![Коронарный кровоток и энергетический метаболизм в норме и при индукции пероксисом пролифератор-активирующего рецептора альфа (PPAR-[A]) у диабетических мышей](/i/b/3276/405699.png "Коронарный кровоток и энергетический метаболизм в норме и при индукции пероксисом пролифератор-активирующего рецептора альфа (PPAR-[A]) у диабетических мышей")
![Коронарный кровоток и энергетический метаболизм в норме и при индукции пероксисом пролифератор-активирующего рецептора альфа (PPAR-[A]) у диабетических мышей](/i/d/3879/405699/450/1.png "Коронарный кровоток и энергетический метаболизм в норме и при индукции пероксисом пролифератор-активирующего рецептора альфа (PPAR-[A]) у диабетических мышей")
![Коронарный кровоток и энергетический метаболизм в норме и при индукции пероксисом пролифератор-активирующего рецептора альфа (PPAR-[A]) у диабетических мышей](/i/d/3879/405699/450/2.png "Коронарный кровоток и энергетический метаболизм в норме и при индукции пероксисом пролифератор-активирующего рецептора альфа (PPAR-[A]) у диабетических мышей")
![Коронарный кровоток и энергетический метаболизм в норме и при индукции пероксисом пролифератор-активирующего рецептора альфа (PPAR-[A]) у диабетических мышей](/i/d/3879/405699/450/3.png "Коронарный кровоток и энергетический метаболизм в норме и при индукции пероксисом пролифератор-активирующего рецептора альфа (PPAR-[A]) у диабетических мышей")
![Коронарный кровоток и энергетический метаболизм в норме и при индукции пероксисом пролифератор-активирующего рецептора альфа (PPAR-[A]) у диабетических мышей](/i/d/3879/405699/450/4.png "Коронарный кровоток и энергетический метаболизм в норме и при индукции пероксисом пролифератор-активирующего рецептора альфа (PPAR-[A]) у диабетических мышей")
![Коронарный кровоток и энергетический метаболизм в норме и при индукции пероксисом пролифератор-активирующего рецептора альфа (PPAR-[A]) у диабетических мышей](/i/d/3879/405699/450/5.png "Коронарный кровоток и энергетический метаболизм в норме и при индукции пероксисом пролифератор-активирующего рецептора альфа (PPAR-[A]) у диабетических мышей")
Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1 Энергетический метаболизм миокарда 11
1.2. Регуляция энергетического метаболизма 20
1.3. Коронарный кровоток 24
1.4. Изменения миокардиального метаболизма и коронарного кровотока в условиях хронической гипергликемии 39
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования
2.1. Экспериментальная модель 63
2.2. Агонист PPAR- а ВМ 17.0744 (К-111) (2,2-dichloro- 12-(p-chloropheny I )dodecanoic acid) 65
2.3. Изучение сократительной функции миокарда и метаболизма у мышей серии C57BL/KsJ (db/db). (db/+) 66
2.4. Электронный метод мониторинга коронарного тока на модели изолированного сердца (ex vivo) 70
2.5. Статистический анализ 73
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение коронарный ток и энергетический метаболизм в норме и при индукции пероксисом пролифератор-активирующего рецептора альфа (PPAR-a) в эксперименте 74
3.1. Сократительная функция миокарда и энергетический метаболизм в норме и при индукции пероксисом пролифератор-активирующего рецептора альфа (PPAR-а) препаратом ВМ 17.0744 у мышей C57BL/KsJ (db/db). (db/+) 74
3.2. Метод мониторинга коронарного тока на модели изолированного сердца (ex vivo) 87
3.2.1. Методика измерения функциональных параметров коронарного тока и давления 87
3.2.2. Инфракрасный датчик 88
3.2.3. Изучение стабильности функциональных параметров 90
3.2.4. Экспериментальный протокол для изучения резерва коронарного тока 92
3.2.5. Применение методики мониторинга сосудистой реактивности в сердцах гомо- и гетерозиготных мышей серии (C57BL/KsJ, db/db). (db/+) ex vivo 95
Заключение 107
Выводы 113
Практические рекомендации 114
- Коронарный кровоток
- Изменения миокардиального метаболизма и коронарного кровотока в условиях хронической гипергликемии
- Изучение сократительной функции миокарда и метаболизма у мышей серии C57BL/KsJ (db/db). (db/+)
- Метод мониторинга коронарного тока на модели изолированного сердца (ex vivo)
Введение к работе
Актуальность исследования
Неуклонный рост патологии сердечно-сосудистой системы, в том числе на фоне метаболических нарушений, повышает актуальность исследований, направленных на уточнение механизмов межсистемных взаимодействий и поиск путей коррекции выявленных изменений.
В 1999 г. ВОЗ выдвинула термин «метаболический синдром» как основной в ряду тех изменений, которые сопряжены с инсулинорезистентностью (Alberti K.G., 1998). Среди признаков метаболического синдрома повышение артериального давления, нарушения липидного обмена, избыточная масса тела и др. Развитие метаболического синдрома сопровождается нарушениями в сердечно-сосудистой системе на разном уровне от инотропной функции, коронарного кровотока до метаболических сдвигов.
Известно, что в развитии множественных метаболических нарушений центральную роль играет инсулинорезистентность, которая длительное время может протекать как состояние, пограничное между нормой и патологией.
Результатом длительно существующего метаболического синдрома является развитие микроциркуляторных осложнений и кардиомипатий. Патогенез этих изменений носит комплексный характер (King G.L, 1996). Клеточные и молекулярные механизмы изменений микроциркуляции изучены недостаточно. Современные исследователи рассматривают различные причины этих процессов, в том числе и снижение локального кровотока (Strauer В.Е , 1997) Так, одним из факторов способствующих развитию диабетической кардиомиопатии может быть уменьшение поступления крови к миокарду в результате изменений в микроциркуляторном русле, связанных с повреждением эндотелия, аккумуляцией коллагена и, как следствие, утолщением интимы в артериолах (Strauer В.Е , 1997; Pitkanen О.Р., 1998).
В относительно недавних исследованиях было установлено, что одним из ключевых регуляторных факторов миокардиального метаболизма являются лиганд-рецепторные взаимодействия с участием пероксисом пролифера-тор-активирующих рецепторов (PPAR). Пероксисом пролифератор-активи-рующие рецепторы (англ. peroxisome proliferator-activated receptors - PPAR) вовлечены в различные аспекты метаболизма жиров (Desvergne В, 1999; Kliewer S.A.,2001). В настоящее время идентифицированы три изоформы PPAR: PRAR-a, PPAR-0 и PPAR-y. Все три PPAR активируются жирными кислотами и, находясь в связанном (гетеродимеризованном) состоянии с рецепторами к ретиноловой кислоте, присоединяются к специфической для них последовательности ДНК - AGGTCANAGGTCA в промоутерах, акти-
визирующихся под действием PPAR генов. Функционально, PPAR-a был охарактеризован как центральный регулятор митохондриального катаболизма жирных кислот
В настоящее время роль PPAR-a рецепторов в сердце изучена недостаточно Недавние исследования на культурах неонатальных кардиомиоцитов показали, что активация PPAR-a рецепторов увеличивает транскрипцию іенов, содержащих информацию о протеинах, участвующих в транспорте и окислении жирных кислот (Brandt J.M., 1998; Van der Lee К A., 2000). Однако, большая часть исследований по PPAR-a связана с системным метаболизмом, в то время как вопросам их роли в регуляции миокардиальной функции уделено недостаточно внимания.
Таким образом, изучение межсистемных аспектов метаболизма, инотро-пип миокарда и его кровоснабжения в условиях активации ядерных рецепторов PPAR-альфа искуссвенными агонистами представляет актуальную проблему
Цель. Исследовать метаболизм, сократительную функцию и коронарный іок в миокарде в экспериментальных моделях мышей линий C57BL/KsJ(db/ db), (db/+) до и после активации ядерных рецепторов PPAR-альфа их исскус-твенным агонистом ВМ 17 0744 [2,2-dichloro-12-(p-chlorophenyl)dodecanoic acid] с целью оценки роли пероксисом пролифератор-активирующих рецепторов альфа (PPAR-a) в сердечной деятельности.
Достижение указанной цели потребовало решения следующих задач:
Оценить энергетический метаболизм и сократительную функцию миокарда у гетерозиготных (db/+) и гомозиготных мышей линии C57BL/ KsJ(db/db) Изучить роль пероксисом пролифератор-активирующего рецептора альфа в регуляции метаболизма и инотропной функции миокарда путем активации PPAR-альфа искусственным агонистом ВМ 17.0744 [2,2-dichloro-l2-(p-chlorophenyl)dodecanoic acid].
В целях получения максимально точных измерений коронарного тока в эксперименте на грызунах разработать и апробировать электронный метод мониторинга коронарного тока на модели изолированного сердца (мыши линии Swiss Webster)
Сравнить особенности коронарного тока и роль пероксисом пролифератор-активирующего рецептора альфа (PPAR-альфа) в его регуляции на модели мышей линий C57BL/KsJ(db/db), (db/+)
Научная новизна работы
В данной работе применен комплексный подход в изучении физиологических механизмов метаболизма энергетических субстратов, состояния коронарного тока и сократительной функции миокарда в сердце, на фоне введения нового агониста PPAR-a рецепторов ВМ 17.0744 на экспериментальной модели (C57BL/KsJ(db/db)
Впервые в экспериментальной науке было проведено исследование коронарного тока покая и резерва коронарного тока ex vivo на мышах серии C57BL/KsJ (db/db).
Для измерения коронарного тока в перфузионной системе Лангендорфа, впервые был применен инфракрасный датчик, вмонтированный в систему, что обеспечило очень высокую точность измерений.
Научно-практическая значимость работы
Разработана методика измерения функциональных параметров: коронарного тока и давления, развиваемого левым желудочком, в мышиных сердцах ex vivo в системе Лангендорфа.
В ходе разработки методики впервые был применен инфракрасный датчик, вмонтированный в систему Лангендорфа, позволяющий с очень высокой степенью точности измерять показатели коронарного тока. В дальнейшем, как недорогая и практичная, данная методика может быть применена на кафедрах физиологии для изучения различных физиологических и патофизиологических состояний сердечно-сосудистой системы и контрактиль-ной функции миокарда.
Результаты исследования вносят вклад в понимание механизмов миокар-диального метаболизма, сократительной функции сердца и его кровоснабжения в норме и на фоне метаболического синдрома.
Положения, выносимые на защиту:
1. Имеются достоверные различия в системном и миокардиальном метаболизме у гетерозиготных (db/+) и гомозиготных мышей C57BL/KsJ(db/ db) У гомозигот серии C57BL/KsJ (db/db) в плазме крови наблюдаются более высокие концентрации глюкозы, триацилглицеридов, свободных жирных кислот и гиперинсулинемия, миокардиальный метаболизм характеризуется снижением утилизации глюкозы, использованием жирных кислот в качестве основного энергетического субстрата и накоплением триацилглицеридов в сердечной мышце. Активация PPAR-альфа искусственным агонистом ВМ 17.0744 ведет к нормализации параметров системного и миокардиального метаболизма.
Установлены различия в сократительной функции миокарда в группах гетерозиготных (db/+) и гомозиготных мышей серии C57BL/KsJ (db/db). Гетерозиготы характеризуются более высокими уровнями инотропии миокарда. Активация PPAR-альфа искусственным агонистом в обеих группах ВМ 17.0744 не вызывает значимых изменений давления (конечно-диасто-лпческого давления и давления, развиваемого левым желудочком), а также сердечного выброса.
Повышение точности измерений коронарного кровотока в эксперименте на грызунах может быть достигнуто применением электронного метода мониторинга на модели изолированного сердца ex vivo. Модифицированный метод с использованием инфракрасного датчика позволяет более точно измерять быстрые изменения тока жидкости в системе
Коронарный ток достоверно выше у гетерозигот (db/+) в сравнении с гомозиготами C57BL/KsJ(db/db). Использование агониста PPAR-альфа в течение 4-х недель перорального применения ВМ 17.0744 у экспериментальных животных не приводит к значимым изменениям коронарного тока.
Апробация материалов диссертации
Материалы диссертационного исследования были доложены на ежегодном конгрессе Скандинавского Физиологического Общества (Scandinavian Physiological Society, Стокгольм, Швеция, 16-19 августа, 2000 г.); на ежегодной конференции Норвежской Диабетологической Ассоциации (Осло, Норвегия, 2000 г, Берген, Норвегия, 2001 г.); на XVII конгрессе Всемирного Общества по Исследованиям Сердца (XVII World Congress of the International Society for Heart Research, Виннипег, Канада, 6-11 июля, 2001 г.), на ежегодной научно-практической конференции молодых ученых "Ломоносова достойные потомки" (к 290-летнему юбилею М.В, Ломоносова), состоявшейся в г Архангельске 23 ноября 2001г.; на открытых семинарах кафедры медицинской физиологии Университета г. Тромсе (Норвегия), состоявшихся в январе 2000 года и марте 2001 года; на XII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоно-сов-2005" (Москва, Россия, 12-15 апреля, 2005 г.), на проблемной комиссии по физиологии в СГМУ (2005, 2006).
Работа выполнена в рамках НИР Северного государственного медицинского университета (№ государственной регистрации 01200408383).
Публикации. По результатам исследования опубликовано 7 работ.
Структура и объем диссертации
Коронарный кровоток
Примером является переключение на жирные кислоты у человека вскоре после рождения, когда в организме резко возрастает содержание кислорода и диетическое содержание жира (Warshaw J.В., 1972). Подобная замена утилизации одного субстрата на другой важна для постнатальной адаптации метаболизма. Дети, носители мутаций в генах, кодирующих ферменты бета-окисления жирных кислот, страдают ранней печеночной недостаточностью и кардиомиопатией. Нарушения функции печени и сердца становятся особенно выражены в условиях сопутствующей патологии или метаболического стресса (Aoyama Т., 1993; Kelly DP., 1990; Kelly D.P., 1994).
Известны приобретенные формы остановки сердца, которые связаны с дисфункцией механизмов переключения утилизации основных энергетических субстратов. Это имеет место при гипертрофии миокарда, вызванной перегрузкой объемом или повышенной постнагрузкой. В подобной ситуации окислительная способность митохондрий кардиомиоцитов бывает резко ограничена и, следовательно, сердце переключает основной энергетический метаболизм на анаэробные гликолитические процессы (Taegtmeyer Н., 1988; el Alaouialibi Z., 1992; AllardM.F.,1994).
Втечение медикаментозно не контролируемого диабета, вследствие сочетания повышенной толерантности кардиомиоцитов к инсулину и высокой концентрации свободных жирных кислот в крови, для поддержания синтеза АТФ миокард использует практически исключительно жиры (Wall S.R., 1989; Saddik М., 1994).
В подобных нефизиологических состояниях, профиль экспрессии генов соответствует паттерну метаболического состояния. Таким образом, экспрессия генов ферментов, участвующих в бета-окислении, повышена при диабете и понижена в гипертрофированном сердце. Гликолиз (фосфотриозный путь или шунт Эмбдена — Мейерхофа) -ферментативный процесс последовательного расщепления глюкозы в кардиомиоцитах и других клетках, сопровождающийся синтезом АТФ. Аэробный гликолиз завершается образованием пировиноградной кислоты (пирувата). анаэробный гликолиз завершается лишь на уровне формирования молочной кислоты (лактата). Гликолиз является основным путём катаболизма глюкозы в организме (Case Е.М.. 1929). Гликолитический путь представляет собой 10 последовательных реакций, каждая из которых катализируется отдельным ферментом (Рис. 2).
Схема реакций гликолиза. Цифрами обозначены ферменты, катилизирующие гликолитические реакции: 1 - гексокиназа. 2 - глюкозо-6-фосфатизомераза, 3 - 6-фосфофруктокиназа. 4 - альдолаза, 5 — триозофосфатизомераза. 6 - глицеральдегидфосфатдегидрогеназа. 7 -фосфоглицераткиназа, 8 - фосфоглицеромутаза. 9 - енолаза. 10 -пируваткиназа Первый этап, протекающий с расходом энергии 2-х молекул АТФ, заключается в расщеплении молекулы глюкозы на 2 молекулы глицеральдегид-3-фосфата. На втором этапе происходит НАД-зависимое окисление глицеральдегид-3-фосфата. сопровождающееся синтезом АТФ.
Этот метаболический процесс известен почти у всех живых организмов, включая прокариотов (Case Е.М., 1929).
Поступление глюкозы в клетку осуществляется двумя путями: 1) натрий-зависимый ко-транспорт. который не протекает в сердце, но важен для энтероцитов и эпителия почечных канальцев и 2) облегчённая диффузия глюкозы с помощью белков-переносчиков - GLUT (Hardin D.S.. 1995).
Работа белков-транспортёров глюкозы контролируется инсулином. Сильнее всего инсулин стимулирует транспорт глюкозы в мышцах и жировой ткани. Важнейшим из транспортеров, действие которого усиливает инсулин, является GLUT-4. тогда как. например. GLUT-1, -3 не подвержены регуляции инсулином (Olson A.L.. 1996).
Печеночный GLUT-2 производит захват избытков глюкозы из портального кровотока для печеночного синтеза гликогена и жирных кислот. тогда как GLUT-2 бета-клеток поджелудочной железы помогает последним регулировать синтез и высвобождение инсулина при гипергликемии. осуществляя, таким образом, снижение уровня гликемии за счет увеличения захвата глюкозы периферическими тканями - жировой и мышечной (Yasuda К.. 1992; Thorens В.. 1992; Thorens В.. 1990).
Результатом гликолиза является превращение одной молекулы глюкозы в две молекулы пировиноградной кислоты и образование двух восстановительных эквивалентов в виде кофермента НАДН.
При отсутствии или недостатке в клетке кислорода пировиноградная кислота подвергается восстановлению до молочной кислоты.
Таким образом, при анаэробном гликолизе расщепление одной молекулы глюкозы дает суммарную продукцию в виде двух молекул АТФ, полученных в реакциях субстратного фосфорилирования АДФ.
В аэробных условиях сердце использует конечные продукты гликолиза для дальнейших превращений в биохимических циклах, клеточного дыхания (окислительного фосфорилирования) (Etingof R.N.. 1960). В итоге, после полного окисления всех метаболитов одной молекулы глюкозы на последнем этапе клеточного дыхания - окислительном фосфорилировании, происходящем на митохондриальной дыхательной цепи в присутствии кислорода. - дополнительно синтезируются ещё 34 или 36 молекулы АТФ на каждую молекулу глюкозы (Case Е.М.. 1929).
Гидролиз триглицеридов и бета-окисление жирных кислот Жирные кислоты (ЖК) транспортируются в крови в виде триглицеридов (ТГ) в составе липопротеидов, а также в связанной с альбумином форме. Хиломикроны. являющиеся наиболее крупными частицами, обладающими свойствами липопротеидов, осуществляют транспорт триглицеридов, всосавшихся в кишечнике. В свою очередь, триглицериды. синтезированные из глюкозы в печени, транспортируются к сердцу и другим органам в составе липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП). Хиломикроны и ЛПОНП несут апопротеиды. имеющие как структурную, так и регуляторную функции, такую как активация липопротеинлипазы - фермента, гидролизирующего триглицериды и высвобождающего СЖК из ТГ для их дальнейшего захвата эндотелиальными клетками кровеносных капилляров и транспорта в ткани. Отличительным апопротеидом хиломикронов является апопротеид В-48. тогда как ЛПОНП имеют характерную комбинацию апопротеидов В-100. С и Е (Brown M.S.. 1987).
Изменения миокардиального метаболизма и коронарного кровотока в условиях хронической гипергликемии
Поскольку внутримиокардиальное напряжение стенки ПЖ существенно ниже, чем левого, кровоток в бассейне правой коронарной артерии меньше изменяется в фазы систола/диастола. Он наиболее зависим от перепадов давления в аорте
Несмотря на рассмотренные выше факторы (колебание давления в аорте, величина преднафузки) важно помнить, что в физиологических условиях уровень перфузионного давления и величина коронарного кровотока всегда соответствуют потребности миокарда в кислороде
Сопротивление коронарных сосудов складывается из нескольких функциональных компонентов (Мамонтов О.В., 2002; Беленков Ю.Н., 2002; Михайлов ВВ., 2001; Лили Л., 2003).
В первую очередь, это - величина гематокрита. Чем выше этот показатель, тем выше и сопротивление кровотоку. Во всех тех случаях, когда возникает увеличение вязкости крови, создаются предпосылки ухудшения коронарного кровообращения.
Во-вторых, сопротивление - это производное просвета сосудов. Все факторы, как физиологические (спазм ГМК) так и патологические (обструкция сосуда атероматозной бляшкой), вызывающие сужение сосудов, существенно офаничивают кровоток вследствие повышения сопротивления.
Наконец, третий, чрезвычайно важный для сердца фактор, это величина внутримиокардиального напряжения (или внуфижелудочкового давления). Рост напряжения в миокарде ведет к сдавлению микроциркуляторного русла, росту общего сопротивления коронарной системы и офаничению кровотока.
Нейрональные или нейрогуморальные факторы Согласно классической схеме на гладкомышечных клетках кардиомиоцитов присутствуют альфа-адренорецепторы (консфикторы) и бета-адренорецепторы (дилататоры). При этом некоторые авторы полагают, что более широко представлена субпопуляция бета-рецепторов, что с эволюционной точки зрения позволяет рассматривать это, как защиту миокарда от недостатка в питательных веществах и кислороде (Михайлов ВВ., 2001; Морман Д.Е ., 2000; Лили Л., 2003).
Наряду с этим, в публикациях последних лет все чаще высказывается мнение, что в коронарных сосудах имеются и холинэргические волокна (Scratcherd Т., 1997; Теплов СИ., 1980). По мнению одних, это - типичные парасимпатические волокна, другие говорят о холинергической симпатической иннервации. Но независимо от происхождения, возбуждение М-холинорецепторов влечет за собой расширение артерий.
Состояние коронарного кровотока невозможно рассматривать вне связи с сократительной функцией сердца. Так, хорошо известно, что стимуляция симпатических нервов сердца вызывает значимое увеличение коронарного кровотока. Однако, увеличение потока крови сочетается с ускорением сердцебиений и увеличением силы сокращений. Более сильные сокращения и тахикардия (с соответствующим увеличением доли систолы в сердечном цикле) ведут к ограничению коронарного кровотока, в то время как усиление миокардиального метаболизма, о чем свидетельствует изменение ЧСС и силы, формируют тенденцию к дилатации сосудов сопротивления (Berne М., 2000, Scratcherd Т, 1997).
Увеличение коронарного кровотока, наблюдаемое при симпатической стимуляции - это алгебраическая сумма этих факторов.
В перфузируемых сердцах, где механический эффект экстравазальной компрессии исключен вследствие остановки сердца или желудочковой фибрилляции, начальная вазоконстрикция часто наблюдается при стимуляции симпатических нервов сердца до того, как возникнет вазодилатация в ответ на вступление в силу метаболических факторов (Теплов СИ., 1980; Камкин А.Г.. 2004; Шевченко Ю.Л., 2002; Berne М., 2000).
Кроме того, после блокады бета-рецепторов для выключения хроно- и инотропных эффектов, стимуляция симпатических нервов вызывает повышение коронарного сопротивления. Эти наблюдения свидетельствуют, что главный эффект симпатических нервов сердца, это повышение сопротивления путем вазоконстрикции.
Альфа- и бета-адренергические препараты и их соответствующие блокаторы доказывают наличие на ГМК сосудов в сердце а- и р?-рецепторов.
Кроме того, коронарные сосуды сопротивления участвуют в барорецепторном и хеморецепторном рефлексах (Вегпе М, 2000; Olsson R.A., 1991; Scratcherd Т., 1997). Их симпатический вазоконстрикторный тонус может модулироваться посредством этих рефлексов. И все-таки, сопротивление коронарных сосудов находится преимущественно под местным ненейрональным контролем.
Стимуляция блуждающего нерва вызывает слабую дилатацию резистивных сосудов сердца. А активация каротидных и аортальных хеморецепторов может вызывать слабое уменьшение резистивности через влияние вагуса на сердце.
Рефлексы, возникающие в миокарде и изменяющие сосудистое сопротивление в периферических системных сосудах, к которым относятся и коронарные артерии, доказаны. Хотя до настоящего времени нет убедительных данных, свидетельствующих о наличии внесердечных рефлексов, изменяющих коронарное сопротивление (Scratcherd Т., 1997).
Наряду с вышесказанным, оценивая конечные эффекты активации симпатической и парасимпатической нервных систем, следует учитывать не только прямое влияние такой активации на гладкомышечные клетки венечных сосудов, но и опосредованное их действие на уровень обменных процессов в миокарде, ЧСС. сократимость сердечной мышцы и т.д.
К такому опосредованному влиянию можно отнести симпатическую стимуляцию рабочего миокарда через Ц и Pi-рецепторы, как результат усиление в нем метаболизма и последующее устойчивое влияние на сосуды метаболитов вазодилататорного действия (Теплое СИ.. 1980; Belardineli L., 1980; Hen T.W., 1999; Ishibashi Y., 1998)
Изучение сократительной функции миокарда и метаболизма у мышей серии C57BL/KsJ (db/db). (db/+)
В возрасте 8 недель случайно выбранные экспериментальные мыши (C57BL/KsJ (db/db) были помещены в клетки по 4-5 животных. Экспериментальная группа мышей получала препарат ВМ17.0744 в течение 4 недель. Доза препарата рассчитывалась исходя из суточного потребления воды и варьировала между 24,5 ± 1,35 и 37,9 ± 2.5 мг/кг в сутки.
Забор крови и биохимический анализ Уровень глюкозы в крови мышей измерялся в динамике 4-х недельного введения препарата ВМП.0744. Измерения проводились с помощью Precision Plus electrodes (Medisense and Abbott Laboratories; Bedford, USA) натощак через 4 часа после последнего приема пищи. Забор крови проводился из бедренной вены мыши. В день эвтаназии проводился дополнительный забор крови. Уровень глюкозы плазмы крови, содержание свободных жирных кислот и уровень ТАГ измерялся при помощи биохимических тестов Boehringer-Mannheim (Cat. No. 1442449; Mannheim, Germany), Wako Chemicals (Cat. No. 994-75409; Neuss, Germany) и Roche Diagnostic Systems (Cat. No. 0736791; Basel, Germany). Уровень инсулина измерялся при помощи радиоиммунологического биохимического теста Linco Research (Cat. No. RI-13K).
Оценка показателей сердечного метаболизма Сердечный метаболизм измерялся путем регистрации количества МС02 и 5Н20, образующихся в процессе окисления глюкозы, меченой изотопом С и пальмитата, меченного изотопом 3Н.
После 60-ти минут эксперимента сердца подвергались быстрой заморозке, а затем хранились в жидком азоте для последующего анализа уровня ТАГ в сердечной мышце. Измерение тканевого уровня ТАГ в миокарде Тканевые липиды извлекались из 30 мг сердечной мышцы методом Folch. Затем они смешивались с 300 мкл тетра-бутилового спирта и 150 мкл тритон-х-100-метилового спирта в соотношении 1:1. Содержание ТАГ измерялось при помощи триглицерид-25 теста АВХ Diagnostics (Montpellier, France). 2.4. Электронный метод мониторинга коронарного тока на модели изолированного сердца (ex vivo) Система изолированного сердца по Лангендорфу
Методика измерения коронарного тока и давления, развиваемого левым желудочком, была разработана с использованием мышиных сердец серии Swiss Webster весом 30-35 грамм. Для предотвращения тромбообразования за 10 минут до анестезии животным вводился гепарин в дозе 100 ЕД (i.p). Анестезия осуществлялась 10 мг. пентобарбитал натрия (i.p). Наступление хирургического уровня анестезии оценивалось по отсутствию корнеального рефлекса, а также педального рефлекса на болевой раздражитель.
После срединной торакотомии сердца быстро извлекались и помещались в холодный бикарбанатный раствор Кребс-Хенселейта. Сердца канулировались через аорту и перфузировались ретроградно при постоянном перфузионном давлении 73 мм рт.ст. бикарбонатным буфером Кребс Хенселейта, содержащим (ммол/л): NaCl 123.5, NaHC03 20. KG 4.7, MgS04 1.2, KH2PO4 1.2, CaCU 2.0, глюкозы 11, насыщение раствора проводилось газовой смесью 95% 02, 5% С02(рН 7.4).
Первые 20 минут сердца промывались от крови. В течение этого времени небольшой шарик, заполненный жидкостью, подсоединенный к трансдюсеру давления через тонкий катетер, вводился в левый желудочек через левое предсердие. Это позволяло измерять рабочее давление левого желудочка в течение всего эксперимента (рис.14). Сигналы, поступаемые с трансдюсера проходили через усилитель и записывались, а затем анализировались при помощи компьютерной программы Lab-View. Температура сердца постоянно поддерживалась на уровне 37С и записывалась термодатчиком, помещенным в правый желудочек. Стимуляция сердца осуществлялась игольчатыми электродами, присоединенными к правому предсердию (480 уд/мин). Коронарный ток записывался в течение всего эксперимента инфракрасным датчиком (BratkovskyS, 2004).
В предыдущем исследовании применение препарата у гомозиготных мышей приводило к значительному улучшению показателей миокардиального метаболизма в сердцах db/db мышей. В этом эксперименте мы попытались протестировать гипотезу о том, что нормализация сердечного метаболизма может улучшить коронарный ток и реактивность сосудов сердца.
В течении 4-х недель, группе 8-ми недельных гомозиготных мышей вводился препарат ВМ 17.0744 (К-111), добавленным в питьевую воду (0,24 мг/мл).
После инструментальной подготовки изолированного сердца в системе Лангендорфа и периода стабилизации коронарного тока и рабочего давления левого желудочка осуществлялось введение препарата нитропруссида натрия (донора NO) при концентрации 1 мкгр /мин. По окончании введения нитропруссида натрия использовался 10 минутный перерыв, при котором коронарный ток и рабочее давление левого желудочка возвращались к величинам покоя. Затем осуществлялось введение аденозина 5 мкгр /мин Оба препарата вводились через Т-образное соединение с канюлей со скоростью 5% от коронарного тока покоя (рис.14). Максимальные дозы препаратов были определены в пробных экспериментах. По истечении 10 минутного перерыва коронарный ток и рабочее давление в желудочке были измерены до и после 90-секундного периода тотальной ишемии
Сердечно-сосудистая реактивность на препараты нитропруссида натрия и аденозина была также исследована в нормотермически калий-остановленных сердцах гетеозиготных (db/+) и гомозиготных (db/db) мышей, чтобы установить: является ли изменение коронарного тока первичным, за счет воздействия препаратов, а не вторичным, за счет увеличения работы сердца.
В другой серии экспериментов в течении 4-х недель, группе гомозиготных (db/db) 8-ми недельных мышей вводили препарат ВМ 17.0744 (К-111), который является активатором PPAR-a, добавленным в питьевую воду (0,24 мг/мл) (Meyer М.А.. 1998).
Метод мониторинга коронарного тока на модели изолированного сердца (ex vivo)
Полагают, что PPAR-a рецепторы ответственны за метаболические изменения в тканях, как в норме, так и при патологии (Barger P.M., 2000; Sack M.N., 1998; Pill J., 1999). Изменения в метаболическом профиле миокарда после использования ВМ 17.0744, вероятно, вызваны экспрессией генов, кодирующих каталически активные ферменты, ответственные за липидный и углеводный метаболизм. Усиление катаболизма жирных кислот в миокарде при метаболическом синдроме, вызванное гиперлипидемией, тем не менее, не достаточно для их полной утилизцаии и, как следствие, часть из них депонируется в сердечной мышце в виде ТАГ. В результате применения препарата ВМ 170744 происходит снижение образования липопротеидов низкой плотности в печени, снижение уровня гиперлипидемии и интенсивности поступления жирных кислот в сердце. Тем самым препарат ВМ17.0744 способствует нормализации уровня миокардиальных ТАГ. Также сердечный метаболизм переключался на преимущественное использование глюкозы в качестве энергетического субстрата. В наших исследованиях было продемонстрировано, что применение у мышей (db/db) препарата ВМ 17.0744 приводило к снижению интенсивности окисления жирных кислот в миокарде на 50%, с сопутствующим увеличением утилизации глюкозы (интенсивность анаэробного и аэробного гликолиза возросла в 1,7 и 2,3 раза соответственно). Наши исследования также выявили наличие сократительной дисфункции миокарда мышей db/db. Несмотря на нормализацию миокард пального метаболизма и снижению депо ТАГ, улучшения сократительной функции миокарда не наблюдалось. Одной из причин этого могут быть необратимые структурные изменения в миокарде (Giacomelli F., 1979; Kuo Т.Н., 1985), возникшие до момента начала введения препарата. Необходимы дополнительные исследования для выявления момента наступления сократительной дисфункции миокарда у мышей db/db. Другой причиной мог быть короткий период применения агониста PPAR-a (четыре недели).
Поэтому необходимы дальнейшие исследования эффективности данного препарата, в которых коррекция начиналась бы с более раннего возраста мышей db/db и была бы более продолжительной. Кроме того, учитывая хороший метаболический эффект от использования PPAR-a - агонистов было бы интересно исследовать поведение сердца на фоне метаболического синдрома в условиях физиологического стресса (кратковременной ишемии и повышенной нагрузки) при введении ВМ17.0744. По причине того, что биохимические механизмы, объясняющие нормализацию миокардиального обмена при использовании PPAR-a агонистов (ВМ 17.0744) изучены недостаточно, необходимо проведение дальнейших исследований в этой области.
Коронарный кровоток, давление левого желудочка у нормальных и диабетических мышей (до н после индукции агоннстом PPAR-a). В нашем исследовании разработана методика, которая позволяет одновременно регистрировать давление, развиваемое левым желудочком, и коронарный ток в мышиных сердцах ex vivo. Данная методика была использована для изучения стабильности мышиного сердца в системе Лангендорфа, а также для исследования коронарно-васкулярной реактивности в сердцах мышей серии C57BL/KsJ. db/db Резерв коронарного тока измерялся в ответ на введение препаратов нитропруссида натрия, аденозина и 90-секундный период тотальной ишемии (развивалась последующая реактивная гиперемия).
Полученные результаты показывают, что коронарный ток покоя в сердцах мышей db/db был на 15 % меньше, чем в сердцах мышей db/+ (контрольная группа), а именно 2,1 ± 0,1 против 2.6 ± 0,2 мл/мин.
Кроме того, резерв коронарного тока в ответ на (1) введение натрия нитропруссида (донора N0), (2) введение аденозина и (3) 90-секундный период тотальной ишемии был значительно ниже в сердцах гомозиготных мышей (0,6 - 0.9 мл/мин), в сравнении с гетерозиготными (1,2 - 1,4 мл/мин). Также наблюдалась достоверная разница между сердцами гомозиготных мышей и сердцами гетерозиготных мышей при восстановлении коронарного тока покоя после 90-секундного периода тотальной ишемии. В то время как коронарный ток покоя в сердцах гетерозиготных мышей приходил в норму через 1 - 2 мин. после гиперемического пика, восстановление его в сердцах гомозиготных мышей занимало около 5 минут. Наши результаты показывают, что резерв коронарного тока снижен в сердцах гомозиготных мышей.
Сниженный коронарный ток покоя в сердцах db/db мышей может быть обусловлен структурными изменениями в стенках сосудов. Хроническая гипергликемия может быть одной из причин, которая способствует неферментативному гликозилированию молекул в стенках сосудов и необратимому образованию и накоплению конечных продуктов гликозилирования. Накопление этих продуктов в сггенках сосудов может увеличивать образование свободных радикалов кислорода (Ido Y.. 2001), что приводит к снижению активности NO и способствует нарушению эндотелиальной функции (Bucala R., 1991; Verbeke P., 2000). Кроме того, гликозилированный коллаген может индуцировать пролиферацию клеток гладкой мускулатуры сосудов, увеличивать толщину артериальных стенок и снижать эластичность сосудов сердца (lino К., 1996). У диабетических больных сердечный кровоток покоя находится в пределах нормы (Pitkanen О.Р., 1998; Di Carli M.F., 1999, Sundell J., 2002), это указывает на присутствие компенсаторных механизмов задействованых в обеспечении адекватной перфузии сердца.
Наше исследование показывает, что коронарный ток в ответ на воздействие нитропруссида натрия, аденозина и реактивной гиперемии был снижен в сердцах гомозиготных мышей и составлял приблизительно половину от резерва коронарного тока в сердцах гетерозиготных мышей. Результаты исследования совпадают с результатами клинических исследований, при которых отмечается снижение коронарной вазореактивности у диабетических пациентов (Nitenberg А., 1993; Nahser, Jr.P.J., 1995; Pitkanen OP., 1998; Di Carli M.F., 1999). Согласно клиническим наблюдениям у пациентов, страдающих диабетом и пациентов с избыточной массой тела обнаружена дисфункция эндотелия коронарных сосудов с уменьшением активности NO-синтетазы и нарушением высвобождения оксида азота (Steinberg Н.О., 1996). В нашем исследовании нитропруссид натрия и аденозин вводились в оптимальных дозах, приводящих к максимальному расширению сосудов (Bratkovsky S., 2004). Тканевая концентрация оксида азота и аденозина были не лимитированы, могли достигать максимальных величин. Таким образом, снижение резерва коронарного тока в сердцах гомозиготных мышей могло быть вызвано нарушением проведения внутриклеточного сигнала, опосредованного оксидом азота и аденозином, которые в нормальных условиях должны приводить к расслаблению гладкой мускулатуры сосудов. Сниженный резерв коронарного тока мог быть также результатом структурных изменений в стенках сосудов в связи с образованием и накоплением конечных продуктов гликозилирования (Candido R, 2003, De Vriese A.S., 2000, Sheetz M.J.. 2002) Образование и накопление данных продуктов может способствовать фиброзу и снижению эластичности коронарного микроциркуляторного русла (lino К.., 1996). Наши исследования показывают, что восстановление коронарного тока покоя замедлено в сердцах гомозиготных мышей по сравнению с контролем, что подтверждает вышеизложенное.
Известно, что помимо повреждающего эффекта хронической гипергликемии, высокий уровень концентрации циркулирующих свободных жирных кислот также приводит к нарушению эндотелиальной функции (Steinberg Н.О., 1997). Кроме того, хронически высокий уровень концентрации инсулина оказывает отрицательный эффект на эндотелиальную функцию через высвобождение эндогелина-1 (ЭТ-1) (Perfetto F., 1998; Piatti P.M., 2000). Поэтому мы использовали у мышей серии C57BL/KsJ,db/db активатор PPAR-a препарат ВМ 17.0744 (Pill J., 1999), который эффективно снижал концентрацию глюкозы, липидов и инсулина в плазме крови гомозиготных мышей. Происходила нормализация концентрации глюкозы, липидов и инсулина плазмы крови, но не наблюдалось улучшения коронарной реактивности. Это может свидетельствовать о том, что в структуре коронарных сосудов мышей имели место необратимые изменения.
Таким образом, мы полагаем, что сниженный коронарный ток покоя и уменьшение резерва коронарного тока в сердцах гомозиготных мышей может происходить в связи со структурными изменениями в стенках сосудов. Состояние хронической гипергликемии может приводить к накоплению в стенках сосудов метаболитов глюкозы, что способствует повреждению миокарда через гликозилирование структурных протеинов миокарда и накопление конечных продуктов гликозилирования. Токсичность конечных продуктов гликозилирования обусловлена их способностью накапливаться в тканях с образованием необратимых соединений внутриклеточных протеинов, а также генерации свободных радикалов кислорода (Candido R., 2003, De Vriese A.S., 2000. Sheetz M.J., 2002). Данные причины могут вызывать фиброз и снижение эластичности сосудов сердца.
