квалифицированных спортсменов для оценки потенциала развития физических качеств; в спортивной медицине для диагностики донозологического состояния кардиореспираторной системы спортсменов; в учебном процессе для разработки магистерских программ по специальности «Общая и спортивная физиология»; при преподавании дисциплин «Молекулярная биология», «Генетика человека» и «Спортивная медицина» в высших учебных заведениях.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и отражены в материалах научно-практических конференций: 5 Международной научно-практической конференции «Ключевые вопросы современной науки» (София, 2011); 4 международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2011); VIII ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (Ростов-на-Дону, 2012); международной научно-практической конференции молодых ученых и аспирантов «Наука. Образование. Молодежь» (Республика Адыгея, Майкоп, 2013).
По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 6 в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Внедрение результатов исследования. Работа выполнена в рамках аналитической ведомственной целевой программы, проводимой по заданию Минобразнауки РФ в 2012-2014 гг. (ЕЗН, код ГРНТИ 34.2341, 34.23.53, 34.13.37, № проекта 4.1334.2011, № гос. контракта 01201276009).
Материалы диссертационного исследования внедрены: в тренировочный процесс спортивных клубов «Динамо» и «Дружба», а так же Института физической культуры и дзюдо АГУ; в учебный процесс Адыгейского государственного университета и лечебного факультета Майкопского государственного технологического университета в рамках биологических и клинических дисциплин: нормальная физиология, медицинская генетика, иммунология для подготовки биологов и врачей общей практики.
Диссертационная работа соответствует паспорту специальности 03.03.01 - Физиология по нескольким областям исследований: п. 2 - Анализ механизмов нервной и гуморальной регуляции, генетических, молекулярных, биохимических процессов, определяющих динамику и взаимодействие физиологических функций; п. 8 - Изучение физиологических механизмов адаптации человека к различным географическим, экологическим, трудовыми социальным условиям; п. 11 - изучение молекулярной и интегративной организации физиологических функций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах компьютерного текста, содержит 74 таблицы, иллюстрирована 26 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя используемой литературы, включающего 139 отечественных и 140 иностранных источников.
Гены-кандидаты и их полиморфные варианты, вовлеченные в регуляцию работы сердечно-сосудистой системы
Физическая работоспособность (ФР) - это интегральная психофизиологическая характеристика организма, отражающая его функциональные возможности и количественно выражающаяся в величине объёма или интенсивности (мощности, скорости) произведенной механической работы (И.А. Корниенко с соавт. 2000; Н.Н. Кошко 2004; В.Д. Сонькина, 2007). При этом, чем больше функциональный резерв кардиореспираторной системы, тем выше ее работоспособность (И.А. Корниенко с соавт., 2000; Э.А. Городниченко, 2004; А.С. Солодков с соавт., 2005; Е.А. Бабенко, 2009). Поэтому ФР является главным индикатором резервных и адаптивных возможностей функциональных систем, отражающим состояние физиологического развития и подготовленность организма, его аэробную производительность (И.В. Акулик, 1990; СБ. Тихвинский, Я.Н. Бобко, 1991; А.В. Шаханова, 1998; Г.Л. Апанасенко, 2009).
В условиях интенсивных физических нагрузок по А.С. Солодкову с соавт. (2005), косвенные показатели работоспособности ухудшаются значительно раньше, чем ее прямые критерии. Это подтверждается работами и других авторов (P.M. Васильева, 2004; СП. Левушкин, 2004; Т.В. Попова, 2006), установивших снижение ФР и адаптационных механизмов при интенсивных нагрузках вследствие перенапряжения и недостаточного восстановительного периода между тренировочными этапами. При этом сроки наступления стадии дезадаптации, продолжительность и степень выраженности функциональных изменений зависят от индивидуальных свойств организма (И.В. Аулик, 1990; А.А. Виру, СВ. Тихвинский, А.Я. Бобко 1991; Э.А. Городниченко, 2004; СИ. Русинова, 2009).
Главными составляющими ФР, согласно схеме, разработанной И.В. Аулик (1990) и СБ. Тихвинского, Я.Н. Бобко (1991) являются: антропометрические показатели, эффективность механизмов энергообеспечения, а так же сила и выносливость мышц. Однако большинство специалистов рассматривают ФР в более узком смысле - как функциональное состояние кардиореспираторной системы (КС) (В.Л. Карпман, 1974; А.А. Гуминский с соавт., 1980; И.В. Аулик, 1990; Р.М.Васильева, 2004; В.Д. Сонькин, 2007; О.Б. Кузнецова, 2009). Ряд авторов (СБ. Тихвинский с соавт., 1991; Т.И. Михайлова, 2008; В.М.Михайлов, 2008; С.Н. Морозов, Е.Е. Шакина, 2009; И.Н. Сахарова, Т.А. Сугробова, 2009) отмечают, что КС вносит существенный вклад в развитие и ограничение ФР, т.к. невозможно беспредельно увеличивать минутный объем кровообращения и дыхания (СБ. Тихвинский, Я.Н. Бобко, 1991; Е.И. Куманцова, 2006; Г.Х. Самигуллин, 2009). Все вышесказанное дает основание использовать разные физиологические методы для прогнозирования работоспособности организма, определения механизмов адаптации к конкретной спортивной деятельности. При этом состояние сердечно-сосудистой системы и сердечный ритм являются ведущими параметрами, обусловливающим функциональные и аэробные возможности организма (Л.И. Анциферова, Б.С Кулаев, 1981; P.M. Баевский, 2006; С.С. Гречишкина, 2012; А.Д. Немиров, 2004). Поэтому функциональное состояние ССС в норме расценивается как проявление долговременной адаптационной реакции, обеспечивающее повышение уровня ФР. Характерной особенностью квалифицированных спортсменов является сочетание максимально экономного функционирования ССС в покое и возможность достижения предельной работоспособности при физической нагрузке за короткий промежуток времени. ССС является основным, лимитирующим звеном кислородного обеспечения организма, а также служит главным индикатором «цены» физиологической адаптации. (В.Л. Карпман,1976; Ф.З. Меерсон, 1988; А.С Солодков, 2005; А.А. Кузьмин, 2011; С.С. Гречишкина, 2012). Поэтому одним из центральных вопросов в спортивной медицине остается проблема адаптации сердечно-сосудистой системы к физической нагрузке (P.M. Баевский, 2006).
Экспериментальные данные подтверждают, что реакции срочной и долговременной адаптации выражаются в структурных изменениях функционального состояния ССС (Г.А. Макарова, 1997; А.В. Шаханова, 2000; Л.Г. Чалова, 2009; А.А. Кузьмин, 2011; С.С. Гречишкина, 2012; Т.Г. Петрова, 2012). Поэтому при массовых исследованиях часто используют определение мощности физической нагрузки при достижении частоты сердечных сокращений 170 ударов в минуту (показатель PWCno) или определение максимального потребления кислорода (МІЖ), отражающее аэробные возможности организма.
Мониторинг работоспособности позволяет отслеживать динамику функциональных резервов организма, степень развития утомления и переутомления в процессе спортивной деятельности, а при необходимости рекомендовать проведение соответствующих восстановительных мероприятий (И.В. Аулик 1990; А.С. Солодкова с соавт. 2005),
При анализе антропометрических данных спортсменов (боксеров и борцов), В.Л. Карпман с соавт. (1988) экспериментально подтвердили линейную зависимость между показателями массы тела и абсолютными величинами PWCno, которые довольно тесно сопряжены с направленностью тренировочного процесса.
По мере роста спортивного стажа на примере лыжников и пловцов отмечено повышение результатов нагрузочного тестирования (В.И. Филимонов, Ю.Б. Ульянов, 1984; Н.Ж. Булгакова, 2009; О.Л. Тарасова, 2009). Интеркорреляционный анализ в указанных исследованиях выявил, что под действием регулярных тренировок существенно меняется зависимость показателей PWCno от состояния центральной и региональной гемодинамики. Показатель нагрузочного тестирования у спортсменов, прежде всего, зависит от спортивной специализации и колеблется в широких пределах. Исходя из выше сказанного, многие авторы сходятся во мнении, что на практике при сопоставлении PWCno целесообразно использовать относительный показатель PWCno на единицу массы тела (А.А. Кузьмин, 2011; С.С. Гречишкина, 2012).
PWCno и МІЖ примерно в равной степени характеризуют физическую работоспособность человека (В.Л. Корниенко, 1987). Коэффициент корреляции между ними очень высок (0,7-0,9), однако взаимосвязь этих показателей не носит строго линейного характера (А.А.Кузьмин, 2011). Поэтому, другим важным показателем работоспособности, аэробных возможностей и общей выносливости является максимальное потребление кислорода (МІЖ). МІЖ реально отражает функциональные возможности организма в режиме интенсивной мышечной работы, а также степень совершенства вегетативных систем, определяя тем самым адаптационные возможности и уровень физической подготовленности спортсмена (СБ. Тихвинский, А.Я. Бобко, 1991; СП. Левушкин, 2005; И.А. Криволапчук, 2009; В.В. Колпакова, 2009; Т.Г. Петрова, 2012). Соответственно, при нарушении процессов адаптации функциональных систем организма величина МІЖ уменьшится и, как следствие, произойдет снижение физической работоспособности. Поэтому считается, что по показателям МПК можно не только отбирать спортсменов, но и, с большой вероятностью, прогнозировать их результативность (СП. Левушкин, 2009; Е.Н. Литвинов, 2009; А.А. Кузьмин, 2011).
В ряде работ показано, что МПК зависит от активной массы тела и отражает общую физическую работоспособность организма (СБ. Тихвинский, Я.Н. Бобко, 1991; Г.М. Маслова, 2009). Оценка относительных показателей МІЖ (мл/мин/кг) позволяет нивелировать влияние массы тела на МПК. Именно такой способ определения МПК считается наиболее объективным (А.В. Шаханова, 1998; В.Д. Сонькин, 2007; А.А. Кузьмин, 2011; Т.Г. Петрова, 2012).
Методы исследования
Для определения прогностической значимости полиморфизмов генов АСЕ (I/D), AGT(Met234Thr), AGTR1(A1166C), APOE(Leu28Pro), MTHFR(Ala222Val) IL-17A (G197A) в развитии функциональных отклонений в работе сердечно-сосудистой системы подобрана группа сравнения из 64 человек в возрасте 47-60 лет (53,4 ± 5,7) с предгипертонией, синдромом кардиоалгии и др., развившимися на фоне атеросклеротических изменений брахиоцефальных артерий, периферических сосудов нижних конечностей, подтвержденных данными стандартных биохимических показателей крови (дислипидемия), неинвазивными скрининговыми и углубленными инструментальными исследованиями: ЭКГ, Холтеровского мониторирования ЭКГ, нагрузочных проб (велоэргометрии), ультразвуковой доплерометрии нижних конечностей, ультразвукового триплексного сканирования сосудов нижних конечностей и брахиоцефальных артерий, эхокардиографии (ЭХО-КС) в условиях структурных подразделений Адыгейской республиканской клинической больницы (АРКБ) (г. Майкоп, Республика Адыгея) врачом-кардиологом высшей квалификационной категории Т.М. Ашкановой.
Возрастные отличия между группой сравнения (47-60 лет), спортсменами и контролем, были обусловлены тем, что в большинстве случаев манифестация функциональных отклонений в работе ССС развивается в более позднем возрасте. Кроме того, данные о неизменности полиморфизма генов в зависимости от возрастного фактора (B.R. Winkelmann et al., 1999; Е. Buraczynska et al., 2003), позволяют включить в исследование, как группу сравнения, испытуемых данной возрастной категории.
Эксперимент осуществлен в кроссекциональном режиме с информированного согласия участников эксперимента. Оценка физической работоспособности (PWCno, Вт, кгм/мин/кг) и общей выносливости (МІЖ, мл/мин/кг) квалифицированных спортсменов проведена на базе лаборатории «Физиология развития ребенка»; полиморфизмы генов исследованы в иммуногенетической лаборатории.
В оценку физической работоспособности и общей выносливости квалифицированных спортсменов входило: . определение физической работоспособности в абсолютных и относительных показателях по данным теста PWCno (Вт, кгм/мин/кг); . расчет максимального потребления кислорода (МІЖ мл/мин/кг). Все исследования проведены в первой половине дня (9-12 часов), в условиях температуры комфорта (18-20С).
Для определения PWCno использовали аппаратно-программный комплекс «Поли-Спектр-Эрго» фирмы «НейроСофт» (г. Иваново). Нагрузка мощностью PWCno моделировалась на велоэргометре под контролем ЭКГ (электрокардиограф «Поли-Спектр-12»). Для этого задавали две пятиминутные нагрузки с трехминутным отдыхом между ними, с постоянной частотой педалирования 60 оборотов в минуту. Нагрузку дозировали индивидуально в зависимости от массы тела испытуемого, из расчета 1 Вт/кг для первой нагрузки, 2 Вт/кг для второй нагрузки.
Тест PWCno основан на закономерности, заключающейся в том, что между частотой сердечных сокращений (ЧСС) и мощностью физической нагрузки существует линейная зависимость. Это позволяет определить величину механической работы, при которой ЧСС достигает 170, путем построения графика и линейной экстраполяции данных, либо путем расчета по формуле, предложенной В. Л. Карпманом и сотр. ЧСС, равная 170 ударам в минуту, соответствует началу зоны оптимального функционирования кардиореспираторнои системы. Кроме того с этой ЧСС нарушается линейный характер взаимосвязи ЧСС и мощности физической работы. Испытуемый последовательно выполняет две нагрузки в течение 5 мин. с 3-минутным интервалом отдыха между ними. В последние 30 сек. пятой минуты каждой нагрузки подсчитывается пульс (пальпаторно или электрокардиографическим методом). Мощность первой нагрузки (Ni) подбирается по таблице в зависимости от веса тела обследуемого с таким расчетом, чтобы в конце 5-й минуты пульс (fi) достигал 110-115 уд./мин. Мощность второй (N2) нагрузки определяется в зависимости от величины Nj. Если величина N2 правильно подобрана, то в конце пятой минуты пульс (f2) должен составить 135-150 уд./мин. Для точности определения N2 можно воспользоваться формулой 1:
Формула 2. Расчет результатов нагрузочного тестирования Оценка физической работоспособности производилась по показателям максимального потребления кислорода (МПК). Определение МПК рекомендуется «Международной биологической программой» как один из наиболее объективных показателей общей выносливости организма - одного из базовых физических качеств, отражающий аэробные возможности организма. По показателям МПК можно с весьма большой вероятностью прогнозировать спортивные результаты и состояние здоровья спортсмена (СБ. Тихвинский, 1991; Г.Л. Апанасенко, 2000).
Примечание. 1 Карпману(1988) по P. Astrand(1985); 2 - по К. Куперу(1979); 3 - по В.Л. Морфологические методы исследования включали антропометрию. Измерение роста и массы тела осуществляли с использованием весов и ростомера по Международным стандартам, одобренным Международным комитетом по стандартизации тестов физической пригодности (Национальные стандарты. Указатель 2010 г.).
Молекулярно-генетические методы Выделение ДНК. Образцы геномной ДНК выделяли из лейкоцитов цельной крови (стабилизированной ЭДТА в вакуумных пробирках «VACCUETTE», Австрия) с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь» (НПФ «Литех» (Россия)). 1000 мкл цельной крови в пробирках на 1,5 мл («Эппендорф» с замком «PCRTUBES», Axygen (USA)) были отцентрифугированы при 3000 об/мин и комнатной температуре (+18...+25С) в течение 5 мин для разделения крови и удаления плазмы. Форменные элементы замораживались при -20С на 1 час и после полного размораживания при +18 - +25С, в содержимое пробирок вносили реактив «ДНК-экспресс-кровь» в объеме, равному исходному (1 мл), все тщательно перемешивалось (10 сек) на вортексе, помещено в предварительно прогретый до 98С термостат на 15 минут. Затем пробирки охлаждались до 70С, центрифугировались в высокоскоростной микроцентрифуге СМ-50 ПЦР («Elmi» Латвия) при 8000-14000 об/мин в течение 15 сек (t +18...+25С). Отобранный в пластиковые пробирки супернатант использовали в качестве исследуемого образца ДНК.
Анализ качества образцов геномной ДНК. Чистота образцов ДНК тестирована на спектрофотометре «NanoDrop 2000с» (Termo Scientific, USA), основанном на измерении оптической плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового спектров поглощения: 280 и 260 нм. Соотношение оптических плотностей, полученных при 280/260 нм превышало 1,8, что соответствует высокой чистоте образцов ДНК (Е.С. Северина и др., 2003).
Исследование инсерционо-делеционного полиморфизма гена АСЕ
Ангиотензин-2 является мощным вазоконстриктором, играющий ключевую роль в регуляции системного артериального давления. Из 30 идентифицированных полиморфных сайтов (полиморфизмов) - SNP гена ангиотензиногена (AGT), большая часть которых приводит к аминокислотным заменам, наиболее значимыми полиморфизмами являются аллельные варианты мутаций, расположенные в кодирующей области - 2 экзона, и связанные с заменами: метионина (Met) на треонин (Thr) в 235 кодоне (Met235Thr или М235Т). SNP полиморфизма (М235Т) гена AGT исследован в трех группах: 1гр. - квалифицированные спортсмены (п=37), 2гр. - доноры (контроль, п=103), не занимающиеся спортом, 3 - группа сравнения (п= 51) с функциональными отклонениями в работе ССС. Распределение Met2S5/235Thr полиморфизмов гена ангиотензиногена (AGT) в контрольной группе
Контингент обследованных лиц включал 103 неродственных здоровых доноров (45 юношей и 58 девушек), подобранных эмпирически из четырех этнических групп (табл.17), проживающих в РА: адыгов (п=53), русских (п=28), армян (п=15), чеченцев (п=7) в возрасте от 18 до 24 лет (средний возраст 21,7±3,15).
Частоты Met235/235Thr полиморфизмов и генотипов гена AGT в объединенных выборках доноров, этнических группах адыгов и русских По частотам М235/235Т аллелей и генотипов (ММ, МТ, ТТ) гена AGT в этнической группах адыгов и русских статистически значимых различий не выявлено (р 0,05). И Общая выборка(п=103) Девушки(п=58) В Юноши(п=45) 55% 54% 56% Met235Met Met235Thr Thr235Thr Met235 235Thr Рис.13. Частоты Met235/235Thr и генотипов гена AGT в зависимости от распределения по полу Распределение аллелей и генотипов гена AGT (М235Т) у юношей и девушек достоверно не отличается (рис. 13).
Полиморфные варианты гена AGTв группе квалифицированных спортсменов Частоты полиморфизмов гена Met235Thr исследованы у 37 квалифицированных спортсменов скоростно-силовых видов спорта (20 футболистов, 9 баскетболистов, 8 легкоатлетов) двух этнических групп (26 русских и 11 адыгов) в возрасте 18-25 лет (средний возраст 22,7±3,45). Данные по распределению Met235/235Thr аллелей в зависимости от этнической принадлежности, спортивной специализации представлены в табл. 18 и нарис. 14. 0 Общая выборка (п=3 7) Русские(п=26) В Адыги(п=11)
В зависимости от этнической принадлежности у квалифицированных спортсменов частоты М235М, М235Т, Т235Т, генотипов и М235/235Т аллелей локуса ангиотензиногена статистически не различаются (рис. 14).
Таблица 18 Частоты генотипов и М235/235Т аллелей гена AGT в группах футболистов, баскетболистов и легкоатлетов
Группы Генотипы Аллели Р ММ МТ ТТ М Т OR(95% СІ) Футболисты (п=20) 35,0% 55,0% 10,0% 0,625 0,375 р 0,05 рЬю,05 р3 0,05
Баскетболисты (п=9) 11,1% 44,4% 44,4% 0,333 0,667 Легкоатлеты (п=8) 25,0% 50,0% 25,0% 0,500 0,500 Примечания: р- достоверность различий для футболистов и баскетболистов (р ), футболистов и легко атлетов (р ), баскетболистов и легкоатлетов (р3)
Достоверные различия (р 0,05) по М235Т AGT у квалифицированных спортсменов выявлены в зависимости от их спортивной специализации. У футболистов клуба «Дружба» повышена частота М235М генотипа и М235 аллеля (х2=4,42; р=0,05 и х2=5,23; р=0,04) в сравнении с баскетболистами и легкоатлетами (% =4,32; р=0,04). Распределение аллелей и генотипов гена ангиотензиногена в группе сравнения
Для подтверждения ассоциированности полиморфизмов Met235/235Thr гена ангиотензиногена проанализировано их распределение у лиц с инструментально верифицированными атеросклеротическими изменениями коронарных (п=31), и периферических (п=15) сосудов разных бассейнов (группа сравнения, п=46) в возрасте 47-60 лет (53,4 ± 5,7). Статистически значимых различий по частотам генотипов (ММ, МТ, ТТ) и аллелей (М235 и 235Т) в контроле (33,0%; 43,7%; 23,3% и соответственно 0,548/0,452) и в объединенной группе сравнения (24,0%; 45,7%; 30,3% и 0,467/ 0,553 не установлено. Достоверные различия между контролем и группой сравнения выявлены в зависимости от локализации атеросклероза (табл. 19).
Частоты генотипов и М235/235Т аллелей гена AGT у лиц с атеросклерозом Аллели/генотипы локализация атеросклероза Генотипы AGT 235 Все (п=46) Коронарный (п=31) Периферический (п=15) М235М (ММ) 24,0% 24,1% 25,0% р 0,05 М235Т (МТ) 45,7% 62,2% 16,7% Т235Т (ТТ) 30,3% 13,8% 58,3% Аллели Met235 0,467 . 0,552 0,333 р 0,05 235Thr 0,533 0,448 0,667 Примечания: ""-достоверность различий по частотам генотипов, - достоверность различий по частотам аллелей
У лиц с периферическим атеросклерозом установлено статистически значимое повышение «патологического» ТТ генотипа (58,3%: р 0,05; Х2=7,56) в сравнении с коронарным (13,8%), однако по частотам аллелей достоверных различий не установлено (табл. 19).
В зависимости от этнической принадлежности достоверных различий по исследуемым полиморфизмам и генотипам гена AGT для группы сравнения не выявлено.
В группе сравнения статистически значимые тендерные различия выявлены только по частоте 235Thr аллеля гена ангиотензиногена у мужчин (0,618) в сравнении с женщинами (0,416) (% -4,56; р 0,05). При межгрупповом сравнении достоверных различий по частотам генотипов и М235/235Т аллелей гена AGT у спортсменов, доноров и в группе сравнения с атерогенезом не установлено (р 0,05) (табл. 20).
Ассоциация PWC170 и МПК квалифицированных спортсменов с генотипами AGT(Met235Thr), AGTR1(A1166C), АСЕ (I/D), MTHFR(Ala222Val)
У этнических русских и адыгов установлена ассоциация 1166С аллели (соответственно %2=3,86; р=0,05; OR=l,87; 1,15-3,5 (95% СІ) и %2=4,02; р=0,05; OR=2,44; 1,01-5,92 (95% СІ)) и С1166С генотипа AGTR1 (%2=9,74; р=0,008; OR=9,8; 1,89-43,52(95%С1)) с повышенным риском развития функциональных отклонений в работе ССС (табл. 33-34).
Следовательно, можно сделать вывод, что наличие 1166С аллеля, и в частности генотипа С1166С гена AGTR1 способствует повышению относительного риска развития функциональных отклонений в работе сердечно-сосудистой системы у здорового населения Республики Адыгея.
Для исследования ассоциации I/D полиморфные варианты гена АСЕ с развитием адаптивных возможностей кардиореспираторной системы спортсменов SNP-методом проанализировано их частотное распределение в образцах ДНК доноров (контроль, п=32), группы сравнении (п=95) и квалифицированных спортсменов (п=33) скоростно силовых видов спорта: баскетболистов (п=10), футболистов (п=13) и легкоатлетов (п=10). Контроль представлен случайной выборкой лиц, не занимающихся спортом. Группа сравнения включала 30 человек с функциональными отклонениями в работе ССС.
Распределение I/D полиморфизма гена АСЕ в контрольной группе Полиморфизмы гена АСЕ исследованы в 32 образцах ДНК не родственных доноров, без клинических проявлений ССЗ в возрасте от 18 до 24 лет (средний возраст 21,7±3,15), проживающих в РА. Распределение частот гена АСЕ в общей выборке и в зависимости от этнической принадлежности доноров представлены на рис. 20-21. И Общая выборка (n=32) Русские(п=21) НАдыги(п=11)
У здоровых доноров превалирует делеция (D аллель) и I/D и DD генотипы АСЕ. В двух этнических группах (русских и адыгов) по частотам инсерционно-делеционного полиморфизма гена ангиотензин превращающего фермента (АСЕ) не выявлено статистически достоверных различий (р 0,05)
Частоты генотипов и I/D аллелей АСЕ в зависимости от распределения по полу Частоты I/D аллелей и II, ID, DD генотипов гена АСЕ в группах юношей и девушек также не различаются. Т.о. в контрольной группе не установлено тендерных и этнических различий по распределению исследованных полиморфизмов АСЕ. Анализ полиморфных вариантов ангиотензин-превращающего фермента в группе квалифицированных спортсменов У квалифицированных спортсменов скоростно-силовой направленности (13 футболистов, 10 баскетболистов, 10 легкоатлетов) в возрасте 18-25 лет (средний возраст 22,7±3,45) в зависимости от этнической принадлежности достоверных различий по частотам аллелей и генотипов АСЕ не установлено (рис. 22)
Легкоатлеты (п=10) 0% 0% 100% 0 1,00 Примечания: р- достоверность различий для футболистов и баскетболистов (р ), футболистов и легко атлетов (р2), баскетболистов и легкоатлетов (р ) У футболистов в сравнении с баскетболистами и легкоатлетами установлено статистически значимое повышение частоты I аллеля гена АСЕ (соответственно 0,268: 0 :0) 0с2=5,31; р=0,02) (табл. 35).
Частоты I/D аллелей и генотипов гена АСЕ в группе сравнения Исследование ассоциации I/D аллелей и генотипов гена АСЕ с функциональными нарушениями в работе сердечно-сосудистой системы проведено в группе сравнения: с коронарным (п=18) и периферическим (п=12) атеросклерозом. Данные по частотному распределению инсерционно делеционного I/D аллелей в зависимости от локализации атеросклероза представлены в табл. 36. Таблица 36 Частоты генотипов и I/D аллелей гена АСЕ у лиц с атеросклерозом Аллели/генотипы частоты генотипов и аллелей Генотипы Все (п=30) Коронарный (п=18) Периферический (п=12) II 16,6% 21,1% 18,2% р 0,05 I/D 30,0% 27.8% 36,4% DD 53,4% 61,1% 45,4% Аллели I 0,316 0,250 0,363 р 0,05 D 0,684 0,750 0,667 Примечания: -достоверность различий по частотам генотипов, - достоверность paoJirmnri ill/ -ici iwiciivi cuijivjivri Для группы сравнения не выявлено достоверных различий по частотам генотипов и I/D аллелей ангиотензин-превращающего фермента в зависимости от локализации атеросклероза. Таблица 37 достоверность Тендерные различия по частотам генотипов и I/D аллелей гена АСЕ Аллели / генотипы частоты генотипов и аллелей Генотипы Мужчины (п=22) Женщины (п=8) II 27,3% 12,5% р 0,05 I/D 36,4% 0% DD 36,3% 87,5% Аллели I 0,400 0,125 р 0,05 D 0,600 0,875 Примечания: -достоверность различий по частотам генотипов, различий по частотам аллелей Исследование частот аллелей и генотипов гена АСЕ выявило достоверное повышение частоты D аллеля (0,875) у женщин в сравнении с мужчинами (0,600) (х2 = 4,26; р=0,04).
