Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 7
2.1. Квазифрактальность биологических систем 7
2.2. Фрактальный анализ в нейробиологии 11
2.3. Моделирование самоорганизации в биологии 15
2.3.1. Биологическая самоорганизация 15
2.3.2. Самоорганизация нейрогенеза 18
2.3.3. Моделированяе самморганизации 20
2.4. Биология модельных объектов 23
2.4.1. Клетки гемальной жидкости морских беспозвоночных 23
2.4.2. Клеточные культуры и спикулогенез морского ежа Strongylocentrotus nudus 29
2.4.3. Морфология и классификация ганглиозных клеток сетчатки амфибий 32
3. Материалы и методы 40
3.1. Первичные клеточные культуры гемоцитов и эпителиальных тканей беспозвоночных 40
3.1.1. Получение первичных клеточных культур из эмбриональных клеток морского ежа Strongylocentrotus nudus 40
3.1.2. Получение первичной клеточной культуры эпителия гонады и водных легких трепанга Apostichopus japonicus 41
3.1.3. Получение первичной клеточной культуры гемоцитов моллюсков и целомоцитов иглокожих 41
3.2. Нейрональный материал 42
3.3. Морфометрия, статистическая обработка 43
4. Результаты 47
4.1. Первичные культуры гемоцитов и целомоцитов морских беспозвоночных 47
4.1.1. Культура эмбриональных клеток морского ежа Strongylocentrotus nudus 66
4.1.2. Фрактальные размерности клеточных паттернов in vitro 69
4.2. Нейроны головного и спинного мозга рыб 72
4.2.1. Корелляция значения фрактальной размерности с типом клеток 72
4.2.2. Корреляция фрактальной размерности с линейными морфометрическими показателями нейронов. Изменение фрактальной размерности нейронов вонтогенезе 75
4.3. Крупные ганглиозные клетки сетчатки 79
4.3.1. Корреляция фрактальной размерности с линейными морфометрическими показателями крупных ганглиозных клеток сетчатки опистоцентра Pholidapus dybowskii 79
4.3.2. Классификация ганглиозных клетки сетчатки саламандры Notophthalmus viridescens с использованием нелинейных морфометрических параметров 87
4.4. Моделирование нелинейных процессов биологического паттернообразования 94
4.4.1. Моделирование аггрегации 99
4.4.2. Моделирование нейрогенеза 106
5. Обсуждение 109
5.1. Нелинейные процессы элементарного паттернообразования при агрегации клеток 109
5.2. Нейроны головного и спинного мозга рыб 125
5.2.1. Корелляция значения фрактальной размерности с типом клеток 125
5.2.2. Корреляция фрактальной размерности с линейными морфометрическими показателями нейронов. Изменение фрактальной размерности нейронов в онтогенезе 134
5.3. Крупные ганглиозные клетки сетчатки 141
5.3.1. Корреляция фрактальной размерности с линейными морфометрическими показателями крупных ганглиозных клеток сетчатки опистоцентра Pholidapus dybowskii 141
5.3.2. Классификация ганглиозных клетки сетчатки саламандры Notophthalmus viridescens с использованием нелинейных морфометрических параметров 152
6. Заключение 157
7. Выводы 161
8. Список цитированной литературы 163
9. Приложение 1 183
- Клеточные культуры и спикулогенез морского ежа Strongylocentrotus nudus
- Получение первичных клеточных культур из эмбриональных клеток морского ежа Strongylocentrotus nudus
- Корреляция фрактальной размерности с линейными морфометрическими показателями нейронов. Изменение фрактальной размерности нейронов вонтогенезе
- Корреляция фрактальной размерности с линейными морфометрическими показателями нейронов. Изменение фрактальной размерности нейронов в онтогенезе
Клеточные культуры и спикулогенез морского ежа Strongylocentrotus nudus
Для количественной оценки качественных различий нейронов разработаны различные методики морфометрии (Леонтович, 1978). С этой же целью в течение последних 10-15 лет начали применять методы определения фрактальной размерности, лакунарности и другие подходы фрактальной формализации. Следует отметить, что один из давних морфометрических методов, логарифмический метод Шолла (см. Леонтович, 1978), в сущности, представляет собой способ определения фрактальной размерности. Фрактальная размерность (Mandelbrot, 1983, Федер, 1991) служит показателем заполнения фрактальной структурой топологического пространства, в котором осуществляется морфогенез этой структуры. Фрактальная размерность (Df) как силуэта, так и контура нейронов спинного мозга на плоскости, варьирующая в пределах 1.28 - 1.68, оказывается дробной, промежуточной между целочисленными значениями топологической размерности клеточного отростка как линии (Dt=l) и двумерного пространства (Dt=2), заполняемого ветвящимися нейритами. В качестве дополнительной характеристики фракталов Б. Мандельброт (Mandelbrot, 1983) ввел понятие лакунарности (Л), т.е. наличия пустот (лакун), как меры неоднородности структуры фрактала.
Фрактальный анализ неоднократно применен в нейробиологии: достаточно широко использовано определение фрактальной размерности нейронов мозга и ганглиозных клеток сетчатки (Wingate et al., 1992; Kniffki et al., 1994; Smith, Neale, 1994; Smith, Lange, 1996; Smith et al., 1996; Jelinek, Spence, 1997; Jelinek, Fernandez, 1998; Fernandez et al., 1999). Показано, что арборизация нейритов осуществляется в соответствии с фрактальными принципами самоподобия, самореферентности, причем зависимость увеличения фрактальной размерности от фактора времени нелинейна (Smith, Lange 1996). Все цитированные авторы приходят к заключению о целесообразности применения фрактальной размерности для характеристики морфологии нейронов и возможности использования этой размерности в качестве дополнительного морфологического параметра для морфофункциональной классификации нейронов и ганглиозных клеток. Утверждение критически настроенных авторов (Panico, Sterling, 1995; Murray, 1995; 2003) о том, что нейроны и сосуды сетчатки не фрактальные, а заполняющие пространство структуры, основано на недоразумении, поскольку фрактальным структурам присуще свойство частичного заполнения пространства более высокой размерности -именно поэтому их размерность не целочисленная, а дробная. Кроме того, Панико и Стерлинг демонстрируют неспособность компьютерной программы, рассчитывающей фрактальную размерность, отличать фрактальные изображения от образов, лишенных фрактальных характеристик - но в программы для определения размерности не входит задача распознавания фрактальных структур, это должны делать исследователи, а не машина.
Df ВС (другое название - размерность Колмагорова) — одна из общепринятых характеристик фрактальных мер, объединяемых под названием "фрактальные размерности" (Федер, 1991; Мандельброт, 2002). Особенности и алгоритм счета Df ВС подробно описаны во многих источниках (Falconer, 1990; Федер, 1991; Мандельброт, 2002). Df ВС является методом разбиения изображения на квадратные ячейки все меньшего размера с подсчетом числа квадратов, включающих часть анализируемой структуры, иное его название box-counting method. Df ВС нашла широкое применение как мера структурной сложности природных объектов, в том числе, нервных клеток (Morigiwa et al., 1989; Porter et al., 1991; Smith et al., 1991; Fernandez et al., 1992, 1994; Takeda et al., 1992; Smith, 1994; Cameron et al., 1999; Cannon et al., 1999; Moraes et al., 2000; Jelinek, Elston, 2001,2004; Dos Reis et al., 2002; Ristanovic et al., 2002).
ИР является компонентом мультифрактального спектра (т.н. Dq-спектра) при q = 1, характеризующим динамику пространственной регулярности (и функционально связанной с ней энтропии) фрактала как функцию масштабной шкалы (Федер, 1991; Божокин, Паршин, 2001).
Подобно ИР, Л является мерой пространственной регулярности фрактала, однако способ ее счета отличается от такового ИР (Федер, 1991), делая Л чувствительной к ротационной и трансляционной симметрии объекта (Allain, Cloitre, 1991). ИР и Л широко используются для характеристики гетерогенности структуры объектов в самых разных областях (см., например, Constantin, Procaccia, 1992; Halsey, Honda, 1994; Einstein et al., 1998; Armatas et al., 2003), однако до сих пор практически не применялись при анализе морфологии нейронов (Smith et al., 1996; Smith, Lange, 1996).
Применение для определения фрактальной размерности нейронов и ганглиозных клеток сетчатки размерности Колмагорова наряду с другими методами определения фрактальной размерности привело авторов таких исследований к заключению о близости значений фрактальной размерности нейронов, полученных разными методами (Wingate at al., 1992; Smith, Lange, 1996; Smith et al., 1996). Показано также, что одинаковыми значениями фрактальной размерности могут обладать нейроны различной морфологии, отростки которых в равной мере заполняют двумерное пространство (Smith, Neale, 1994; Smith, Lange, 1996; Smith et al., 1996). Поэтому значение фрактальной размерности, помогая количественно охарактеризовать степень сложности организации нейронов, нередко оказывается недостаточным для их классификации; в таком случае необходимо дополнительное применение других количественных параметров, например, числа ветвей первичных дендритов, топологических характеристик ветвления дендритов, показателя лакунарности (Wingate at al., 1992; Kniffki et al., 1994; Smith, Lange, 1996; Smith et al., 1996; Jelinek, Spence, 1997; Jelinek, Fernandez, 1998; Costa et al., 2002). Поскольку нейроны, как и другие квазифрактальные биологические объекты, представляют собой фракталы с неоднородным распределением точек множества, или мультифракталы, для характеристики морфологии нейронов перспективно использование методов мультифрактального анализа (Smith et al., 1996; Fernandez et al, 1999; Costa et al., 2002).
Ганглиозные клетки сетчатки, нейриты которых ветвятся практически в одной плоскости - планарная модельная система, широко используемая для определения фрактальной размерности, достигающей у этих клеток значений 1.6-1.7 (Caserta et al., 1990; Wingate et al., 1992; Jelinek, Spence, 1997; Jelinek, Fernandez, 1998; Fernandez et al., 1999). Другая планарная модель для изучения квазифрактальной организации нейронов - культивируемые в однослойной культуре нервные клетки, в частности, нейроны спинного мозга мыши (Smith, Neale, 1994; Smith, Lange, 1996;), фрактальная размерность которых варьировала от 1.2 до 1.5 у клеток разных типов, возрастая по мере их дифференцировки. Были проведены также исследования с использованием двумерных черно-белых изображений трехмерных нейронов мозга млекопитающих; значения их фрактальной размерности, полученные путем использования метода разбиения на квадраты, варьировали в пределах 1.2 -1.6 (Kniffki et al., 1994; см. также Smith et al., 1996).
Развитие дендритов изначально следует генетическому диктату, но может быть существенным образом модифицировано под влиянием множества факторов. В частности, нейротрофические факторы могут вызвать значительное возрастание числа основных (первичных) дендритов (Horch et al., 1999). Экспериментальная стимуляция вызывает быстрый морфогенез дендритов, влияя на формирование структуры дендритного дерева нейронов и их связи с другими нейронами (Kniffki et al., 1994; Malevic-Savatic et al., 1999; Albright et al., 2000). Различный паттерн дендритов обеспечивает выполнение нейронами специализированных задач (Stern, Marx, 2000; Albright et al., 2000; Hausser et al., 2000).
Получение первичных клеточных культур из эмбриональных клеток морского ежа Strongylocentrotus nudus
Перед началом эксперимента животные были промыты 2-3 раза профильтрованной морской водой, обработанной ультрафиолетом. Нерест морских ежей стимулировали инъекцией 0.5 М КС1 (0.2 - 0.3 мл) в целомическую полость. Эмбрионы на стадии бластулы были собраны на мелкий газ, промыты в искусственной морской воде без кальция и магния (CMFSS) с антибиотиками (пенициллин G, 100 ед./мл и стрептомицин, 100 мг/мл), дважды промыты в стерильной морской воде с такими же антибиотиками и диссоциированы в 0.25 % растворе коллагеназы на CMFSS (получена из печени краба Paralithodes camtschatica в ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток) в течение 20 минут при температуре 19 С (Odintsova et al., 1994). Обработанные эмбрионы были промыты в CMFSS, многократно пипетированы в этом растворе для механической диссоциации на отдельные клетки, дважды промыты в стерильной морской воде с центрифугированием при 2100 об/мин в течении 5 минут (К-23, Heinz Janetzki К.-G. Maschinebau, Engelsdorf, Германия) и профильтрованы через мелкий газ (35 мкм). Первоначально клеточная культура содержалась в модифицированной культуральной среде Лейбовица (L-15M) с добавлением 2 % эмбриональной сыворотки (Gibco Laboratories, Grand Island, NY, США), инсулина 5 мг/литр, сс-токоферолацетата 1.75 мг/литр, гентамицина 40 мг/литр (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178, США) и глутамина 100 мг/литр (Serva, Feinbiochemical,
Heidelberg, Германия). В дальнейшем было выясненено, что развитие клеток в стерильной морской воде с добавлением антибиотика в рамках моих экспериментов ничем не отличается от такового в среде Лейбовица, потому было решено перейти полностью на культивирование в морской воде. Получение первичной клеточной культуры эпителия гонады и водных легких трепанга Apostichopus japonicus.
Перед взятием ткани животные выдерживались сутки в фильтрованной, облученной ультрафиолетом воде, которую сменяли трижды. Взятая ткань также промывалась в стерильной морской воде и измельчалась. Кусочки измельчённой ткани помещались на полчаса в раствор CMFSS с коллагеназой и диссоциировались на клетки интенсивным пипетированием. Некоторые экземпляры диссоциировались только при помощи CMFSS, без добавления коллагеназы. Культура содержалась в условиях, сходных с условиями содержания клеток эмбрионов морских ежей. Клеточные культуры поддерживалась в климатической камере (18 - 19 С) в течении 2-3 недель. Получение первичной клеточной культуры гемоцитов моллюсков и целомоцитов иглокожих.
Первые эксперименты с первичной культурой гемоцитов морских беспозвоночных проводились в Институте Биологии Моря. В связи с неблагоприятной экологической обстановкой в районе города Владивостока приморский гребешок (основной и первоначальный объект исследований) вылавливаемый вблизи Института был гораздо более мелким и ослабленным по сравнению с таковым в заливе Восток, моллюски, пойманные вблизи города, нередко содержали опухоли, концентрация гемоцитов в гемолимфе и их активность была понижены. Поэтому в дальнейшем все эксперименты проводились только на морской биологической станции «Восток» ИБМ ДВО РАН.
Гемолимфу моллюсков и целомическую жидкость иглокожих шприцем переносили в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм, по 3 мл в каждую чашку. В чашках культура поддерживалась до 12 часов. В каждую чашку помещалась суспензия гемоцитов одного животного. Для наблюдения за развитием паттернов в течение первого часа с момента высаживания клеток в культуру гемоциты помещались на стандартные предметные стёкла. Микрофотосъемку эмбрионов и клеток первичных культур морского ежа, клеток эпителиев трепанга, целомоцитов и гемоцитов этих и других беспозвоночных проводили при помощи фотонасадки на микроскопе Биолам П-1 либо фотоустройства "mf-matik" на инвертированном микроскопе "Telaval" на черно-белую (микрат 200, ФоМос, Россия) фотопленку. Фотосъемку клеточных культур проводили прижизненно и на препаратах; материал фиксировали 1-2 % раствором глютаральдегида (Sigma Chemical Co., St. Luis, MO 63178 США). Культуру гемоцитов приморского гребешка фиксировали парами четырёхпроцентного формалина в течение 20 минут. Фиксированные препараты гемоцитов или целомоцитов беспозвоночных окрашивали гематоксилином.
Иммитационные модели аггрегации клеток создавали на основе DLA Java applet Анны Уманской, Центр по Изучению Полимеров и клеточного автомата, игры «Жизнь» (Johan G. Bontes, 1998).
В работе использовали выборки нейронов мозга костистых рыб опистоцентра безногого Pholidapus dybowskii, тихоокеанской кеты Oncorhynchus keta, симы Oncorhynchus masou (вентральной колонны спинного мозга, ядра тройничного нерва, медиальной ретикулярной формации, верхнего ядра шва, дорсальных рогов спинного мозга), а также ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) безногого опистоцентра Pholidapus dybowskii и взрослых особей саламандры Notophthalmus viridescens.
Исследовались рыбы обоего пола в возрасте одного и двух лет. Рыбу содержали в аквариумах с морской непроточной аэрируемой водой при температуре 15-23С, для рыб, используемых в исследовании нейронов сетчатки был создан 12-ти часовой цикл день/ночь. Человеческий материал, получен от 2 трупов скоропостижно скончавшихся людей. В выборке саламандр присутствовали особи обоего пола, длиной 5-7 см. Животные содержались в террариумах при температуре 8-12С и 12-ти часовом цикле день/ночь. Для оценки общих закономерностей распределения ГКС клетки окрашивали путём прижизненного ретроградного мечения тетраметилродамином из зрительного нерва. Для детального изучения морфологии и параметризации ГКС окрашивали методом прижизненного ретроградного мечения пероксидазои хрена из зрительного нерва с последующим проявлением метки (Adams, 1977).
Фиксацию нейронов головного и спинного мозга проводили в 4%-ном растворе параформальдегида в течение недели. Для выявления нейронов применяли классический быстрый хромо-серебряный метод Гольджи. Материал заливали в парафин, резали на ротационном микротоме в трансверсальной плоскости, далее обрабатывали по стандартной методике. Толщина срезов для всех видов составляла 50 мкм.
Клетки фотографировали и зарисовывали при помощи светового микроскопа Olympus (модель ВН2) и рисовальных аппаратов РА-6 и Carl Zeiss. Клетки сетчатки изучали на тотальных препаратах. С целью минимизации внутритиповой вариации клеточной морфологии, связанной с различиями в возрасте клеток, клетки для анализа выбирали в пределах области препарата, ограниченной двумя окружностями с центром в оптическом диске и с радиусами в 1/3 и 2/3 радиуса сетчатки.
Корреляция фрактальной размерности с линейными морфометрическими показателями нейронов. Изменение фрактальной размерности нейронов вонтогенезе
Для выявления и описания самоорганизующихся пространственных клеточных паттернов была изучена агрегация в кратковременной культуре нескольких типов клеток морских беспозвоночных, рассмотрены механизмы образования паттернов; для описания фрактальных характеристик клеток и их ансамблей рассчитаны средние значения их фрактальных размерностей. Для построения компьютерных имитаций паттернов, образуемых клетками в культуре, применены такие модели хаотичной самоорганизации, как модель Агрегации, Ограниченной Диффузией (DLA) и модель «Жизнь» Конвея (J.Conway), относящаяся к классу клеточных автоматов.
В первичной однослойной культуре изучалось образование пространственных паттернов клетками нескольких видов иглокожих: морских звезд Patiria pectinifera, Asterias amurensis, Evasterias retifera, Distolasterias nipon, трепанга Apostichopus japonicus, морского ежа Strongylocentrotus nudus и двустворчатых моллюсков: Mizuhopecten yessoensis, Mytilus trossulus, Crassostrea gigas.
Наиболее подробно изучена динамика агрегации и морфогенеза in vitro гемоцитов приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis. Ранее было показано, что в кратковременной первичной культуре гемоцитов этого вида присутствие в среде гомологичной сыворотки гемолимфы способствует агрегации гемоцитов, то есть преимущественно межклеточной адгезии, а добавление гетерологичной сыворотки ведёт к преобладанию адгезии к субстрату и, соответственно, распластыванию и миграции гемоцитов. При исследовании морфогенеза в среде гомологичной гемолимфы выявлено несколько стадий, регулируемых различными механизмами:
Рост конгломератов в суспензии. В организме здорового неповрежденного животного гемоциты находятся в виде суспензии отдельных, не связанных друг с другом, клеток; межклеточная адгезия между гемоцитами гребешка столь сильна, что агрегация гемоцитов начинается непосредственно при вскрытии гребешка и взятии гемолимфы. 2. Прикрепление и рост агрегатов на дне. После перенесения гемолимфы в чашку Петри одновременно с продолжающейся агрегацией происходит осаждение агрегатов, и через 3-5 минут (с начала вскрытия животного) наблюдаются лежащие на дне чашки уплощенные рыхлые агрегаты различного размера и разнообразной причудливой формы ( рис. 5 ). Таким образом, наблюдение агрегации гемоцитов в тонком слое гемолимфы при оседании на дно чашки формирующихся агрегатов дает возможность рассматривать данную экспериментальную систему как двумерную. На дне конгломераты продолжают расти и объединяться за счёт оседания клеток из суспензии. Осевшие на дно клетки распластываются, мигрируя и объединяясь в новые мелкие конгломераты или присоединяясь к уже существующим. 3. Сокращение. Через некоторое время присоединение новых клеток к конгломерату заканчивается. Становится заметным сокращение конгломерата. Происходит отрыв ветвей крупных агрегатов, «втягивание» ветвей и осферивание всей структуры. Вокруг агрегатов сохраняется ореол их прежних очертаний, образованный одиночными клетками, оставшимися прикреплёнными ко дну после сокращения агрегата. Последовательная покадровая микрофотосъемка одного и того же поля зрения выявляет активное сокращение и компактизацию клеточных агрегатов (рис. 6-7). Длительность фазы сокращения, компактизации и осферивания агрегатов зависит от размера последних: 30 мин - 1 час для мелких агрегатов, 2 - 3 часа для крупных. 4. На последней стадии всё дно чашки Петри хаотично усеяно по большей части шарообразными конгломератами разного размера, прикрепленными к поверхности дна филоподиями подлежащих конгломераты клеток. В агрегатах происходят процессы синтеза материала внеклеточного матрикса и формирование под его поверхностью концентрических клеточных слоев. Множество одиночных клеток распластано по дну. Через сутки начинается деградация конгломератов: сначала осыпаются клетки внешнего слоя, потом агрегаты и одиночные клетки открепляются от поверхности субстрата. Первая и вторая стадии протекают сходным образом также в суспензии гемоцитов двух других видов рассмотренных моллюсков, мидии Mytilus trossulus и устрицы Crassostrreas gigas. Удивительно похожие разветвлённые конгломераты образуются при эксплантации в культуру различных типов клеток, принадлежащих разным видам морских беспозвоночных, в частности, гемоцитов перечисленных двустворчатых моллюсков и клеток диссоциированных эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus nudus (рис. 8).
Причина этого сходства в единстве процессов образования агрегатов, включающих в себя два простых явления: хаотичное перемещение клеток, пассивное в суспензии или активное движение на субстрате, и их адгезия, слипание. Варьирование интенсивности какого-либо из этих процессов и наложение влияния других, более частных факторов, даёт в результате спектр форм тех принципиально сходных конгломератов, которые мы наблюдали у морских беспозвоночных.
Конкурентные отношения межклеточной адгезии гемоцитов и их прикрепления к субстрату в процессе сокращения агрегатов отчетливо выявляет применение сканирующей электронной микроскопии: очевидно натяжение прикрепленных к субстрату гемоцитов по краям агрегата, почти разрывающихся между двумя точками прикрепления (рис. 9), а также активное натяжение гемоцитов, образующих мостик между соседними агрегатами (рис. 10). Последовательная микрофотосъемка одного и того же поля зрения показывает сближение и слияние первоначально обособленных агрегатов, соединяемых мостиком гемоцитов.
В случае возникновения крупных разветвленных агрегатов контрактильная сила, сопоставимая с мышечной, отрывает о субстрата периферические ветви, стягивая их в единую компактную массу. Линейные размеры агрегатов в процессе сокращения и осферивания уменьшаются в несколько раз. Проявления столь выраженной конкурентности отношений между силами взаимодействий «клетка-клетка» и «клетка-субстрат» возможны лишь при наличии твердого недеформируемого субстрата. По-видимому, в организме моллюска агрегат функционирует сначала как тромб, закрывающий отверстие раны, затем сокращение сгустка гемоцитов, по периферии одновременно прикрепленных к внеклеточному веществу и/или клеткам раневой поверхности, обеспечивает стягивание краев раны.
Корреляция фрактальной размерности с линейными морфометрическими показателями нейронов. Изменение фрактальной размерности нейронов в онтогенезе
В однослойных культурах фибробластов или миобластов такая пространственная самоорганизация на плоскости спонтанно развёртывается в процессе игры сил контактного ингибирования движения клеток и линейной контактной ориентации клетка-клетка, что приводит к локальному параллельному расположению биполярных клеток. Культуры гемоцитов гребешка, целомоцитов морского ежа и миобластов часто трудно отличить друг от друга, миобласты имеют лишь немного большую адгезию к субстрату, покрывая его сплошным слоем с упорядоченными клеточными потоками вокруг конгломератов.
Что касается клеток бластул морского ежа, то их сходство со всеми рассматриваемыми клеточными типами заканчивалось на стадии агрегации. После образования агрегатов, подобных скорее агрегатам эпителиальных клеток при сравнительно невысокой клеточной плотности и разветвлённых агрегатов, общих для любых клеток, взятых в очень высокой концентрации и имеющих межклеточную адгезивность, превышающую адгезию к субстрату, начиналась бластуляция. Мезенхимные паттерны здесь образовывали только выселявшиеся мезенхимные клетки (рис. 22). При столкновении клеточных потоков возникают планарные паттерны с топологическими сингулярностями. Подобное спонтанное структурирование в однослойной культуре обнаруживается также при агрегации клеток акразиевого миксомицета Dictyostelium discoideum. В культуре эпидермальных клеток человека наблюдается развитие спиральных завитков, сходных с картинами дерматоглифики, порождаемыми in vivo в ходе дифференциации этих клеток в составе тканевой и организменной систем. Однако, топологические сингулярности, сходные с паттернами дерматоглифики (петли, дуги) возникают и в однослойной культуре миобластов, фибробластов, то есть клеток внутренней среды организма, пространственная организация которых in vitro существенно отличается от наблюдаемой в организме (Исаева, 1994). В таких случаях клетки in vitro выходят за рамки диктуемой организмом программы создания надклеточных пространственных паттернов, степень свободы самоорганизующихся культивируемых клеток и их ансамблей оказывается выше, чем в организме.
Таким образом, гемоциты in vitro в условиях, способствующих прикреплению клеток к искусственному двумерному субстрату, проявляют характерную для всех клеток однослойных культур тенденцию к плоскостной контактной ориентации и созданию структурных паттернов. Картины структурирования клеточного слоя включают в себя все паттерны и клеточные типы, характерные для фибробластоподобных клеток. Линейность клеточных мостиков, соединяющих агрегаты по кратчайшему расстоянию между ними, по-видимому, определяется механизмом натяжения этих клеточных тяжей и отдельных составляющих их клеток. Прикрепление и распластывание in vitro гемоцитов и других макрофагоподобных клеток позвоночных сходно, по сути, с фагоцитарной функцией и может рассматриваться как попытка фагоцитировать слишком крупное инородное тело. Целесообразный итог такой реакции в организме - инкапсуляция инородного тела, удаление которого путём фагоцитоза невозможно.
После фазы оседания и хаотической агрегации неправильной формы конгломераты гемоцитов моллюсков начинают сокращаться и принимать более правильные округлые очертания. При этом при сокращении конгломератов гемоцитов гребешка на стекле остаётся множество клеток. Этот клеточный след очерчивает собой изначальные границы конгломерата. Натяжение филоподий клеток, связывающих конгломераты с субстратом, определяется конкуренцией адгезии клетка-клетка и клетка-субстрат, что при сокращении конгломерата разрешается для некоторых клеток в пользу адгезии к субстрату (возможно, тех, основная масса клеточного тела которых, включающая ядро, распластана по субстрату, а к конгломерату протянуты отдельные филоподий; множество таких клеток, окружающих конгломерат, хорошо видно при исследовании с помощью сканирующего микроскопа, эти клетки явно при сокращении конгломерата остаются на субстрате). Сокращение конгломерата приводит к отрыву этих клеток, интегрированная сила сокращения клеток конгломерата оказывается больше силы филоподиального натяжения подлежащих клеток, связывающих конгломерат с субстратом. Сцепление же самих подлежащих клеток с субстратом оказывается выше, чем сцепление с клетками конгломерата. В процессе сокращения накапливается критическое натяжение, которое часто резко отрывает конгломерат от субстрата, переводя его в следующую фазу осферивания. Образование конгломерата на двумерном субстрате in vitro, как было отмечено выше, является модифицированной in vitro реакцией тромбообразования. Развитие же такого механического натяжения тромба, очевидно, стягивает края раны. Интенсивность сокращения, несомненно, свидетельствует о надклеточной интегрированной деятельности цитоскелета гемоцитов, подобной «гистоскелету» эпителиальных пластов или, с онтогенетической точки зрения, этот процесс можно описать как неспецифическое подобие гемоцитов сокращающимся гладкомышечным клеткам 60 и гладкомышечные клетки, и гемоциты, да и клетки поперечно-полосатой мускулатуры суть производные линии соединительно-тканных фибробластоподобных клеток. Сокращение до стадии сфер наблюдалось только в культурах гемоцитов некоторых видов моллюсков, таких как гребешок Mizuhopecten yessoensis, мидия Mytilus trossulus, устрица Crassostrea gigas. На рис. 23 - уже осферившийся агрегат гемоцитов устрицы.
Единственный след, оставшийся от нелинейной фазы конгломератообразования на этой стадии - хаотическое расположение на дне чашки Петри конгломератов, имеющих хаотично вариабельные размеры (рис. 24). Этот след, обусловленный случайным распределением точек инициации агрегации в трёхмерном прострнстве, (в двумерной проекции осевших на стекло агрегатов) подобен росту бактериальных колоний или процессу фазового перехода вещества (конденсация пара, кристаллообразование). Эта хаотичность закрепляется вместе с фиксацией агрегатов на поверхности дна чашки Петри. Зрительно картина случайного распределения конгломератов по поверхности поразительно подобна одному из мандельбротовских фракталов: «швейцарскому сыру» (рис. 25-26) (Mandelbrot, 1983). Фрактальная размерность фрактала на рисунке 25 составляет 1,99; на рисунке 26: 1,9.
Прикрепившиеся к субстрату гемоциты визуализируют прежние очертания агрегата, прикрепившегося ко дну пластиковой чашки Петри; активной же миграции гемоцитов из сферического агрегата (либо по направлению к нему) не наблюдали. Встречающиеся в литературе утверждения о выселении клеток из агрегатов гемоцитов моллюсков (например, Suzuki et al., 1991) лишь изредка подкреплены данными микрокиносъемки (Partridge, Davies, 1974) или иными наблюдениями динамики клеточного поведения; недостаточно аргументированным кажется и представление о миграции гемоцитов по направлению к агрегату (Reade, Reade, 1976). Исследование динамики агрегации гемоцитов гребешка показывает, что активное сокращение клеточного агрегата с возникновением ореола окружающих его клеток как отпечатка исходных очертаний прикрепившегося к субстрату агрегата дает в результате картины, имититующие направленную миграцию гемоцитов (из агрегата или к агрегату).
