Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы. Современные подходы к экспериментальному пролонгированию жизни 8
Глава 2. Цель, объект и методы исследования 49
Глава 3. Возрастные особенности некоторых показателей, характеризующих функциональное состояние организма 62
3.1. Сравнительная характеристика выживаемости, средней и максимальной продолжительности жизни линейных (Вистар) и беспородных крыс 65
3.2. Возрастные особенности интенсивности общего газообмена 71
3.3.Возрастные особенности температуры тела 74
3.4.Возрастные особенности содержания ионов кальция и магния в эритроцитах и плазме крови 77
3.5.Возрастные особенности морфологического состава периферической крови 82
3.6.Возрастные особенности осмотической резистентности эритроцитов 87
3.7.Возрастные особенности спонтанной двигательной активности 92
3.8.Возрастные особенности максимальной физической работоспособности 96
3.9.Возрастные особенности суммационно-порогового показателя 99
3.10.Обсуждение результатов и выводы 102
Глава 4. Влияние декстрамина на продолжительность жизни и некоторые показатели функционального состояния организма 115
4.1. Определение токсической дозы LD o декстрамина у животных разного возраста 118
4.2.Влияние декстрамина на продолжительность жизни 121
4.3.Влияние декстрамина на некоторые показатели функционального состояния организма 129
4.3.1.Максимальная физическая работоспособность 130
4.3.2.Спонтанная двигательная активность 132
4.3.3.Интенсивность общего газообмена 134
4.3.4.Осмотическая резистентность эритроцитов 136
4.3.5.Количество лейкоцитов в крови 137
4.3.6. Концентрация общих липидов, свободного холестерина, атерогенных липопротеидов в крови и в тканях органов крыс 138
4.4. Обсуждение результатов и выводы 145
Глава 5. Влияние оливомицина на продолжительность жизни и некоторые показатели функционального состояния организма 155
5.1. Влияние оливомицина на продолжительность жизни 157
5.2. Влияние оливомицина на некоторые показатели функционального состояния организма 164
5.2.1.Максимальная физическая работоспособность 165
5.2.2.Спонтанная двигательная активность 167
5.2.3.Интенсивность общего газообмена 169
5.2.4.Осмотическая резистентность эритроцитов 171
5.2.5.Количество лейкоцитов в периферической крови 173
5.2.6.Возрастная динамика массы тела 175
5.2.7.Концентрация общих липидов, свободного холестерина, атерогенных липопротеидов в крови и тканях органов крыс 177
5.3. Обсуждение результатов и выводы 182
Заключение 190
Выводы 204
Список литературы 206
- Сравнительная характеристика выживаемости, средней и максимальной продолжительности жизни линейных (Вистар) и беспородных крыс
- Возрастные особенности интенсивности общего газообмена
- Определение токсической дозы LD o декстрамина у животных разного возраста
- Влияние оливомицина на продолжительность жизни
Введение к работе
Актуальность проблемы. Раскрытие фундаментальных механизмов старения стало основой целенаправленного поиска методов экспериментального пролонгирования жизни. В этом направлении проведен ряд успешных попыток увеличить продолжительность жизни с помощью сдерживающего рост питания, антиоксидантов, комплексных витаминных препаратов, а также физических и других факторов /Никитин, 1961, 1982 ; Эмануэль, 1975 ; Фролькис и др., 1976,1982 ; Бердышев, 1976 ; Западнюк и .пр., 1980 ; Обухова, 1982 ; Брехман и др., 1972,1976 ; lie Сеу , 1934,1956 ; Hex-man , 1971,1978 ; Comfort ,1971 ; Shima et al. ,1980,и др.).
Оценка эффективности геропротекторов проводится, как правило, с помощью статистических показателей, характеризующих степень влияния этих средств на продолжительность жизни. Одаако для получения объективной оценки действия геропротекторов недостаточно только этих данных. Современному исследователю важно знать, какой ценой достигается продление жизни, как при этом изменяется биологический возраст и отдельные физиологические, биохимические и другие параметры, характеризующие функциональное состояние организма. Это имеет особое значение в аспекте адаптационно-регуляторной теории В.В.Фролькиса /1969-1982/, согласно которой в ходе онтогенеза наряду со старением - процессом разрушительным, направленным на ограничение адаптационных возможностей организма и сокращение продолжительности жизни, развивается процесс витаукта, повышающий жизнеспособность и увеличивающий приспособительные возможности организма.
Как известно, различные функциональные и метаболические
- S -
параметры неодинаково изменяются в процессе возрастного развития /Аршавский, 1982 ; Богацкая, 1982 ; Калимая, 1980,1982 ; Cutler ,1979 ', Borkan, Norris , 1980 ; Shock , 1981/. При характеристике эффективности действия геропротекторов принципиальное значение имеет исследование показателей, которые коррелируют с возрастом и определяются при жизни животного. Вместе с тем, исследователи до самого последнего времени не располагают набором стандартных тестов, с помощью которых можно было бы оценить эффективность действия геропротекторов, не ожидая вымирания всей выборки подопытных животных.
В соответствии с последними представлениями, первичные механизмы старения связаны с молекулярно-генетическими изменениями, нарушениями в генетическом аппарате клетки /Бердышев, 1968, 1982 ; Ващшин, Бердышев, 1977 ; Никитин, Бердышев, 1982 ; Cutler , 1976 ; Chetsanga et al. , 1977 ; Gaubatz et al, 1979/. Это обосновывает перспективность поиска эффективных геропротекторов среди ингибиторов биосинтеза белка /Фролькис и др.,1976, 1979,1980/.
С целью увеличения продолжительности жизни в последние года широко используются ингибиторы свободаорадакальных реакций - антиоксиданти /Эмануэль, 1973,1976 ; Обухова,1975, 1982 ; Harman , 1956,1960,1971 ; ^appel et al.f 1973 І Bjorksten, 1974 ; Miquei, Economos f 1979/. Однако эффективность действия разных антиоксидантов неодинакова. Кроме того, результаты многих исследований нередко носят противоречивый характер. Это обуславливает необходимость исследования новых отечественных антиоксидантов с высокой эффективностью геропротекторного действия.
Вот почему для современной геронтологии,наряду с поиском новых перспективных средств продления жизни, актуальным являет-
ся иследование функциональных и метаболических параметров, которые в комплексе с показателями выживаемости могли бы быть основой для объективной оценки эффективности действия геропротекторов и, возможно, «для характеристики биологического возраста животных.
Цель и задачи исследования» Цель настоящей работы изучить комплекс физиологических параметров, которые могли бы быть использованы для оценки эффективности действия геропротекторов и исследовать влияние ингибитора транскрипции - оливомицина и антиоксиданта - декстрамина на продолжительность жизни и функциональное состояние организма животных.
В соответствии с этим были определены следующие задачи:
Сопоставить возрастную .динамику изменения ряда функциональных и метаболических параметров и отобрать из них наиболее тесно коррелирующие с возрастом крыс для последующего использования этих показателей при оценке эффективности геропро-текторного действия оливомицина и декстрамина.
Изучить влияние ингибитора биосинтеза белка - оливомицина на продолжительность жизни и возрастные изменения функционального состояния организма.
Изучить влияние антиоксиданта декстрамина на продолжительность жизни и возрастные изменения функционального состояния организма.
Основные положения, выносимые на защиту:
Установлен комплекс функциональных и метаболических параметров, которые закономерно изменяются в процессе старения и могут быть использованы для объективной оценки эффективности действия геропротекторов.
- 7 -Ингибитор биосинтеза белка - оливомицин, антиоксидант -
декстрамин увеличивают среднюю и максимальную продолжительность жизни и замедляют темп развития возрастных изменений функционального состояния организма.
Научная новизна. В работе изучено возрастную динамику изменения ряда функциональных и метаболических показателей, с помощью которых можно оценить эффективность действия геропротекторных средств.
Впервые показано, что блокатор синтеза белка - оливомицин и антиоксидант - декстрамин,наряду с увеличением средней и максимальной продолжительности жизни крыс, замедляют с разной степенью выраженности развитие возрастных изменений некоторых функциональных и метаболических параметров.
Теоретическое и практическое значение. Результаты проведенных исследовании имеют важное теоретическое и практическое значение, так как являются основой для поиска новых эффективных средств увеличения продолжительности жизни и могут быть использованы для оценки эффективности действия геропротекторных средств.
Сравнительная характеристика выживаемости, средней и максимальной продолжительности жизни линейных (Вистар) и беспородных крыс
Как уже отмечалось, эффективность действия геропротекто-ров оценивается по целому ряду показателей, характеризующих выживаемость и подолжительность жизни подопытных и контрольных животных. Вот почему на первом этапе работы представлялось необходимым изучить эти показатели у интактных крыс, с тем, чтобы исследование геропротекторных свойств оливомицина и декстрамина проводить на животных с заведомо известной продолжительностью жизни.
Поскольку в геронтологических, так же как и в других медико-биологических исследованиях, наиболее популярными являются линейные и беспородные крысы, в работе было изучено выживаемость, среднюю и максимальную продолжительность жизни крыс двух популяций. С этой целью в течение постнатального онтогенеза регистрировались результаты спонтанного вымирания 100 беспородных и 100 инбредных крыс-самцов линии Вистар.
Результаты выживаемости интактных крыс представлены на рис.3.1. Из рисунка видно, что, несмотря на одинаковые условия содержания, в течение всего периода наблюдений выживаемость линейных крыс была несколько ниже, чем беспородных особей.
Обращает на себя внимание, что подобный уровень спонтанной смертности прослеживается при анализе данных, характеризующих вымирание этих животных (рис.3.2). Как видно из рисунка, в первые недели постнатального онтогенеза отмечается сравнительно высокая смертность крыс. Так, в возрастном периоде от одних суток со дня рождения и до одного месяца этот показатель составляет для обоих популяций 14$. Однако в возрасте I-I6 месяцев наблюдается относительно низкая и стабильная скорость вымирания животных {2-4$) При этом необходимо указать, что смертность среди линейных особей все же на 1,3$ больше, чем среди беспородных крыс» Из .данных рис,3.2 видно, что после 16-21-ме-сячяого возраста происходит существенное увеличение смертности как линейных, так и беспородных животных, в среднем, до 15-20$.
Высокий уровень смертности крыс обеих популяций наблюдается на всех последующих этапах позднего онтогенеза. Важно отметить, что уровень смертности линейных особей на 5-9$ превышал (на грани достоверности) таковой беспородных животных.
Наряду с этим была проведена с помощью уравнения Гомпер-ца количественная характеристика кривых вымирания линейных и беспородных крыс (рис.3.3). Из рисунка видно, что в координатах iBR и t смертность животных выражается прямыми следующего вида: для крыс линии Вистарш = 0,936 + 0,0931 t ; для беспородных In Rt = 0,723 + 0,0969 t .
Таким образом, несмотря на одинаковые условия содержания животных двух популяций, смертность на начальных этапах онтогенеза выше у линейных особей - R0 = 2,55 по сравнению с беспородными, где \ =2,06. При этом следует указать, что полученные результаты согласуются с данными литературы /Шахбазов, 1970 ; БерДШЄВ,І979 ; Gordon et al. ,1966 ; Hollander , 1979/, в соответствии с которыми линейные гомозиготные животные более подвержены воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, чем беспородные особи.
В результате неодинаковой скорости вымирания линейных и беспородных крыс отличаются некоторые показатели продолжительности жизни этих животных. Так, из табл. 3.1 видно, что максимальная продолжительность жизни беспородных особей в среднем на I месяц больше, чем линейных крыс. Вместе с тем средняя продолжительность жизни линейных животных достоверно не отличается от таковой радомбредных крыс.
Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что продолжительность жизни линейных крыс существенно не отличается от продолжительности жизни беспородных особей. Однако линейные животные, как известно, отличаются от радомбредных более однородным генотипом, а следовательно и стабильной ответной реакцией на изучаемое воздействие. Все это позволяет считать целесообразным использование в дальнейших исследованиях лабораторных крыс линии Вистар.
Возрастные особенности интенсивности общего газообмена
В литературе уже давно обсуждается вопрос о соотношении между уровнем энергетических процессов, интенсивностью основного обмена и старением организма. Еще в 1908 году Рубнер /ниъ-пег / сформулировал известное представление о том, что существует взаимосвязь между энергетическими тратами и видовой продолжительностью жизни - чем большие энергетические траты, тем меньшая продолжительность жизни. Критический обзор этих представлений может быть найден в работах И.А.Аршавского /1975,1982/, А.И.Зотияа /1974,1982/ и .других исследователей /&уэр, 1935 ; Терентьев, 1947 ; Рубин, 1976 ; Шмидт-Нильсен / Schmidt Kiison, 1976/.
В последние годы довольно подробно изучены также механизмы возрастного изменения энергетических процессов в разных органах и тканях /Фролькис, Богацкая, 1965; Богацкая, 1964,1968, 1981 ; Богацкая и др., 1965,1982 ; Литошенко, Новикова, 1976 ; Никитин, 1978 ; Калиман и др.,1980-1982/. Вместе с тем, несмотря на большой фактический материал, до сих пор во многом остается неясным вопрос о характере ж направленности изменения энергетического и основного обмена в процессе старения. Наряду с этим бесспорным представляется то, что одним из суммарных показателей основного обмена является общий газообмен.
В этой связи следует указать, что целым рдцом клинических /Муравов, 1969,1976; Иванов, 1970,1980 ; Ярошевич, 1973 ; Аринчин, Ярошевич,1975 ; Чеботарев, 1979 ; Astrand ,1960,1968 ; Возжег, 1968 ; Kasser, Bruce , 1969/ и экспериментальных работ /Ники -тин, Клименко, 1962 ; Успенский, Цейтлина, 1968 ; Хабибулов, Са дуакасов,1975; Daiderup et ai.t 1972/было показано изменение интенсивности общего газообмена при старении человека и животных. Однако исследование интенсивности газообмена у животных в процессе онтогенеза, включая и поздний период,ранее никем не проводилось.
Исходя из этого, представлялось целесообразным провести систематическое исследование характера и динамики возрастных сдвигов интенсивности общего газообмена крыс с целью выявления возможности использования этого показателя для характеристики функционального состояния организма при оценке эффективности действия геропротекторов.
Результаты исследования возрастных особенностей общего газообмена крыс представлены в табл.3.2. Из данных таблицы видно, что с возрастом животных происходит изменение общего газообмена. Самая высокая интенсивность потребления кислорода обнаружена у крыс в возрасте I месяц (молодые особи). Затем этот показатель достоверно (р 0,05) снижается, достигая наименьших значений у старых животных. Так, если у одаомесячных крыс интенсивность газообмена принять за І0С$, то у 36-месячных этот показатель уменьшается почти на 4($. При этом следует указать, что наименьшие сдвиги уровня газообмена наблюдаются в возрастном периоде с 6 до 12 месяцев, т.е. в фазе стабильного роста животных. Однако во всех последующих периодах и особенно во второй половине онтогенеза исследуемый показатель равномерно снижается с возрастом, при этом коэффициент корреляции составляет -0,89.
Как видно из табл.3.2, коэффициент вариации для этого показателя колеблется от 9,8$ у молодых особей до 28,5$ у старых. В соответствии с современными требованиями, предъявляемыми к статистической обработке результатов исследований, такая .дисперсия индивидуальных отклонений от среднего значения показателя считается незначительной.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что интенсивность общего газообмена равномерно снижается в пост-натальном онтогенезе и лишь в зрелом возрасте животных наблюдается незначительная стабилизация исследуемого показателя. Бее это позволяет считать суммарный показатель основного обмена информативным тестом для характеристики возрастных сдвигов функционального состояния организма.
Как было нами установлено, в процессе старения происходит постепенное снижение интенсивности общего газообмена, свидетельствуйте е об уменьшении уровня основного обмена, в то же время в раде работ показано, что между интенсивностью основного обмена организма и его температурой существует тесная взаимосвязь /Соболь, 1974 ; Пекач, 1975 ; Россомахин, 1976 ; Подопри-гора, 1978/. Кроме того, из .данных литературы известно / кп -ler, Johnson , 1966 ; Xunis et al. , 1974/, что у грызунов при естественном старении происходит снижение средней температуры тела. Однако систематическое исследование возрастного изменения температуры тела с целью изучения возможности использования этого показателя для определения биологического возраста и оценки эффективности геропротекторного действия ранее никем не проводилось.
Определение токсической дозы LD o декстрамина у животных разного возраста
Для установления токсической дозы LD Q декстрамина были использованы радомбредные мыши - самцы двух возрастов - взрослые пяти- и старые 24-месячные животные.Б соответствии с условиями методики /Беленький,1963/» каждая возрастная группа была разделена на 10 подгрупп по 6 особей, причем в каждой возрастной группе 10 мышей служили контролем.
Необходимо отметить, что, поскольку декстрамин в чистом виде трудно растворяется в воде, для инъекций ГОТОВИЛСЯ 6/&-ВЫЙ водный раствор хлористоводородной соли декстрамина. Препарат вводился внутрибршинно в дозах нарастающей концентрации - от 750 до 1300 мг на I кг массы животного с учетом, чтобы каждая из этих доз прошла испытание на одной из 10 подгрупп мышей разного возраста.
Токсические явления развивались через 7-8 минут после введения летальных доз декстрамина. В клинической картине отравления отмечалось .двигательное беспокойство, возбуждение дыхания, тремор, переходящий затем в судороги, заканчивающиеся смертью животного. Если вслед за судорогами не наступила смерть, то животные продолжительное время оставались адияамичными. Спустя 3-4 часа эти мыши почти ничем не отличались от контрольных особей.
В качестве контроля 20 особям обеих возрастных групп вводился внутрибрюшинно изотонический раствор хлористого натрия в тех же объемах. Бее контрольные животные легко переносили инъек ции физиологического раствора и не погибали, за исключением одной пятимесячной особи.
Погибшие животные подопытных и контрольных групп подвергались секции. При обнаружении в брюшной полости скопления крови,, возникшей вследствие случайного прокола сосуда инъекционной иглой, животные исключались из опыта и вместо погибших брались другие мыши.
Частота смертных исходов, возникших под воздействием токсических доз декстрамйна, и результаты статистической обработки полученных данных в двух возрастных группах животных представлены в таблицах 4.1 и 4.2.
На основании данных, представленных в таблицах 4.1 и 4.2, строились графики на бумаге с логарифмически-пробитной сеткой. После ряда исправлений (предусмотренных методикой) и проверки соответствия проведенной прямой нанесенным на график точкам, определялась токсическая доза LD 0 и ее доверительные границы.
В результате проведенных исследований установлено, что токсическая доза декстрамйна - LD 0 .для пятимесячных животных составляет 990 (943 + 1037) мг/кг, для 24-месячных -900 (766 1034) мг/кг.
Полученные «данные свидетельствуют о том, что декстрамин, в соответствии с требованиями фармакопеи /Западнюк, 1977/, относится к малотоксичным соединениям. Как видно из таблиц, смертности молодых и старых мышей, величина токсической дозы LD50 препарата существенно не зависит от возраста животных.
Таким образом, низкая токсичность декстрамйна позволяет рекомендовать его для использования в широком «циапазоне терапевтических доз. Кроме того, отсутствие достоверных возрастных различий в чувствительности мышей к действию антиоксиданта свиде В соответствии с программой исследований, геропротектор-ные свойства декстрамина оценивались по результатам его влияния на целый ряд статистических показателей, характеризующих выживаемость, среднюю и максимальную продолжительность жизни.
С этой целью декстрамин вводился крысам per os в дозе 100 мг на I килограмм массы животного, что составляет, в среднем, десятую часть LD50 . для получения полной и системной характеристики влияния препарата на смертность крыс -в течение всех 12-ти курсов (16 месяцев) эксперимента, полученные «данные представили по 100-дневным возрастным периодам животных.
Как видно из представленных .данных (табл.4.3), под влиянием декстрамина смертность крыс уменьшается. Обращает на себя внимание, что по мере увеличения количества курсов введения препарата наблюдается все более выраженное снижение смертности и увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем. Так, если к концу первого 100-дневного периода различие в количестве выживших интактных и подопытных крыс составляет всего 2%, то уже к концу второго и третьего периодов этот разрыв увеличивается соответственно до 9 и 13$. Еще большее влияние дек-страмин оказывает на вымирание животных в пятом возрастном периоде, где разность в выживаемости между контролем и опытом достигает 15$.
Важно подчеркнуть, что к концу шестого периода наблюдений, т.е. к 1199-ому даго, погибают все контрольные крысы, в то время как под влиянием декстрамина остались в живых 12 особей -24$ от общей выборки. Последние животные из подопытной группы погибают только к концу седьмого возрастного периода, т.е. на 100 дней позже контрольных особей.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что под влиянием курсового введения декстрамина происходит значительное снижение смертности животных по сравнению с контрольными особями. Причем, более выраженная эффективность действия декстрамина установлена по мере увеличения количества курсов введения препарата.
Влияние оливомицина на продолжительность жизни
Как уже указывалось (см. главу 2), оливомицин вводился животным курсами по 10 дней с перерывом I месяц. Определение эффективности действия оливомицина проводилось по схеме, аналогичной изучению геропротекторных свойств декстрамина. Исходя из этого, в настоящем фрагменте работы представлены результаты исследования влияния курсового введения оливомицина на целый ряд статистических показателей, характеризующих выживаемость, среднюю и максимальную продолжительность жизни лабораторных крыс.
Полученные данные (табл.5.1) свидетельствуют о том, что под влиянием оливомицина уменьшается гибель животных во всех возрастных периодах наблюдения. Так, к концу первого периода, т.е. после двух курсов введения препарата, происходят сдвиги в изменении смертности крыс. В этом возрастном периоде различие между вымиранием контрольных и получавших оливомицин животных составляет 6$. По мере увеличения количества курсов введения препарата происходит постепенное, но существенное снижение смертности особей. Как видно из представленных в табл.5.1 «данных, уже к концу второго периода наблюдений, т.е. после пяти курсов введения оливомицина, различие между смертностью подопытных и контрольных крыс увеличивается до 15$. Необходимо указать, что в дальнейшем, после семи-девяти курсов,, эффективность геропротек-торного действия оливомицина, измеряемая этим показателем, стабилизируется и составляет в среднем 16$. Затем после 10-ти курсов введения ингибитора биосинтеза белка смертность подопытных животных снижается на 30$ по сравнению со скоростью вымирания интактных особей, после чего наблюдается следующий этап стабили-зации геропротекторного действия препарата. Так, после 12-ти курсов смертность подопытных животных на 22$ ниже, чем контрольных крыс.
Таким образом, под влиянием курсового введения оливомицина происходит значительное снижение скорости вымирания крыс по сравнению с интактными особями того же возраста. При этом более выражена эффективность действия блокатора транскрипции, которая наблюдается по мере увеличения количества курсов введения препарата.
Сделанный вывод подтверждается результатами,, характеризующими выживаемость крыс подопытной и контрольной групп (рис.5.1).
Из рисунка видно, что в процессе всех 12-ти курсов введения препарата выживаемость подопытных особей была значительно большей, чем интактных животных.
Важно отметить, что увеличение выживаемости происходит уже с первого курса введения крысам оливомицина. Наряду с этим, по мере роста количества курсов различие в выживаемости подопытных и контрольных животных увеличивается еще больше. В результате активного влияния ингибитора транскрипции - оливомицина на выживаемость старых крыс последние особи из подопытной группы, как видно из рис.5.1, погибают в возрасте 48 месяцев. В то же время иятактные животные, содержащиеся в одинаковых условиях с подопытными, не доживают даже до 40-месячного возраста. Исхода из этого, становится очевидным, что оливомицин способствует увеличению продолжительности жизни некоторым крысам из данной выборки более чем на 250 дней по сравнению с контрольными животными.
Необходимо подчеркнуть, что курсовое введение оливомицина существенно воздействует также на среднюю продолжительность жизни крыс. С целью получения объективной информации о влиянии оливомицина на этот показатель проведена оценка ере .дней продолжительности жизни при уровне смертности в .диапазоне от 10 до 100$. Представленные в табл.5.2 .данные свидетельствуют о том, что под влиянием первых курсов введения препарата происходит увеличение средней продолжительности жизни на 19,7$ по сравнению с контрольными животными. Наряду с этим, по мере увеличения количества курсов введения оливомицина, т.е. при других уровнях смертности, отмечается увеличение средней продолжительности жизни крыс на 12-15$.
Похожие диссертации на Экспериментальное исследование геропротекторного действия оливомицина и декстрамина
