Введение к работе
. Витамины рассматривают не только как соединения, дефицит которых ведет к специфическим нарушениям; важные функции организма, в их числе и свободнорадикальное окисление, зависят от обеспеченности витаминами (М.И.Смирнов, 1974; П.Н.Шараев, 2004; А.Ш.Бышевский и др., 2007; J.K.Campbell е.а., 2004; A.Opperhuizen е.а., 2005; C.Weiss е.а., 2005; A.K.Shirakawa, 2008). Рано сформировавшиеся представления о связях витамина С с метаболизмом (С.Д.Певзнер, 1940) относят ко всем витаминам (В.В.Ефремов, 1969; М.И.Смирнов, 1974; C.Weiss е.а., 2005; A.K.Shirakawa, 2008). Взгляд на них как на средства профилактики и лечения гиповитаминозов сменился представлением как о соединениях, определяющих за счет неспецифических свойств характер метаболизма и устойчивость организма (Б.А.Лавров 1957), и это расширило область их применения.
К заболеваниям, в лечении которых используют витамины, относят и протекающие с нарушениями гемостаза, некоторые из них эффективны и при заболеваниях с явлениями гипероксидации (A.Opperhuizen, 2008), особенно витамины с антиоксидантными свойствами (В.П.Мищенко, 1981, 2005; А.Ш.Бышевский и др., 2003, 2009; M.P.Iqbal е.а., 2005; M.R. Biagini е.а., 2006; Y.Nadir е.а., 2007). В последние годы выявлено их влияние не только на отдельные прокоагулянты, но и на уровень маркеров гемостаза, отражающий наклонность к кровоточивости или тромбофилии. Появились и первые оценки интенсивности непрерывного внутри-сосудистого свертывания крови (НВСК) в связи с витаминной обеспеченностью, выявлены связи между уровнем маркеров НВСК с липидпероксидацией (ЛПО) (А.Ш.Бышевский и др., 2005; В.П.Мищенко и др., 2005). Утвердилось представление о том, что физиологический процесс НВСК, усиливаясь, может перерасти в диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови (Д.М.Зубаиров, 1978, 1989, 2000; А.Ш.Бышевский и др., 1990). Появились основания выстроить в зависимости от скорости НВСК ряд, который отражает его связь с диссеминирован-ным внутрисосудистым свертыванием. Полагают, что сдвиги НВСК, оцениваемые по уровню его маркеров, позволяют выявить наклонность к внутрисосу-дистому тромбообразованию, как к следствию усиленного тромбиногенеза (З.С.Баркаган, 1998; И.Н.Бокарев, 2002; M.Lomtadze е.а., 2005; H.W.Park е.а., 2005). Обращает на себя внимание ещё и следующее: в лечении заболеваний с нарушениями гемостаза чаще других используют витамины А, Е, В5, Bi2 и С; при изучении связи витамины-гемостаз не оценивался исходный уровень обеспеченности витаминами организма подопытных животных, и редко использовались рационы, сбалансированные по нутриентам; не всегда учитывается витаминная
обеспеченность организма пациентов, что позволяет критически оценивать выводы о дозазависимости эффекта витаминов на гемостаз, так как эффекты от введения витамина, зависят от его исходного уровня в организме (А.Ш.Бышевский и др., 2006; K.Groenbaek е.а., 2006); до 80 гг. эффекты витаминов на гемостаз описывали без учета их антиоксидантных свойств; влияние витаминов на интегральный показатель состояния гемостаза (толерантность к тромбину), отражающий ответ организма на гипертромбинемию, не изучали, единичны и сведения об их влиянии на интенсивность НВСК - величину, обратную толерантности к тромбину (Р.Г.Алборов и др., 2005; A.Sh.Byshevsky е.а., 2008); результаты изучения отдельных про- и антикоагулянтов, компонентов плазминовои системы в силу их противоречивости не позволяют оценить эффекты на гемостаз отсутствия, дефицита или избытка витаминов; экспериментаторы крайне редко изучали обеспеченность организма витаминами, использовали рационы питания, в которых баланс нутриентов, в их числе и витаминов, не учитывали.
Всё это обосновывает актуальность дальнейших исследований для решения вопроса, возникшего в XX столетии - целесообразно ли использовать витамины А, Е, В5, В12, С и особенно их комбинации для коррекции гемостатических сдвигов при заболеваниях, протекающих с гиперкоагуляцией.
Цель исследования - экспериментально установить закономерности изменения интегральных показателей состояния гемостаза (непрерывного внутрисосу-дистого свертывания крови и толерантности к тромбину), липидпероксидации и антиоксидантного потенциала тромбоцитов в отсутствии, при дефиците или избытке витаминов А, Е, В5, Ві2 и С, а также при избытке их сочетаний.
Предполагалось, что анализ влияния на гемостаз намеченных нами к изучению и широко используемых в медицинской практике витаминов А, Е, В5, Ві2 и С углубит представления о связи и механизмах их действия на систему свертывание крови, одна из значимых физиологических функций которой - защитная реакция организма на гипертромбинемию.
Задачи исследования
1. Установить, как изменяется в плазме крови уровень факторов Рз, Р4, фибриногена, продуктов деградации фибрина, растворимых комплексов мономерного фибрина и D-димеров, интенсивность липидпероксидации, антиоксидантный потенциал тромбоцитов и толерантность к тромбину в отсутствии витамина А, его дефиците и избытке в пищевом рационе, сбалансированном по остальным макро-и микронутриентам.
-
Изучить, как изменяются эти величины в отсутствии, при дефиците и избытке витаминов Е, В5, Bi2, С в аналогичных экспериментальных условиях.
-
Изучить активность фибринолиза в эуглобулиновой фракции плазмы, а также активированное время рекальцификации и активированное частичное тромбо-пластиновое время, как показателей общей свертываемости крови.
-
Изучить физиологические эффекты сочетанного введения тех же витаминов при их избыточном поступлении с пищевым рационом.
В экспериментах мы сочли необходимым применять в качестве авитаминного рациона такой, в котором отсутствует только один из изучающихся в отдельном опыте витамин; как модель дефицита витамина применять пищевой рацион, содержащий исследуемый витамин в количестве, равном 25, 50 или 75% от суточной потребности; как модель избытка - рацион с двух-, четырёх-, восьми- и 16-кратным избытком витамина относительно суточной потребности в нём.
Дизайн экспериментов
Оценить фибринолиз, уровни маркеров НВСК , интенсивность ЛПО и АОП при питании крыс рационом, в состав которого не включен витамин А, Е, В$, Bj2 или витамин С:
-
При питании рационом, не содержащим витаминов А, Е, В5, В\2 (крысы) или витамина С (морские свинки).
-
На фоне прооксиданта или антиоксиданта.
-
При длительном введении избытка витаминов А, Е, В5 и В\2 (крысы).
-
При внутривенном введении избытка витамина Р5 (однократно и повторно, крысы)
-
При введении избытка витаминов А, Е, В5, В12 и С в сочетаниях по 2, 3, 4 и 5.
Научная новизна
Экспериментально доказано, что отсутствие витамина А, Е, В5 илиВі2 в рационе аскорбатнезависимых (крысы) и витамина С в рационе аскорбатзависи-мых животных (морские свинки) активирует липидпероксидацию, снижает ан-тиоксидантный потенциал тромбоцитов, ускоряет непрерывное внутрисосудис-тое свертывание крови и ослабляет защитную реакцию организма на гипер-тромбинемию.
Впервые определено, что у животных содержащихся на моноавитаминном рационе питания, сдвиги в гемостазе причинно связаны с отсутствием данного витамина - введение в рацион витамина А, Е, В5 или В\2 в дозах, равных 25, 50 или 75% суточной потребности, ослабляет сдвиги (от 1,2 до 1,8 раза соответственно, р < 0,05) , в дозах, превышающих потребность в 2 раза, предупреждает их появление, а в дозах 4-х, 8-й и 16-кратных - достоверно тормозит липидпероксидацию, повышает антиоксидантный потенциал, снижает коагулоак-тивность тромбоцитов и уровень маркеров непрерывного внутрисосудистого
свертывания крови, одновременно увеличивая толерантность к тромбину (Р < 0,05).
Найдено, что отсутствие и избыток витамина А, Е, В5 или В\2 сопровождается сдвигами интегральных показателей состояния гемостаза за счет анти-оксидантных свойств.
Обнаружено, что связи между сдвигами непрерывного внутрисосудистого свертывания крови в отсутствии в рационе одного из витаминов ассоциированы со сдвигами липидпер оксидации положительно, с изменениями АОП - отрицательно; что эти связи более выражены в эффектах витаминов А, Е и В12 (rs = 0,82), и менее выразительны (rs = 0.48) в эффектах витаминов В5 и С, что избыток витамина А, Е, В5, или В\2 в количествах, эквивалентных лечебным дозам, замедляет непрерывное внутрисосудистое свертывание крови, ускоряет фибринолиз в эуглобулиновой фракции плазмы и повышает толерантность к тромбину.
Выявлена высокая индивидуальная вариабельность сдвигов в отсутствии и избытке ниацина в рационе и что его внутривенное введение быстро и доза-зависимо повышает общую свертываемость крови, сменяющуюся вскоре ги-покоагуляцией, и что при повторных внутривенных введениях этот ответ ослабляется.
Впервые показано, что отсутствие витамина С в рационе аскорбатзави-симых животных активирует липидпер оксидацию и снижает антиоксидантный потенциал в тромбоцитах уже через 2 недели, усиливая высвобождение факторов Рз и Р4, и что при длительном (свыше шести недель) С-авитаминном питании уровень этих факторов в плазме снижается на 12,5 и 16,6% соответственно относительно контроля (р < 0.05).
Впервые установлена фазность влияния С-авитаминного питания и введения витамина С в избытке на липидпероксидацию в тромбоцитах и на сдвиги в гемостазе аскорбатзависимых и аскорбатнезависимых животных. Теоретическая и практическая значимость. На основании анализа изменения показателей, характеризующих коагулоактивность тромбоцитов, непрерывное внутрисосудистое свертывание крови, ф.ХПа-зависимый фибринолиз и толерантность к тромбину у животных, содержавшихся на сбалансированном рационе питания, из которого исключали один из витаминов - А, Е, В5, Bi2, С (последний у аскорбатзависимых и аскорбатнезависимых животных) или получавших эти витамины в избытке, эквивалентном лечебным дозам, установлено следующее.
Отсутствие витамина А, Е, В5 или Ві2 в рационе, сбалансированном по остальным нутриентам, ускоряет ЛПО и снижает АОП в тромбоцитах - клетках, участвующих в поддержании ЛПО на физиологическом уровне. Показано, что синхронно с этим ускоряется НВСК, снижается фибринолиз и защитная реакция организма на гипертромбинемию, следовательно, и на появление в кровотоке микромицелл - фрагментов клеточных мембран. Доказано, что сдвиги в гемостазе, возникающие при содержании животных на рационе питания, из которого исключен витамин А, Е, Вб или В\2, реализуются за счет ускорения ЛПО и снижения АОП тромбоцитов, так как при введении в моноавитамин-ный рацион отсутствующего витамина в дозах ниже потребности, сдвиги ЛПО и гемостаза ослабляются, а при дозе, в 2 раза превышающей суточную потребность, не возникают.
Новыми являются данные, указывающие, что избыток одного из этих витаминов в рационе угнетает пропорционально дозе и длительности введения ЛПО в тромбоцитах и повышает их АОП, активирует ф.ХПа-зависимый фибринолиз, замедляет высвобождение факторов Рз, Р4 и непрерывно протекающее с малой интенсивностью внутрисосудистое свертывание и, как следствие, увеличивает способность организма реагировать на гипертромбинемию. Получено и дополнительное свидетельство того, что эффект этих витаминов на гемостаз реализуется через их антиоксидантные свойства - эффект каждого из витаминов на ЛПО, АОП и гемостаз поддерживается введением антиоксидан-та невитаминной природы и подавляется введением прооксиданта.
Данные, полученные при изучении эффекта избытка одного из четырёх витаминов (А, Е, В5 или Віг) в дозах, эквивалентных лечебным, замедляют НВСК, ускоряют фибринолиз и увеличивают ТкТР, что указывает на перспективность их применения для коррекции тромбофилических сдвигов при заболеваниях, которые сопровождаются оксидативным стрессом.
Важным является и установление того факта, что эффекты ниацина на НВСК и ТкТР вариабельнее, чем эффекты остальных исследованных витаминов, и что при его внутривенном введении влияние на гемостаз двухфазно: рост общей свертываемости сменяется снижением из-за компенсаторной активации фибринолиза.
Найдено, что отсутствие витамина С в рационе аскорбатзависимых животных ускоряет ЛПО и снижает АОП тромбоцитов, но усиливает (в отличие от других витаминов высвобождение фф. Рз и Р4, а при длительном С-авита-минном питании (8 недель) уровень фф. Рз и Р4 снижается, замедляется фиб-
ринолиз и падает ТкТР. Эти сдвиги ослабляются при наличии в рационе ас-корбата в дозе, равной 25, 50 или 75% потребности, и не возникают при введении в рацион удвоенной против потребности дозы. Особенно важно, что при потреблении с рационом аскорбата в дозах, эквивалентных лечебным, сдвиги, вызываемые его дефицитом или отсутствием в питании, не выявляются до 6-й недели, но при дозах, превышающих потребность в 4, 8 и 16 раз, после шести недель ускоряется ЛПО и снижается АОП тромбоцитов, ускоряется НВСК и растет толерантность к тромбину, обусловленная активацией фибринолиза. Существенное значение имеют данные о том, что введение аскорбата аскор-батнезависимым животным в дозе, превышающей потребность в 8 раз, антиок-сидантный эффект проявляется в первые две недели, а позднее ЛПО ускоряется, а рост АОП сменяется снижением при одновременном ускорении НВСК. При введении шестнадцатикратной дозы аскорбата кратковременно длящийся антиоксидантный эффект сменяется прооксидантным, сопровождаясь ускорением НВСК. Это доказательно свидетельствует о связи эффекта аскорбата на гемостаз с его влиянием на скорость липидпероксидации.
Экспериментально обнаружено, что сдвиги НВСК при исключении из рациона одного из витаминов (А, Е, С, В5 или В12) положительно ассоциированы с изменениями ЛПО, и отрицательно - с изменениями АОП, что связи эти тесны (rs > 0.9) в эффектах, вызываемых витаминами А, Е и Bi2, и менее тесны в эффектах витаминов В5 и С (rs < 0.7). Установлено, что по степени сдвигов при авитаминозе интегрального показателя (ТкТР) витамины практически равноценны (лишь менее, чем у остальных выражен эффект отсутствия в питании витамина В12), а по степени влияния избытка витаминов на толерантность к тромбину и по скорости развития эффекта они располагаются в последовательности A>E>Bi2>C>B5.
Математический анализ выявил, что сдвиги НВСК при всех исследованных нами авитаминных рационах питания отрицательно ассоциированы с изменениями толерантности к тромбину - тесная связь эффекта витаминов А, Е (rs > 0.9) и менее тесная - витаминов В12, В5 и С (rs < 0.7); изменения толерантности к тромбину положительно ассоциированы с фибринолизом.
Доказано экспериментально, что введение всех возможных сочетаний витаминов по два (А-Е, А-В5, А-Віг, Е-В5, Е-В12, В5-В12) повышает степень прироста ТкТР, при всех сочетаниях по три это заметнее, и ещё заметнее при сочетаниях по четыре, показано что наибольший эффект свойственен сочетанию, включающему все пять витаминов (если доза аскорбата не проявляет
прооксидантных свойств, т.е ниже четырёхкратной относительно суточной потребности).
Внедрение в практику. Совместно с Тюменским отделением Всероссийского физиологического Общества им. И.П.Павлова, с сотрудниками кафедр биологической химии, акушерства и гинекологии ТГМА разработаны и внедрены для использования в лечебных учреждениях г. Тюмени (ГЛПУ ТО ОКБ № 2, ГЛПУ ТО ОКБ № 1) и области (МУЗ «ЦРБ» г. Надым, ГУЗ «СОКБ» г. Салехард) методические рекомендации, оформленные актами: «Эффекторы свертывания крови из сапропеля: влияние на плазмокоагуляцию, тромбоцитарный гемостаз и некоторые жизненные функции лабораторных животных», «Внут-рисосудистое свертывание крови, толерантность к тромбину, активность тромбоцитов и интенсивность ЛПО при гипер- и гипотиреозе» и «Непрерывное внутрисосудистое свертывание крови при отсутствии и избытке в рационе витамина Bi2».
Основные материалы работы обсуждены на российских и международных конференциях: конференции «Теория и методология современного научного исследования Тюменского региона» - Тюмень. - 2003 (2 сообщения), на 2-й региональной научно-практической конференции «Экологическое образование и здоровый образ жизни». - Сургут. - 2006, 3-й научной международной конференции «Актуальные проблемы науки и образования». - Варадеро, Куба. - 2008, IV Всероссийской конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии». - Москва. - 2009, Материалы Российской конф. «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии». - Челябинск: ЧГМА, Объединение биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири, Южно-Уральский научный центр РАМН. - 2009 (3 сообщения).
Результаты, полученные при выполнении работы, используются в обучении студентов и клинических ординаторов по курсам «Нормальная физиология», «Биохимия» и «Клиническая фармакология».
Положения, выносимые на защиту
-
Исключение из сбалансированного рациона питания витамина А, Е, В5, В12 или С (последний у аскорбатзависимых животных) сопровождается ускорением липидпероксидации, снижением антиоксидантного потенциала тромбоцитов, ростом их коагулоактивности, ускорением НВСК и снижением толерантности к тромбину.
-
Избыточное введение с рационом питания витаминов А, Е, или Ві2 в до-
зах, эквивалентных лечебным, угнетает липидпероксидацию, повышает анти-оксидантный потенциал тромбоцитов, снижает их коагулоактивность, замедляя НВСК и повышая толерантность к тромбину.
3. При внутривенном введении витамина В5 (500, 1000, 2000 или 4000
мкг/кг) через 5, 15 и 30 мин наблюдается значительная активация фибриноли-
за, исчезающая к 60-й мин, которая является реакцией на повышение общей
свертывающей активности крови, развивающейся через 5-й мин после инъек
ции.
-
При введении значительного избытка витамина С (44,0 и 88,0 мг/кг массы тела) или длительном (6-8 недель) введении небольших, но превышающих потребность доз (4,125, 11,0 и 22,0 мг/кг массы тела) наблюдается угнетение (первые две недели), а затем ускорение липидпероксидации. Эти сдвиги сопровождаются фазными изменениями НВСК и толерантности к тромбину (вначале увеличение и затем снижение).
-
Липидпероксидация (ЛПО) и антиоксидантный потенциал (АОП) отрицательно ассоциированы (rs, = -0,92), ЛПО и НВСК с одной стороны, толерантность к тромбину с другой - ассоциированы отрицательно в опытах с витаминами А, Е и Bi2 (rs, = -0.95) и менее тесно (rs, = -0.75) - в опытах с витаминами В5 и С.
-
Эффекты изучавшихся витаминов на толерантность к тромбину при со-четанном введении характеризуются неполной суммацией, особенно, если в сочетании содержится аскорбиновая кислота, ведущая себя в дозах восьми- и шестнадцатикратно превышающих потребность (44,0 и 88,0 мг/кг) как проок-сидант.
Апробация. Основные положения диссертации доложены на 5-й Всероссийской конференции «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром.» (М., 2000); 6-й национальной конференции «Атеротромбоз, артериальная гипертензия» (М., 2001); III Российской конференции с международным участием в НЦ ССХ им. Бакулева (М., 2001), Всероссийской конф. "Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения». М., 2001, на сессии (с международным участием) Всероссийской ассоциации тромбозов, геморрагии и патологии сосудов им. А.А.Шмидта-Б.А.Кудряшова (М., 2003); конференции «Актуальные вопросы экспресс-диагностики в хирургии» (М., РНЦХ РАМН, 2003); конференции РАЕ «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Греция, 2003); 2-й конф. РАЕ «Гомеостаз и эндоэкология» (Египет, 2004); конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья (Оренбург, 2003); на
14 конгрессе Дунайской ассоциации гемостазиологов (С.-Петербург, 2004), на международном симпозиуме «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (Дубай, 2006), 2-й региональной научно-практической конференции «Экологическое образование и здоровый образ жизни» (Сургут, 2006), Международной конференции РАЕ «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (ОАЭ, Лутраки, 2006), на III научной международной конференции «Актуальные проблемы науки и образования» (Куба, Вара-деро, 2008), на IV Всероссийской конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (М.: РНЦХ РАМН, 2009), на заочных электронных конференциях «Экологические проблемы внутренних болезней, перинатологии и педиатрии». -2007. 6., «Экологические проблемы внутренних болезней, перинатологии и педиатрии». - 2007. 6, «Химический анализ». - 2007. 2., «Фундаментальные исследования». - 2008. 2. (3 работы); на ежегодных заседаниях регионального отделения РАЕ (Тюмень, 2005-2009), на ежегодных заседаниях Тюменского отделения ВБО (2006-2009), на совместном заседании профессорско-преподавательского состава кафедр нормальной физиологии, биохимии и гигиены с основами экологии, общей фармакологии ТГМА (2006, 2008). Публикации. По теме диссертации опубликованы 62 статьи, из них 12 в журналах рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских диссертаций, 28 - в других медико-биологических журналах, опубликованы 1 монография (Москва: Медицинская книга - 2009. - 112 с) и 4 главы в монографиях (М.: Медицина - 2006; Х-Мансийск: Издат. центр Х-МГМИ, филиал ЮУНЦ РАМН - 2007).
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 238 страницах, содержит 26 таблиц и 21 рисунок, включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, результаты исследований, их обсуждение, выводы, и список использованной литературы (273 отечественных и 345 зарубежных источников). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
