Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Строение и иннервация гладких мышц нижнего пищеводного сфинктера 9
1.2. Электрические и сократительные свойства гладких мышц нижнего пищеводного сфинктера 14
1.3. Регуляция электрической и сократительной активности нижнего пищеводного сфинктера 17
1.4. Роль натрий-протонного и хлор-бикарбонатного обменов в регуляции электрической и сократительной ГМК НПС 27
1.4.1. Натрий-протонный обмен 28
1.4.2. Хлор-бикарбонатный обмен ...30
Глава 2. Материалы и методы исследования ...34
2.1. Объект исследования и техника приготовления гладкомышечных препаратов... 34
2.2. Используемые растворы и препараты 35
2.3. Исследование электрических и сократительных свойств ГМК НПС 36
2.4. Регистрирующие устройства 39
2.5. Расчет показателей и их статистическая обработка 41
Глава 3. Результаты собственных исследований 43
3.1. Электрические и сократительные свойства ГМК НПС 43
3.2. Изучение роли рН в регуляции электрической и сократительной активности ГМК НПС 54
3.2.1. Изучение влияния изменений внеклеточного рН на параметры электрической и сократительной активности ГМК НПС 54
3.2.2. Изучение влияния изменений внутриклеточного рН на параметры электрической и сократительной активности ГМК НПС 57
3.2.3. Роль натрий-протонного обмена в регуляции электрической и сократительной активности ГМК НПС 66
3.2.4. Изучение роли хлор-бикарбонатного обмена в регуляции электрической и сократительной ГМК НПС... 70
3.3. Изучение роли оксида азота в регуляции параметров электрической и
сократительной активности ГМК НПС 74
3.3.1. Влияние нитропруссида натрия на параметры электрической и сократительной активности ГМК НПС ...74
3.3.2. Действие нитропруссида натрия на фоне тетраэтиламмония ..,.75
3.3.3. Действие нитропруссида натрия на фоне гиперкалиевого раствора 76
3.3.4. Действие L-NAME на электрическую и сократительную активность ГМК НПС 78
3.3.5. Действие нитропруссида натрия на фоне метиленового синего 80
3.4. Изучение действия нитропруссида натрия в условиях модификации внутриклеточного рН 81
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 84
4.1. Электрофизиологические свойства ГМК НПС 84
4.2. Роль внеклеточного и внутриклеточного рН в регуляции электрической и сократительной ГМК НПС 90
4.3. Роль оксида азота в регуляции электрической и сократительной активности ГМК НПС 95
4.4. Модулирующее действие внутриклеточного рН на эффекты оксида азота97
Выводы 99
Список литературы 100
- Строение и иннервация гладких мышц нижнего пищеводного сфинктера
- Исследование электрических и сократительных свойств ГМК НПС
- Электрические и сократительные свойства ГМК НПС
- Электрофизиологические свойства ГМК НПС
Введение к работе
Актуальность проблемы
Одной из актуальнейших проблем современной гастроэнтерологии является изучение механизмов регуляции электрических и сократительных свойств гладкой мускулатуры пищеварительного тракта. Это связано с тем, что в основе патогенеза ряда заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) лежат нарушения моторной функции гладкомышечной клетки (ГМК) (Байтингер В.Ф., 1994; Васильев Ю.В., 2002).
Наряду с общими закономерностями, характерными для ГМК, входящих в состав пищеварительного тракта, имеются основания говорить об специфических особенностях, присущих каждому гладкомышечному органу (Шуба М.Ф., 1965; Орлов Р.С., 1967; Амвросьев АЛ., 1977; Медведев М.А., 1983; Байтингер В.Ф., 1994; Allescher D.H. et al., 1986; Salapatek A.-M.F. et al„ 1998). В связи с этим представляется актуальным и значимым исследование электрической и сократительной активности гладких мышц нижнего пищеводного сфинктера.
Посвященные изучению физиологических свойств ГМК нижнего пищеводного сфинктера исследования, в большинстве своём, выполнены с применением различных модификаций метода «пэтч-клямп», которые, однако не позволяют оценить сократительную активность (Ji J. et al., 2000; Ji J, et al., 2002; Salapatek A.-M.F. et al., 2002). Другие исследования выполнены на нервно-мышечных препаратах, и при этом не исключены влияния сохранившихся элементов интрамуральной нервной системы (Zerbib F. et al., 2000; Pandolfino J.E. et al., 2002). Исследования, проведенные методом «сахарозного мостика» позволяют обойти указанные затруднения, но весьма немногочисленны. При этом они не дают полного представления о механизмах регуляции электрической и сократительной активности нижнего пищеводного сфинктера, таких, как NO-активируемая цГМФ-зависимая система (Артемен-
w ко Д.П., 1964; Земляков И.Ю., 1985; Медведев М.А., 1985, 1987, 1992; Студ-
ницкийВ.Б., 1989,1992; Шуба М.Ф., 1991)
Таким образом, недостаточная изученность электрических и сократительных свойств ГМК нижнего пищеводного сфинктера, роли ионтранспорт-ных систем в регуляции электрогенеза и сокращения выдвигает данное направление исследований как одну из важных задач современной гастроэнтерологии. Наряду с этим, необходимость изучения механизмов регуляции
* электрической и сократительной активности гладких мышц нижнего НПС
определяется необходимостью создания экспериментальной базы для разра
ботки новых подходов к фармакологической коррекции патологических со
стояний этого органа, сопровождающихся изменением рН межклеточной
среды.
Цель исследования. Изучить электрические и сократительные свойства гладких мышц нижнего пищеводного сфинктера в условиях модификации
* внутриклеточного рН.
Задачи исследования
Исследовать параметры электрической и сократительной активности ГМК НПС при модификации внутриклеточного рН.
Изучить влияние оксида азота на электрогенез и сокращение гладких мышц НПС.
Оценить действие изменений внутриклеточного рН на эффекты ок-си да азота.
Научная новизна
В работе впервые проведен анализ электрических и сократительных свойств ГМК циркулярного слоя нижнего пищеводного сфинктера в условиях внутриклеточного закислення и защелачивания. Установлено, что внутриклеточное закисление приводит к увеличению силы вызванных сокращений.
* Показано, что ингибирование натрий-протонного обмена модулирует элек-
7 трогенез и сократительную активность, изменяя преимущественно, кальциевую проводимость мембраны ГМК НПС.
Впервые исследована связь между внутриклеточной концентрацией протонов и активностью NO-зависимого пути регуляции сократительной активности.ГМК циркулярного слоя НПС
Научно-практическая значимость работы
В результате проведенного исследования получены новые знания фундаментального характера о роли хлор-бикарбонатного и натрий-протонного обменов в регуляции электрической и сократительной активности гладких мышц нижнего пищеводного сфинктера. Результаты исследования позволяют также внести дополнительную информацию о роли основных потенциалооб-разующих ионов в электрогенезе и сокращении ГМК НПС. Полученные данные могут быть использованы для выяснения механизмов действия ряда лекарственных препаратов, применяемых в клинике.
Положения, выносимые на защиту
Внутриклеточное закисление сопровождается активацией сократительной активности гладких мышц нижнего пищеводного сфинктера за счет подавления калиевой проводимости мембраны ГМК.
Внутриклеточное защелачивание вызывает ингибирование сократительной активности гладкомышечных клеток НПС преимущественно за счет активации калиевой проводимости.
В гладкомышечных клетках нижнего пищеводного сфинктера внутриклеточное закисление приводит к увеличению чувствительности цГМФ-зависимого пути регуляции сократительной активности к оксиду азота.
Основные положения могут быть использованы в курсе лекционных и практических занятий по физиологии и биофизике возбудимых тканей и физиологии ЖКТ.
8 Апробация работы
Основные материалы доложены и обсуждены на 3, 4 и 5 международном конгрессе молодых учёных и специалистов (Томск 2002, 2003, 2004 г.г.), на 4 съезде физиологов Сибири, 2002 г. Новосибирск и на симпозиуме с международным участием: «Мембранные и молекулярные механизмы регуляции функций гладких мышц» г. Томск 27-28 мая 2004.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе в центральной печати 1.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 126 страницах, иллюстрирована 41 рисунком и состоит из введения, 4 глав, выводов, указателя литературы из 238 источников (44 отечественных и 198 иностранных авторов).
Строение и иннервация гладких мышц нижнего пищеводного сфинктера
По литературным данным, параметры натрий-протонного обмена сходны для клеток разных тканей. Стехиометрия этого переноса 1:1, таким образом, он электронейтрален и нечувствителен к изменениям трансмембранного потенциала. Движущей силой для переноса ионов через натрий-протонный обменник является суммарный химический градиент ионов натрия. В физиологических условиях этот обменник работает в направлении Na+-BHyrpb/H+ -наружу, но при снижении количества ионов натрия во внешней среде направление переноса может измениться на противоположное (Геннис Р., 1997).
Широко используемым инструментом в изучении натрий-протонного обмена являются амилорид и его производные, такие, как изопропиламило-рид, способные ингибировать эту ионтранспортную систему. Амилорид, подобно тетрод отокси ну имеет в своей структуре гуанидиновую группировку, которая определяет его активность как ингибитора (Berk B.C. et al., 1990; Fitzgerald R.C. et al., 1998; Duquette R.A. et al., 2001; Yeung E.W. et al., 2002). Другим распространенным методическим приемом является добавление в омывающий раствор слабых оснований. В частности ацетат натрия в концентрации 20 мМ и хлористый аммоний в концентрации 10 мМ. Из литературных данных (Геннис Р., 1997; Blank P. S. et al., 1992) известно, что аммиак проникает в клетку намного быстрее, чем аммоний. Во внутриклеточной сре де аммиак соединяется с ионами водорода, повышая при этом рН. Если из внеклеточного раствора удалить NH4C1, то NH3 выходит из нее быстрее, чем NH/, и рН; опускается ниже исходного уровня. По мере того, как ионы NH4+ диффундируют из клетки, pHj медленно возвращается к прежнему значению. Аналогичный механизм обеспечивает внутриклеточное закисление при добавлении ацетата натрия и защелачивание при его отмыве.
Согласно имеющимся исследованиям, местом действия амилорида яв » ляется натриевый координационный участок на наружной стороне натрий 29 протонного транспортера, а механизм ингибирования определяется конкуренцией с ионами натрия за этот участок (Орлов С.Н. и др., 1992). Показано также, что при действии амилорида уменьшается и сродство участков связывания на внутренней стороне переносчика.
В настоящее время известно, что в ГМК сосудов амилорид-чувствительный вход ионов натрия составляет до 80% общего поступления этих катионов. Скорость аккумуляции ионов натрия через натрий-протонный обмен повышается при щелочных значениях рН внешнего раствора (рН0) и уменьшается при его под кислений. Максимальная и минимальная скорости аккумуляции достигаются при рН 8,5 и 6,0 соответственно. Поступление ионов натрия в клетку по натрий-протонному обменнику полностью прекращается при действии амилорида и его производных и ведет к повышению внутриклеточной концентрации протонов. Значительное уменьшение pHj, по мнению ряда авторов (Underhay J.R. et al., 1997; Hume J.R. et al., 2000; BalogE.M. et al., 2001), может быть достигнуто и при выключении натрий-протонного обмена в безнатриевой среде.
Нарушение гомеостаза Н+ и Na+ могут оказывать существенное влияние на ионную проводимость мембраны ГМК. В серии исследований показано, что при выключении натрий-протонного обмена угнетается кальций-зависимая калиевая проводимость мембраны ГМК мочеточника и taenia coli морских свинок (Berk B.C. et al., 1990; Rajendran V.M. et al., 1999). Необходимо отметить, что наряду с ингибированием натрий-протонного обмена амилорид блокирует и потенциалозависимую натриевую проводимость мембраны ГМК мочеточника (Duquette R.A. et al., 2001).
В литературе имеются сведения о влиянии натрий-протонного обмена на сократительные свойства гладких мышц. Так, активация обменника вызывает повышение механического напряжения сосудистых гладких мышц. Ин-гибирование натрий-водородного обмена в безнатриевой среде или при действии этил изопроп ил амилорид а повышает сократительную активность ГМК мочеточника. Что касается роли натрий-протонного антипортера в регуляции сокращений гладких мышц нижнего пищеводного сфинктера, то в литературе встречаются малочисленные и противоречивые данные (Klein J.D. et al., 1999).
По мнению ряда авторов (Rajendran V.M. et al., 1999; O Neill W.C., 1999), в реализацию эффектов нарушений натрий-протонного обмена может вовлекаться натрий-кальциевый антипорт. Также доказано, что изменение сократительных свойств неисчерченных миоцитов при угнетении натрий-протонного обмена реализуется через изменение сродства к ионам кальция регуляторных белков сократительного аппарата.
Исследование электрических и сократительных свойств ГМК НПС
Нормальный раствор Кребса, использовавшийся в опытах, имел следующий состав (мМ): NaCl - 120,4; КС1 - 5,9; NaHC03 - 15,5; NaH2P04 - 1,2; MgCl2 - 1,2; СаСЬ - 2,5; глюкоза - 11,5. Без-ЫаНСОз «Трис»-содержащий раствор приготовлялся из нормального раствора Кребса путем замены NaHCCb на Трис-аминометан - 16,6 мМ. Бескальциевый раствор готовился замещением в нормальном растворе Кребса всего СаСЬ на NaCl в соответствующей эквимолярной концентрации и добавлением ЭГТА (1,5-2 мМ), а концентрация MgCl2 увеличивалась до 12 мМ. Гиперкалиевые растворы приготавливались добавлением КС1 в нужной концентрации взамен NaCl в нормальном растворе Кребса по методике Е.Н. Тимина (Погодаев В.И., 1976) и содержал (мМ): NaCl -47,7; NaHC03 - 3,6; КС1 - 120; MgCl2 - 1,2; СаС12 - 0,4; глюкоза -11,5. Изотонический раствор КС1 содержал 166 мМ химически чистой соли. Все растворы готовились на бидистиллированной воде из солей марки ХЧ, рН растворов поддерживалась в пределах 7,3-7,35; температура в пределах 36,5-37,0С. Изотонический раствор сахарозы (108,8 г/л) готовился на деионизиро-ванной воде. Удельное сопротивление раствора было 3-5 МОм/см, а рН — 6,2. Используемые препараты: хлористый аммоний - «Реахим» (Россия); тетраэтиламмоний - «Реахим» (Россия); ацетат натрия - «Реахим» (Россия);; Трис-(гидроксиметил)-аминометан - «Reanal»; амилорид - «Sigma» (США), нитропруссид натрия - «Sigma» (США), L-NAME - «Sigma» (США),
Для исследования электрофизиологических свойств гладких мышц нижнего пищеводного сфинктера использовалась методика двойного «сахарозного мостика» в модификации Д.П. Артеменко и М.Ф. Шубы (1964, 1967, 1969) с одновременной регистрацией сократительной активности. Этот метод имеет ряд преимуществ перед микроэлектродным методом при исследовании электрофизиологических свойств гладких мышц. Одним из них является возможность длительной регистрации изменений электрических параметров ГМК, вызываемых различными воздействиями, в частности электрическим током, физиологически активными веществами, температурой и т.д. Кроме того, в условиях «сахарозного мостика» значительно легче решается задача одновременной регистрации электрической и сократительной активности гладких мышц.
Схема камеры установки двойного «сахарозного мостика» представлена на рис. 1. Сама камера изготовлена из органического стекла. Толщина сахарозных секций - 3 мм (рис. 1; 4 и 4а), ширина тестирующей секции 1 мм (рис. 1; 5). В сахарозные секции из мариотовских сосудов поступал изотонический раствор сахарозы, а в тестирующую камеру - раствор Кребса, температура которого была 3 6,5-3 7,0С Постоянство температуры тестирующего раствора поддерживалось с помощью теплообменника и ультратермостата УТ-2 (рис. 2; 5, 6). На выходе раствора из теплообменника установлен термодатчик (рис. 2; 4) марки МТ-54, который соединен с электрическим термометром (рис. 2; 7), что позволяло осуществлять постоянный контроль температуры тестирующего раствора.
Скорость подачи растворов сахарозы и Кребса регулировалась перед каждым экспериментом и составляла примерно 2,5 мл/мин. Изотоническим раствором хлористого калия заполнялась калиевая секция, которая протока не имела (рис. 1; п.п. 2 и 13).
Для уменьшения взаимной диффузии сахарозных и тестирующего растворов между сахарозными секциями и тестирующей камерой, а также калиевой и сахарозной секциями устанавливались резиновые перегородки с отверстиями (рис. 1, п. 14). Размеры отверстий в перегородках делались меньше толщины препаратов и при помещении ГМ полосок в камеру обеспечивали герметичность. Один конец препарата (рис. 1, п. 7) фиксировался в калиевой секции, а второй с помощью шелковой нити закреплялся на зажиме механотрона. Механическое растяжение ГМ полоски задавалась с помощью груза, помещаемого на конце нити, идущей к зажиму механотрона, что соответствовало примерно его исходной длине и определяло изометрический режим работы препарата (рис. 2, п.п. 11 и 12). Этот же участок ГМ полоски раздражался электрическими импульсами (рис. 1, п. 11) различной полярности и силы от 0,1 до 2 мкА. Измеряемое с помощью механотрона напряжение через эмиттерный повторитель (рис. 3) поступало на вход осциллографа С1-18 и, через усилитель, на КСП-4 (рис. 2, п.п. 8а и 9). Электрические потенциалы отводились с помощью неполяризующихся хлорсеребряных электродов (рис. 2, п. 3), сопротивление которых не превышало 1 Ком. Электроды располагались в калиевой и тестирующей секциях. От них сигнал поступал на вход высокоомного усилителя электрических сигналов (рис. 4) и далее на вход двухлучевого осциллографа С1-18 и на второй потенциометр КСП-4 (рис. 2, п. 8). Характеристики усилителя электрических сигналов: входное сопротивление - 10й Ом; входной ток - 10",: А, коэффициент усиления — 10. Раздражение ГМ полосок электрическим током осуществлялось посредством хлорсеребряных электродов, которые располагались в калиевой и тестирующей камерах (рис. 2, п. 2). Электроды через сопротивление фиксации тока в 4,5 МОм (рис. 2, п. 14) соединялись с электростимулятором ЭСУ-1, от которого подавались раздражающие прямоугольные импульсы электрического тока различной полярности продолжительностью 5 сек. (рис. 2, п. 10).
Чувствительным элементом механоэлектрического преобразователя служил механотрон 6МХ1С, включенный по мостовой схеме. Для согласования входного сопротивления измерительного моста и входного сопротивления нагрузки был использован операционный усилитель на микросхеме К140УД8А. Схема усилителя для регистрации механической активности гладкомышечных препаратов приведена на рис. 3.
Усилитель для определения параметров электрической активности гладких мышц был собран по двухкаскадноЙ схеме (рис. 4).
Визуальный контроль за параметрами электрической и сократительной активности гладкомышечных препаратов осуществлялся на экране двухлуче-вого осциллографа С1-18. Запись и регистрация электрических сигналов и сократительной активности осуществлялась с помощью самописцев КСП-4 (рис. 2, 8) со скоростью развертки 600 мм/час и фоторегистратора ФОР-2, который был соединен с осциллографом С1-18 (рис. 2,9а).
Электрические и сократительные свойства ГМК НПС
Проведенные исследования выявили определённые закономерности в изменениях параметров электрической и сократительной активности гладко-мышечных препаратов циркулярного слоя НПС. Ряд проведённых экспериментов подтверждает, что действие тока на гладкомышечные препараты нижнего пищеводного сфинктера сопровождаются развитием электротонических потенциалов. Это подтверждает точку зрения о том, что между отдельными ГМК, формирующими мышечные пучки, имеется хорошая электрическая связь, и в электрическом отношении препараты ведут себя, как проводник, обладающий переменным сопротивлением (Шуба М.Ф., 1965, 1967; Bennett V. et al., 2001; Wang Y.F. et al., 2001; Spencer N J. et al., 2002).
Анализ вольт-амперной характеристики гладкомышечного препарата, позволяет считать, что циркулярный слой мускулатуры НПС, как и другие гладкомышечные образования ЖКТ, представляют собой электрический синцитий, морфологической основой которого являются межклеточные нексусы (Шуба М.Ф., 1967; Wang Y.F. et al., 2001). Распространение возбуждения по НПС, таким образом, осуществляется посредством локальных токов, протекающих между возбужденными и покоящимися ГМК.
Вольт-амперная характеристика препаратов ГМК НПС (рис. 6) показывает, что при небольших силах раздражающего тока (до 0,17-0,2 мкА) сопротивление мембраны остается одинаковым как для катодного, так и для анодного тока, а выпрямляющие свойства проявляются при токах выше 0,3 мкА. Выпрямляющие свойства мембраны ГМК проявляются в том, что прирост амплитуды катэлектротонического потенциала заметно уменьшается в отличие от прироста амплитуды анэлектротонического потенциала. Вольт-амперная характеристика гладкомышечных препаратов в присутствии TEA, блокирующего калиевую проводимость мембраны, демонстрирует увеличениє напряжения, при котором проявляются выпрямляющие свойства мембраны ГМК, что свидетельствует о важной роли калиевой проводимости в сопротивлении мембраны.
Согласно современным представлениям, электровозбудимость ГМК обеспечивается двумя основными потенциалозависимыми ионными токами: входящим кальциевым и выходящим калиевым (Орлов Р.С., 1967; Кочемасо-ва Н.Г., 1970; Погодаев В.И., 1976; Медведев М.А., 1984; Земляков И.Ю., 1985; Студницкий В.Б., 1989; Kim S.J. et al., 1997; Bezanilla F., 2000; Cao W. et al., 2001; Szymanski P.T. et al., 2002). По кинетическим характеристикам по-тенциалозависимый кальциевый ток может быть быстрым инактивирующим-ся и медленным неинактивирующимся (Fukuta Н. et aL, 2002; Biancani P., 1998). На этом основании предполагается существование в ГМК быстрых по-тенциалозависимых инактивирующихся кальциевых каналов L-типа, которые участвуют в генерации ПД и развитии фазных сокращений, и медленных не-инактивирующихся потенциалозависимых кальциевых каналов L-типа, ответственных за развитие тонических сокращений и способных создавать входящий ток ионов кальция пока сохраняется деполяризация мембраны (Кос-ткж П.Г., 1986; Курский М.Д., 1981; Рекалов В.В., 1984; Орлов С.Н., 1987; Баскаков М.Б., 1988; Студницкий В.Б., 1989; Медведев М.А., 1992; Reynolds J.C. et al., 1982; Sohn U.D. etal., 1997; Biancani P., 1998; Salapatek A.-M.F. etal, 1998).
Полученные экспериментальные данные демонстрируют низкую электровозбудимость ГМК НПС. Аналогичная электрическая активность или её отсутствие наблюдается в ГМК фундальнои части желудка, желчного пузыря морских свинок, для которых характерен значительный вклад калиевой проводимости в суммарную ионную проводимость мембраны (Kim S.J. et al., 1997; Yamada A. et al., 1999; Kito Y. et al., 2002; Klemm M.F. et al., 2002).
Известно, что в основе выходящих калиевых токов плазматической мембраны ГМК лежат два основных типа калиевых каналов: потенциалоза-висимые калиевые каналы и кальций - активируемые калиевые каналы большой проводимости, потенциалочувствительность которых проявляется при увеличении внутриклеточной концентрации ионов кальция более 1 10-7 М (Орлов С.Н., 1987; Баскаков М.Б., 1988; Студницкий В.Б., 1989; Медведев М.А., 1992; Fox J. et al., 1979; Biancani P., 1998). При этом считается, что вклад каждой компоненты входящего и выходящего токов в суммарную проводимость мембраны неодинаков в различных типах ГМК, и разнообразие электрофизиологических свойств, таких, как возбудимость, амплитуда, длительность и форма генерируемых ПД, в основном связано с различиями в характеристиках их калиевых каналов (Орлов Р.С., 1967; Кочемасова Н.Г., 1970; Погодаев В.И., 1976; Медведев М.А., 1984; Земляков И.Ю., 1985; Студницкий В.Б., 1989; Reynolds J.C. et al., 1982; Sohn U.D. et al., 1997; Biancani P., 1998; Salapatek A.-M.F. etal., 1998).
По литературным данным, характерной особенностью мембраны ГМК НПС является то, что порог активации быстрых потенциалозависимых кальциевых каналов совпадает с порогом активации потенциалозависимых калиевых каналов (Земляков И.Ю., 1985; Reynolds J.C. et al., 1982; Sohn U.D. et al., 1997; Biancani P., 1998; Salapatek A.-M.F. et al., 1998). При этом активация быстрого входящего тока происходит практически одновременно с активацией выходящего, как это происходит в гладких мышцах фундальной части желудка морских свинок и желчного пузыря крупнорогатого скота (Kim SJ. et al., 1997; Petkova-Kirova P.S. et al., 2000; Ann S.C. et al, 2001). Результатом суммации этих двух токов является компенсирование входящей компоненты тока выходящей и как следствие этого - низкая амплитуда или даже полное отсутствие ПД. Однако, несмотря на это, количество поступающих в клетку ионов кальция во время деполяризации достаточно для развития сокращения. Ещё одной особенностью ГМК циркулярного слоя НПС является наличие высокого исходного тонуса. По мнению ряда источников (Земляков И.Ю., 1985; Reynolds J.C. et al., 1982; Sohn U.D. et al., 1997; Biancani P.,1998; Salapatek A.-M.F. et al., 1998) подобные свойства обусловлены высокой проницаемостью мембраны ГМК НПС для ионов кальция. Поступление кальция происходит через медленные неинактивируемые потенциалчувстви-тельные кальциевых каналов.
Наличие у части препаратов специфических тонических сокращений, способных проявляться и исчезать, как в условиях перфузии нормальным физиологическим раствором, так и при различных фармакологических воздействиях (рис. 7, 15), возможно, объясняется зависимостью количества открытых потенциалозависимых кальциевых каналов от функционального состояния ГМК в предстоящий период времени.
То, что сокращения мышечных препаратов зависят не только от силы, но и от длительности действия деполяризующего тока и сохраняются в течение всего времени деполяризации, подтверждает наличие в мембране ГМК НПС медленных потенциалозависимых неинактивирующихся кальциевых каналов, через которые ионы кальция поступают внутрь клеток все время, пока длится деполяризация мембраны (Reynolds J.C. et al., 1982; Sohn U.D. et al., 1997; Biancani P., 1998; Salapatek A.-M.F. et al., 1998).
Электрофизиологические свойства ГМК НПС
При использовании внеклеточных и внутриклеточных методических приёмов наблюдались различия в изменениях тонуса: при закислении цито-золя, вызванного отмывом NH4CL тонус понижался, а при снижении рН[, вызванного рН0=6,5 - повышался. Это, возможно, объясняется различиями во времени действия протонов на клеточные структуры. Так, ионы водорода при рН0=6,5 воздействуют сначала на наружную поверхность мембраны и структуры, на ней расположенные. Взаимодействие протонов с внутриклеточными структурами происходит уже тогда, когда наружные оказались модифицированными.
Сравнение результатов модификации pHt различными методами на фоне блокады калиевой проводимости мембраны тетраэтиламмонием свидетельствует о менее выраженных эффектах ацетата натрия, чем хлорида аммония. Снижение сократительной активности при действии хлорида аммония на фоне TEA было более выраженным в результате блокады калиевой проводимости, а с ней и способности ГМК частично компенсировать внутриклеточное защелачивание. Таким образом, внутриклеточное защелачивание при действии NH4CI на фоне TEA происходит до больших значений рН, чем в отсутствие тетраэтиламмония.
Действие внутриклеточного закислення и защелачивания на фоне гиперкалиевой деполяризации на параметры сократительной активности характеризовалось сходными результатами (рис. 18, 21). Это свидетельствует о том, что потенциалозависимые кальциевые каналы оказываются нечувствительны к модификации pHj при том уровне мембранного потенциала, который наблюдается при действии гиперкалиевого раствора. Действие деполяризации, вызванной ацетилхолином в условиях модификации pHj было аналогично действию деполяризации, вызванной электрической стимуляцией. Так, внутриклеточное закисление, вызванное удалением хлорида аммония из инкубационного раствора характеризовалось ростом силы сокращений, вызванных ацетилхолином. Блокада кальцийзависимых калиевых каналов клотримазолом при внутриклеточном защелачивании выразилась в полном подавлении вызванных сокращений. Внутриклеточное защелачивание, напротив, восстанавливало эти сокращения и увеличивало тоническое напряжение препаратов. Блокада глибенкламидом АТФ-зависимых К+-каналов в условиях внутриклеточного защелачивания также приводила к снижению силы вызванных сокращений и тонуса препаратов НПС. Однако снижение силы вызванных сокращений было менее выраженным, чем при действии клотримазола. Эта разница объясняется меньшим представительством АТФ-зависимого семейства в популяции К+-каналов ЖКТ. Сохранение, или рост тонического напряжения препаратов на фоне блокады различных видов калиевой проводимости в условиях внутриклеточного защелачивания, возможно, обусловлено изменением чувствительности кальциевой проводимости к внутриклеточной концентрации протонов и увеличением спонтанного кальциевого выброса из внутриклеточных депо. В литературе показано активное участие натрий-протонного и хлор-бикарбонатного обменов в регуляции внутриклеточного рН (Баскаков М.Б., 1987, 1988; Orlov S.N. et al., 2000; Shigekawa M. et al., 2001). Представлялось интересным оценить значение каждого из обменов в регуляции электрогенеза и сократительных свойств ГМК НПС. Как ранее описывалось, ингибитор натрий - протонного обмена, ами-лорид вызывает изменения электрической и сократительной активности ГМК НПС.
Сопоставляя результаты экспериментов по влиянию модификации различными методами рН; (изменяя внеклеточный рН, добавляя NH4CI или ацетат натрия в омывающий раствор) на параметры электрической и сократительной активности ГМК НПС, можно сделать заключение о их сходимости. Это выражается в следующем: во-первых, общим свойством внутриклеточного закислення ГМ НПС является активация сокращений НПС; во-вторых, внутриклеточное защелачивание, вызываемое различными способами, приводит к снижению силы вызванных сокращений. Различия в степени снижения силы вызванных сокращений при зашелачивании обусловлены различиями химической природы агентов, увеличивающих pHs. Другой причиной различий может являться не одинаковое снижение электрического сопротивления мембраны при действии хлорида аммония и ацетата натрия.
Проведенные нами эксперименты с блокадой калиевых каналов указывают на значительный вклад последних в поддержании силы вызванных сокращений в условиях внутриклеточного защелачивания. О не менее важной роли Na+/H+ - обменника говорят эксперименты с его блокатором - амилори-дом.
Подобные изменения электрофизиологических свойств и сократительной активности гладких мышц при действии амилорида указывают на то, что в этих клетках натрий - протонный антипортер оперирует и в отсутствии агентов, стимулирующих ионный переносчик. Изменения электрической и сократительной активности гладких мышц при ингибировании натрий - протонного обмена производными амилорида или в безнатриевом растворе, по мнению ряда авторов, обусловлено уменьшением калиевой проводимости мембраны (Баскаков М.Б., 1987, 1988; Berk B.C. et al., 1990; Fitzgerald R.C. et al., 1998; Duquette R.A. et al., 2001; Yeung E.W. et al., 2002).
Резюмируя вышеизложенный материал, следует заключить, что в гладких мышцах НПС, как и в ГМК сосудов, мочеточника и taenia coli активно функционирует натрий-протонный обменник. При отсутствии агентов, стимулирующих транспортер, поддерживается определённый уровень его активности в состоянии "покоя" контролирующий внутриклеточный гомеостаз протонов. Выключение натрий - протонного обмена, при действии ингибитора, приводит к изменению электрической и сократительной активности ГМК НПС. Эти эффекты, в свою очередь, обусловлены сдвигом рН; и (или) изменением калиевой проводимости мембраны. Однако, в литературе имеются сведения, что выключение натрий-протонного антипорта может вовлекать и другие механизмы, регулирующие возбудимость клетки. Так, в цепочку реакций, возникающих при модификации натрий протонного обмена, могут вовлекаться натрий-калиевый (Klein J.D. et al., 1999) и натрий-кальциевый (O Neill W.C., 1999; Rajendran V.M. et al., 1999; Orlov S.N. et al., 2000; Wakabayashi I, et al., 2001) обменники. По мнению M.P. Blaunstein (1999), ин-гибирование натрий-кальциевого обмена может быть причиной изменения механического напряжения гладкой мышцы. В регуляции электрической и сократительной активности ГМК значимым является и тот факт, что существует отчётливая рН - зависимость активации кальцийсвязывающими белками ферментов (Shu Z. et al., 1997). Нельзя исключить и вероятность прямого блокирующего действия амилорида на калиевые каналы плазмолеммы. Кроме того, обсуждая механизмы регуляции мембранного потенциала и сокращений ГМК, необходимо отметить также возможность изменения кальциевой проводимости при модуляции натрий - протонного обмена (Klockner U. et al., 1994; Piper A.S. et al., 2002).
