Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Гипобиоз и зимняя спячка 8
2.2. Физиологические изменения и особенности у гибернантов во время спячки 11
2.3. Энергообмен зимоспящих животных 18
2.4. Мозговая активность во время спячки 20
2.5. Модели искусственного гипобиоза 21
2.6. Роль медиаторов в зимней спячке 25
2.7. Роль гормонов в зимней спячке 28
2.8. Поиск триггера спячки 33
2.9. Эффекты фракций из тканей гибернантов 37
2.10. Неокиоторфин 45
3. Цели и задачи 50
4. Объекты и методы исследования 51
4.1. Вещества и препараты, используемые в работе 51
4.2. Объекты исследования 51
4.3. Введение препарата в организм животного 52
4.4. Изготовление и имплантация катетеров 52
4.5. Регистрация параметров системной гемодинамики 54
4.6. Регистрация ЭКГ и температуры у крыс 55
4.7. Экспериментальное моделирование условий гипобиоза . 55
4.8. Исследование иммунной реакции на неокиоторфин 57
4.8.1. Приготовление конъюгатов 57
4.8.2. Иммунизация животных 58
4.8.3. Титр антител 58
4.9. Регистрация давления и сердечного ритма 59
4.10. Этаноловый наркоз 60
4.11. Перфузия изолированного сердца крысы 60
4.11.1. Подготовка препарата изолированного сердца 61
4.11.2. Схема установки для перфузии изолированного сердца 61
4.11.3. Регистрируемые параметры сократительной функции сердца 64
4.11.4. Криоконсервирование сердца 64
4.12. Электронно-зондовый микроанализ 64
4.12.1. Подготовка лиофнлизированных криосрезов 65
4.12.2. Параметры электронно-зондового микроанализа 65
4.12.3. Расчет концентрации элементов 66
4.13. Обработка результатов 67
5. Результаты 68
5.1. Действие неокиоторфина на организм животного 68
5.1.1. АД и ЧСС у крыс при разных способах введения НКТ 68
5.1.2. Температура и ЧСС у крыс в модели гипобиоза, протекающего на фоне действия НКТ 71
5.1.3. Влияние НКТ на ЧСС у мышей в нормальных условиях 73
5.1.4. ЧСС у мышей в модели гипобиоза, протекающего на фоне действия НКТ 74
5.2. Иммунизация к НКТ 79
5.2.1. АД и ЧСС у крыс, иммунизированных к НКТ 79
5.2.2. АД и ЧСС при введении НКТ крысам, иммунизированным к НКТ 80
5.2.3. Температура тела иммунизированных крыс в условиях этанолового наркоза 82
5.3. Действие НКТ на препараты сердца in vitro 83
5.3.1. Регистрация сократительной активности изолированного сердца крысы при введении НКТ 83 5,3.2. Эффекты НКТ на изолированное сердце крысы послекардиоконсервирования 85
5.4. Результаты электронно-зондового микроанализа концентрации калия в мышечной клетке сердца животных 89
5.4.1. Внутриклеточная концентрация калия при моделировании гипобиоза у мышей на фоне действия НКТ 89
5.4.2. Внутриклеточная концентрация калия при моделировании гипобиоза у крыс на фоне действия НКТ 90
6. Обсуждение 91
7. Заключение 98
8. Выводы 99
9. Список цитируемой литературы 100
10. Используемые сокращения 131
- Гипобиоз и зимняя спячка
- Модели искусственного гипобиоза
- Температура и ЧСС у крыс в модели гипобиоза, протекающего на фоне действия НКТ
- Действие НКТ на препараты сердца in vitro
Введение к работе
Зимоспящие животные обладают уникальной способностью при наступлении неблагоприятных климатических условий значительно снижать метаболизм и длительное время поддерживать его на низком уровне. Исследования физиологических особенностей зимоспящих показали, что эти животные имеют многочисленные приспособления к холоду. Механизм вхождения животного в спячку и поддержания в течение продолжительного времени функционирования организма в экстремальных условиях не выяснен. Понимание процессов спячки млекопитающих помимо научного имеет и огромный практический интерес. Выяснение механизмов спячки позволило бы надеяться на создание адекватной модели искусственного гипобиоза подобной естественному гипобиозу.
Наиболее ярким примером использования искусственного гипобиоза на сегодняшний день является клиническая гипотермия в кардиохирургии. Обратимый гипобиоз может стать перспективным методом защиты организма от неблагоприятных факторов при действии гипоксии, радиации, интоксикации и прочих. Изучение механизмов гипобиоза требуется и для криобиологии и для криоконсервирования. Выявление гуморальных регуляторов спячки также может представлять практический интерес для решения некоторых геронтологических проблем.
Одно из направлений в изучении физиологии зимней спячки связано с выявлением гуморальных факторов регуляции спячки и основано на тестировании свойств биологически активных веществ, входящих в состав фракций, выделенных из тканей зимоспящих животных. Отсутствие видоспецифичности действия, а также широкий спектр физиологических эффектов таких фракций предполагает полифункциональность этих "триггеров" и наличие специфических рецепторов для их восприятия во многих органах и тканях организма как у зимоспящих, так и у незимоспящих животных. Попытки выделения таких "триггеров" пока не
увенчались успехом. Поиск и идентификация этих веществ остается актуальной задачей и представляет несомненный научный и практический интерес.
В настоящее время известен довольно большой ряд пептидов, которые могут претендовать на роль эндогенных регуляторов сезонных изменений физиологических состояний у зимоспящих животных. Среди них выделяют такие широко известные как серотонин, катехоламины, бомбезин, холецистокинин, тиролиберин, соматостатин, нейротензин, а также малоизученные регуляторные пептиды: киоторфин, неокиоторфин, BS, RZ-8, RZ-13 и другие. Как правило, фракции содержат вещества и непептидной природы, обладающие физиологической активностью.
Однако эффекты известных на сегодняшний день веществ -возможных регуляторов процессов гипобиоза - не могут объяснить всей феноменологии этого состояния. Следовательно, на данном этапе актуальным является изучение физиологических эффектов пептидов, возможных претендентов на роль таких регуляторов.
Пептид неокиоторфин, исследуемый в данной работе, в некоторых случаях может проявлять активность на зимоспящих животных - при выходе из спячки, известны некоторые его эффекты на незимоспящих животных. Несмотря на это, его физиологические свойства изучены далеко не в полной мере.
Объектами настоящего исследования стали незимоспящие животные -мыши и крысы, с целью выявления эффектов неокиоторфина общих для зимоспящих и незимоспящих животных и перспективных для создания искусственного гипобиоза. В качестве исследуемой "мишени" для изучения действия неокиоторфина были выбраны сердечно-сосудистая система и система терморегуляции. Выбор был мотивирован тем, что именно эти системы наиболее значительно изменяют свою работу у зимоспящих животных при погружении в спячку и при выходе из нее (Lyman СР., 1958; Johanson B.W., 1967; Жегунов Г.Ф., 1986, 1988; Эмирбеков Э.З. и др., 1991).
7 Для определения эффектов неокиоторфина, как потенциального регулятора спячки, животных исследовали в разных физиологических состояниях, моделирующих гипобиоз.
2. Обзор литературы
2.1. Гипобиоз и зимняя спячка
Гипобиоз (hipobiosis - от греческого hypo - под, низко и bios - жизнь) -это обратимое снижение метаболизма (снижение потребления кислорода и снижение потребности в кислороде) относительно его уровня у животного в активном состоянии. В природе естественный гипобиоз обеспечивает выживание организма в экстремальных условиях. Примером естественного гипобиоза могут служить разные виды спячки. Спячка - состояние пониженной жизнедеятельности, наступающее у животных в периоды, когда пища становится малодоступной и сохранение высокой активности и интенсивности обмена веществ невозможно. По длительности и по внешним условиям, провоцирующим спячку, различают суточную спячку (у летучих мышей, колибри и других), сезонную (зимнюю и летнюю) и нерегулярную - при внезапном наступлении неблагоприятных условий (у белок, енотовидной собаки, стрижей, ласточек и других).
Характерное для всех видов спячки сильное снижение метаболизма наиболее выражено у зимоспящих животных. Во время спячки происходит резкое угнетение деятельности всех систем организма. Например, у длиннохвостого суслика {Citellus undulatus) потребление кислорода снижается до 2 % от исходного уровня, температура тела падает до 4-5 С, частота сердечных сокращений с 200 до 10 ударов/мин., частота дыханий до 1-2 в минуту (Toien О. et al., 2001).
Зимняя спячка или гибернация (от лат. hybernus - зима и hybernar -перезимовать) у разных видов животных протекает по-разному и имеет свои характерные особенности. Она отмечается при наступлении холодов у многих видов, отличающихся по своим морфологическим, физиологическим и
экологическим признакам. В настоящее время известны зимоспящие животные по крайней мере среди 5 отрядов млекопитающих (Folk G.E., 1974). Классическими примерами зимоспящих животных являются суслики, сони, ежи, сурки, некоторые виды летучих мышей (Слоним А.Д., 1971, 1979; Morrison P., Galster W., 1975; Чернявский Ф. Б. 1977). В активный период жизнедеятельности они являются гомойотермами, то есть животными с постоянной температурой тела, а при наступлении неблагоприятных условий среды (бескормица, похолодание) впадают в спячку, и температура их тела зависит от температуры окружающей среды.
Длительность зимней спячки может достигать 6-8 месяцев. Время пребывания в спячке и в бодрствующем состоянии индивидуально и зависит от многих причин, в числе которых вес животного, внешняя температура, наличие еды и т.д. Своеобразным рекордсменом продолжительности спячки является колумбийский суслик, впадающий в спячку в августе и остающийся неактивным на протяжении всей осени и зимы; выходит он из норы только в мае следующего года.
Во время спячки животные эпизодически просыпаются. Периоды, в течение которых животные засыпают, спят и пробуждаются, называются баутами (Lyman СР. et al., 1982; Kayser С, 1965). Бауты могут быть различной длительности и продолжаться от нескольких часов до нескольких недель (Соколов В.Е. и др., 1995). В перерывах между баутами животные возвращаются на несколько часов в эутермное состояние, при этом у них усиливается окисление недоокисленных продуктов метаболизма, значительно возрастает глюконеогенез, из организма удаляются экскреты (Galster W.A., Morrison P.R., 1975).
Другой формой сезонной спячки является летняя спячка или эстивация (от лат. aestas - лето). Эстивация — сонное, неактивное состояние, наступающее у некоторых животных при неблагоприятных условиях во время летней засухи,
когда становится невозможным добывать пищу и воду. Летняя спячка отличается от зимней только степенью замедления интенсивности физиологических процессов. В летней спячке у млекопитающих оцепенение глубокое (Калабухов Н.И., 1956), но поскольку температура тела животных значительно выше, чем в период зимней спячки, обмен веществ происходит достаточно интенсивно.
Существующее в физиологии определение гибернации, как состояния оцепенения со значительным понижением температуры тела и метаболизма, позволяет использовать его и для пойкилотермных позвоночных (Эмирбеков Э.З., Львова СП., 1991).
Энергетический метаболизм при зимней спячке эктотермных позвоночных и истинных гибернантов имеет много общих закономерностей. В сентябре - августе (в период подготовки к спячке) у амфибий и рептилий, подобно млекопитающим, происходит депонирование энергетических субстратов: углеводов и жиров. Накопление гликогена в печени перед гибернацией присуще различным видам амфибий, рептилий, млекопитающих.
Перед спячкой, как у эндо-, так и эктотермных животных увеличивается содержание макроэргических фосфатов. Холодовое оцепенение амфибий и рептилий, подобно гибернации млекопитающих, ведет к значительному понижению содержания депонированного в печени гликогена, вместе с тем содержание макроэргических фосфатов и неорганического фосфора поддерживается на высоком уровне вследствие снижения их использования. На основании данных, полученных при изучении энергетического обмена во время гибернации в тканях животных, представляющих разные филогенетические группы (амфибии, рептилии, млекопитающие), Эмирбеков Э.З. сделал заключение, что эти изменения имеют, как черты различия, так и сходства, причем последние превалируют.
11 2.2. Физиологические изменения и особенности у гибернантов во
время спячки
Основное отличие гибернантов от негибернантов - способность к согласованному на всех уровнях (субклеточном, клеточном, тканевом, органном) переходу от состояния бодрствования к состоянию спячки.
Особенности дыхания во время спячки
Значительно изменяется во время спячки дыхание. В этот период дыхательный центр угнетен, понижена его чувствительность к углекислоте, уменьшена легочная вентиляция (Kayser С, 1961). Средняя частота дыхания у спящих сусликов составляет 1-2 дыхательных движения в минуту. Повышение порога чувствительности дыхательного центра к гипоксии настолько значительно, что животные довольно длительное время не реагируют на эвисцерацию и перевязку аорты (Лауэр Н.В., 1959). Пробуждение от спячки характеризуется возрастанием частоты дыхания. Вскоре после пробуждения она составляет уже 160 дыхательных движений в минуту (Landau B.R., Dawe A.R., 1958;KayserC.,MalanA., 1963).
Митохондриальпое дыхание зимоспящих
В настоящее время наиболее хорошо изучены митохондрии печени гибернантов. Установлено, что изолированные митохондрии печени гибернирующих животных имеют значительно сниженную в сравнении с митохондриями бодрствующих животных скорость дыхания в разных метаболических состояниях (Брустовецкий Н.Н. и др., 1987). Окислительное фосфорилирование и аденилатная система митохондрий гибернирующих сусликов более чувствительны к повышению внемитохондриального Са + и характеризуются более низкими параметрами в сравнении с митохондриями активных животных (Брустовецкий Н.Н., Гришина Е.В. и др., 1989). Последующие исследования показали, что ингибирование разобщенного
дыхания митохондрий связано специфическим образом с системой убихинолщитохром С редуктазы (Brustovetsky et al., 1990). Скорость транспорта субстратов окисления в митохондрии печени гибернирующих сусликов существенно снижена в сравнении с митохондриями активных животных (Брустовецкий Н.Н., Амерханов З.Г., 1989). Это, по мнению авторов, может быть одной из основных причин торможения фосфорилирующего и разобщающего дыхания, когда транспорт субстрата наряду с активностью дегидрогеназ является скор ость-л имитирующим процессом. Показано, что трансмембранный потенциал ДЧ* на внутренней мембране митохондрий печени гибернирующих сусликов ниже, чем у митохондрий бодрствующих животных (Брустовецкий Н.Н., Егорова М.В., Маевский Е.И., 1991), что является показателем ингибирования переноса электронов. Вместе с тем, снижение АЧ* может быть основной причиной угнетения энергозависимых митохондриальных функций, в том числе окислительного фосфорилирования и транспорта К+ и Са2+ (Брустовецкий Н.Н., Егорова М.В., Гришина Е.В., Маевский Е.И., 1991). Среди ферментов, принимающих участие в регуляции сложных механизмов окислительного фосфорилирования, была выделена фосфолипаза А2 (Брустовецкий Н.Н. и др., 1990). Одно из свойств фосфолипазы Аг состоит в возможном растормаживании механизма преноса электронов в митохондриях гибернантов при пробуждении (Brustovetsky N.N. et al., 1990).
Природными разобщителями окислительного фосфорилирования в митохондриях являются длинноцепочечные жирные кислоты. В клетках и тканях in vivo жирные кислоты выполняют в первую очередь роль субстратов окисления, обеспечивая поступление электронов в дыхательную цепь. Эта функция маскирует их потенциальный разобщающий эффект, который начинает выявляться только при специальных физиологических и патофизиологических условиях. Известно, что одним из условий успешного погружения в спячку животного-гибернанта является предварительная жировая
диета (Калабухов Н.И., 1985, Munro D., Thomas D.W., 2004). В этой связи роль жирных кислот, как возможных участников изменений, происходящих в организме гибернирующих животных, вызывает особый интерес. Вероятно, в снижение митохондриального дыхания под действием длинноцепочечных жирных кислот вовлечены несколько мишеней: дыхательная цепь, первичные дегидрогеназы, субстратактивируемые реакции и транспорт субстратов в митохондрию (Wojtczak L., Schonfeld P., 1993).
Одним из важных отличий тканей зимоспящих от тканей незимоспящих животных является повышенная устойчивость мембран зимоспящих (по данным исследования перекисного окисления липидов), что может быть обусловлено присутствием в клетках эндогенных антиоксидантов (Шугалей B.C. и др., 1988).
Особенности сердечно-сосудистой системы зимоспящих
Функционирование сердечно-сосудистой системы зимоспящих во многом связано со спецификой регуляции и с высокой устойчивостью к гипотермии, гипоксии, ишемии, аритмиям.
Сердечно-сосудистая система гибернантов характеризуется широкими адаптивными возможностями. Если у активных сусликов ЧСС около 400 уд/мин, то в спячке при температуре тела около 5 С ЧСС менее 10 уд/мин и 160-250 уд/мин при разогревании животного до 10-15 С (Жегунов Г.Ф., 1986, 1988).
В активном состоянии гибернанты противостоят охлаждению. Уменьшение температуры среды приводит к увеличению ЧСС у активных сусликов на 5,3 уд/мин/1 С летом и на 3,8 уд/мин/1 С зимой (Игнатьев Д.А. и ДР-, 1992).
Напротив, при погружении в спячку у сусликов ЧСС падает резко с 200-230 уд/мин до 50 уд/мин при снижении температуры тела всего на 4-5 С (Игнатьев Д.А. и др., 1992). Показано, что скорость падения ЧСС в диапазоне
температур 35-25 С у сусликов составляет в среднем 20 ударов на каждый градус, в то время как у гомойотермных животных этот показатель не превышает 4-5 уд/мин/С.
В период спячки изменение сердечного ритма сусликов описывается формулой ЧСО=2,53хе0,1*Тос. Причем во время погружения в спячку и при пробуждении изменения ЧСС, опережают изменения температуры тела на 1,5-2 ч (Игнатьев Д.А. и др., 1992).
Сердце зимоспящих животных способно выполнять свои функции при температуре тела 5 С (Chatfield, Lyman СР., 1950) и даже при температуре 0 С (Johanson B.W., 1967). Минимум для ЧСС, 4-5 уд/мин, наблюдается в период глубокой гибернации при температуре среды 2-5 С (Игнатьев Д.А. и др., 1992). Очень низкий ритм сокращений сердца у гибернирующего животного изначально связывали с тем, что во время спячки сердце находится под сильным ингибиторным влиянием со стороны парасимпатической системы. Однако, опыты с введением холиномиметиков, холинолитиков и электрической стимуляцией вагуса показали, что влияние парасимпатической нервной системы на ритм находящихся в спячке животных минимален, если не отсутствует вообще (Lyman СР., O'Brien, 1963). Уникальная способность сердца гибернантов сокращаться при низкой температуре сохраняется и в изолированном органе и на одиночных миофибриллах предсердий (Hudson J.W., 1965).
Зимоспящие животные во время спячки не становятся полностью зависимыми от температуры окружающей среды. Терморегуляция присутствует даже при очень сильном охлаждении. Показано, что при 6,5-9 С ЧСС постоянна и составляет 9-12 уд/мин. Понижение температуры до 4 С ведет к некоторому снижению ритма (8-10 уд/мин), а до 0 С - вызывает рост ЧСС (12-13 уд/мин) (Pajunen I., 1992).
При пробуждении животного на фоне низкой начальной скорости повышения температуры тела происходит значительное увеличение ЧСС за
довольно короткий промежуток времени и уже при температуре тела 10-15 С ЧСС составляет 160-250 уд/мин (Жегунов Г.Ф., 1986). Максимальный ритм (400 уд/мин) зарегистрирован при пробуждении, когда температура тела равна 17-20 С (Игнатьев Д.А. и др., 1992). Это свидетельствует о способности "холодного" сердца гибернантов функционировать на уровне нормотермного органа.
Кроме того, сердце зимоспящих млекопитающих может длительное время сохранять свою активность и при глубокой искусственной гипотермии тела (Burlington R., Darvish А., 1988). Одной из причин устойчивости сердца сусликов к длительному охлаждению является высокая стабильность С??*-насоса мембран саркоплазматического ретикулума (Жегунов Г.Ф. и др., 1993).
Такие функциональные особенности сердечной деятельности у зимоспящих животных, направлены на максимальное сохранение структурно-метаболических ресурсов при охлаждении.
Артериальное давление во время спячки у гибернантов понижено. Систолическое давление варьирует между 90 и 40 мм рт.ст., а диастолическое между 40 и 10 мм рт.ст. (Lyman СР., O'Brien R.C., 1960). Однако сосудистый тонус во время спячки поддерживается. Это связано, вероятно, с вазоконстрикторными эффектами симпатической системы, так как введение адреноблокаторов резко понижает сосудистое сопротивление.
Для гибернантов характерно некоторое отличие в регуляции коронарного кровотока по сравнению с гомеотермными животными. R.F. Burlington и W.K. Milson (1993) изучали различное влияние ацетилхолина на коронарый ток в изолированном гипотермическом сердце крысы и суслика. Они обнаружили, что введение ацетилхолина в перфузат (при 37 С и 20 С) вызывало вазоконстрикцию коронаров у крысы и вазодилятацию у суслика. Падение температуры окружающей среды до 15-12 С приводило к фибрилляции сердца крысы, в то время, как сердце суслика нормально функционировало даже при 7 С. Ацетилхолин не оказывал влияния на работу сердца суслика при 7 С.
16 Известно, что в коронарных сосудах крысы вазоконстрикция опосредуется М-холинорецепторами, которые имеют структурное сходство с аналогичными человека, овцы и свиньи. Мускариновые рецепторы коронаров сердца суслика структурно отличаются от аналогичных рецепторов у вышеперечисленных видов и это, по мнению авторов, является причиной вазодилятации.
Следует отметить еще одну особенность сердца зимоспящих. Эксперименты, проведенные И.М. Коростышевской и соавторами (1992) показали, что сердце краснощекого суслика при 10 С способно благополучно переживать часовой период тотальной ишемии, сохраняя при этом резервы для восстановления сердечной деятельности, поддержания адекватной гемодинамики и ликвидации кислородной задолженности на согревание.
При падении температуры тела до 1-4 С сердце гибернанта противостоит фибрилляции, сохраняет способность к сокращению и устойчиво к аритмиям. У гибернантов не бывает фибрилляций даже в экстремальных условиях. Тогда как у других животных при остановке сердца, восстановлении сердечной деятельности и других манипуляциях они, как правило, возникают. Не удается вызвать фибрилляцию желудочков и добавлением Са к лишенной К жидкости, перфузирующей изолированное сердце суслика, введением адреналина, прокаина, стимулированием током в уязвимый период (Johansson B.W., 1963; Johansson B.W., 1984). Причем повышенная термоустойчивость и резистентность к аритмиям отмечается у зимоспящих не только в состоянии спячки, но и у активных животных (Johansson B.W., 1984; Duker G.D. et al., 1986).
Электрофизиологические исследования показали, что потенциалы действия (ПД) сердец зимоспящих животных (монофазные, зарегистрированные на целом сердце в экспериментах in vivo, и внутриклеточные - от клеток папиллярной мышцы) имеют характерные особенности. У них практически отсутствует фаза плато ПД и сильно
замедлено окончание фазы реполяризации. При понижении температуры окружающей среды фаза плато ПД не проявляется, а окончание фазы реполяризации затягивается еще сильнее. В противоположность этому, ПД у незимоспящих обычно имеет отчетливую фазу плато и быструю фазу реполяризации, и при понижении температуры фаза плато удлиняется, а характерное время развития реполяризации практически сохраняется (Duker G.D. et al., 1986). Эти особенности в работе сердца могут быть связаны со спецификой организации кардиомиоцитов зимоспящих и, в первую очередь, калиевых каналов их мембран, Кроме того, некоторые аналогии могут быть проведены и по вопросу регуляции Са + транспорта. Показано, что у якутского суслика в состоянии гибернации снижена амплитуда L-типа Са -тока изолированных кардиомиоцитов (Alekseev А.А, Markevich N.I. et al., 1996).
D.D. Belke с соавторами (1991) в своей работе описали повышенный захват Са** в саркоплазматическом ретикулуме кардиомиоцитов у гибернирующих сусликов по сравнению с летне-активными. I. Могапо et al. (1992) изучали экспрессию миозиновых субъединиц тяжелой миозиновой цепи и легких цепей, а также ш vivo фосфорилирование легкой миозиновой цепи в желудочке сердца европейского хомяка в период гибернации и в период активного поведения. Было показано, что у летних животных преобладала jS-миозиновая тяжелая цепь (на 79 %), а у гибернирующих а-цепь (на 53 %). У зимне-активных хомяков, содержащихся при температуре 22 С и 12 часовом суточном ритме, характерна картина, сходная с летними животными. Известно, что ферментативная активность а- и /3-миозиновых цепей отличается между собой по температурному оптимуму. При увеличении температуры возрастает активность а-цепи и уменьшается /?-цепи. In vivo наблюдалось падение фосфорилирования легких миозиновых цепей с 45 % у летних животных до 23 % у гибернирующих хомяков. Легкие цепи были одинаково представленны у всех животных.
2.3. Энергообмен зимоспящих животных
Если рассматривать зимнюю спячку в целом, то ее можно характеризовать как крайнюю форму экономии энергии у млекопитающих для выживания в неблагоприятных условиях внешней среды, когда поступление энергии извне ограничено (Пастухов Ю.Ф., 1986). Основным физиологическим условием зимней спячки является сохранение соответствия между потреблением энергии клетками и тканями и фактическим обеспечением этих потребностей на всех стадиях гибернации и выхода из нее. Так, относительное содержание АТФ в печени спящего суслика в 4-5 раз превышает этот показатель у активного и просыпающегося животных (Грищенко В.И. и др., 1990).
Исследование интенсивности синтеза и обновления белков в клетках сердца гетеротермных животных показало, что в мембраны клеток миокарда разогревающихся сусликов за тот же промежуток времени встраивается в 2-3 раза больше меченых белков, чем в соответствующие мембранные фракции из тканей сердца активных сусликов. Наибольшее количество меченых белков было обнаружено в мембранах митохондриальной фракции (Жегунов Г.Ф., 1988).
Важную роль в переходе животных из состояния бодрствования в состояние зимней спячки играют процессы, происходящие в митохондриях, являющихся основными потребителями кислорода и производящих большую часть тепла в клетке. Исследование активности оксидазных систем митохондрий печени ряда животных (суслик, черепаха и крыса) и состояния механизмов несопряженного дыхания показало, что в условиях естественной спячки сусликов отмечается значительное подавление активности оксидаз. NADH-оксидазная и сукцинатоксидазная активности снижаются примерно в 2 раза, в то время, как активность цитохром оксид азы гораздо меньше зависит от гибернации (Алламуратов Ш.И., 1999).
Алламуратовым Ш.И. и Н. Рахматуллаевым была реализована модель эксперимента, когда тестируемым материалом служили изолированные митохондрии спящего суслика, которыми воздействовали на изолированные митохондрии печени крыс. Митохондрии сусликов при добавлении в ячейку с митохондриями печени крыс вызывали снижение дыхания последних в активном фосфорилирующем состоянии и на уровне разобщенного дыхания. Описанные выше результаты указывают на наличие в митохондриях гибернирующих сусликов гипометаболических факторов.
При пробуждении от зимней спячки различия в изменении энергетического обмена у экто- и эндотермных животных наиболее выражены. Это связано с тем, что у эктотермных животных выход из спячки осуществляется за счет переноса энергии из окружающей среды, а у зимоспящих млекопитающих за счет "саморазогрева" (Эмирбеков Э.З., Львова СП., 1991). Большое значение в разогреве тела гибернантов на начальных этапах пробуждения играет термогенез бурой жировой ткани. Главное отличие бурой жировой ткани от других тканей, в которых тепло служит лишь побочным продуктом метаболических реакций, состоит в том, что энергия химических связей питательных веществ используется здесь только для теплопродукции. В основе процессов теплопродукции здесь лежит шунт в цепи синтеза АТФ в митохондриях (Хочачка П., Сомеро Дж., 1988).
Сердце сусликов на протяжении всего периода зимней спячки покрыто сверху большим количеством бурого жира, что не наблюдается у гомойотермных животных (Жегунов Г.Ф., 1989). Вероятно, недрожательный термогенез в околосердечной бурой жировой ткани, обеспечивает подогрев сердца, в первую очередь область водителей ритма. Сердце прокачивает кровь через бурый жир и подогреваемая таким образом кровь разносит тепло по всему телу (Жегунов Г.Ф., 1989). Также, большое значение в разогреве тела гибернантов на начальных этапах пробуждения играет термогенез бурой
жировой ткани, лежащей в межлопаточной области (Винокуров В.И., Ахременко А.К., 1982).
При вхождении в состояние спячки снижение уровня метаболизма предшествует падению температуры тела (Гаврилюк Б.К., 1985), что указывает на наличие направленной регуляции метаболизма и, как следствие, перестройки теплообмена.
2.4. Мозговая активность во время спячки
Вышеназванные изменения уровня метаболизма, частоты сердечных сокращений, ритма дыхания (1-2 дыхательных движений в минуту), падение температуры тела до 1-4 С (Штарк М.Б., 1970), осуществляются при продолжающемся контроле со стороны гипоталамических структур. Электрическая активность мозга при погружении в спячку обычно исчезает в следующей последовательности: 1) кора мозга; 2) ретикулярная формация, таламус; 3) лимбическая система мозга (септум, гиппокамп, гипоталамус) (Белоусов А.Б., 1993).
При гипотермии гомойотермных животных наиболее устойчиво и длительно сохраняется электрическая активность в ретикулярной формации (Петров И.Р., Гублер Е.В., 1961). А у зимоспящих животных во время глубокой спячки кора и ретикулярная формация головного мозга в течение продолжительных периодов не проявляют электрической активности, в то время, как в лимбической системе и в гипоталамусе активность все время существует, хотя и на сниженном уровне (South F.E. et al., 1969; Штарк М.Б., 1970; MihailovicLj., 1972).
В гипоталамусе электрическая активность на низком уровне не прекращается даже во время самой глубокой спячки. Там находится своеобразный сторожевой пункт, готовый включить систему термогенеза если дальнейшее охлаждение может стать фатальным.
Все вышеперечисленные факты заставляют предположить, что в организме зимоспящих в период гибернации вырабатываются низкомолекулярные эндогенные вещества, способные значительно угнетать различные физиологические процессы. Показательным в этом отношении является мощное ингибирующее действие экстрактов из тканей гибернантов на сердечно-сосудистую систему зимоспящих (Сухова Г.С., Игнатьев Д.А., 1990; Сухова Г.С., Левашова В.Г. и др., 1992).
2.5. Модели искусственного гипобиоза
В природе обычные эутермные животные не впадают в спячку. Они противостоят охлаждению усилением теплопродукции. Однако есть основания полагать, что зимняя спячка осуществляется с помощью механизмов, функционирующих и у незимоспящих теплокровных (Mrosovsky N., 1971).
В исследованиях французского физиолога Поля Бэра на сонях (Bert Р. 1870) экспериментально показана возможность охлаждения животных при температуре среды 12 С в замкнутом сосуде, содержащем поглотитель С02. В опытах на зимоспящих животных Рафаэль Дюбуа (Dubois R. 1896) обнаружил в их крови высокий уровень С02 (почти в два раза выше нормы). Помещая животных (сурки, кролики) в искусственную газовую среду с большой концентрацией С02 (до 45%) при пониженной температуре, автор наблюдал развитие состояния, напоминающего зимнюю спячку. Таким же образом, А.П. Вальтеру удалось охлаждать кроликов до 20 С с сохранением их жизнеспособности (Вальтер А.П., 1863).
Отечественный исследователь П.И. Бахметьев сообщал, что теплокровных животных не удается охладить до температуры ниже 20С. Далее, в сообщении говорилось, что теплокровных животных следует сначала перевести в состояние животных с "переменной температурой", т.е. пойкилотермных. Этого можно добиться, используя "аутонаркоз" - смесь углекислого газа с кислородом в соотношении 2:1, подобно тому, как в
природе происходит с зимоспящими животными в период спячки (Бахметьев П.И., 1901, 1912). У животных-гибернантов в закупоренной норе имеется именно такое соотношение (Baudinette R.V., 1974; Винокуров Н.В., Ахременко А.К., 1982). Эту идею Бахметьеву удалось осуществить на зимоспящей летучей мыши (Бахметьев П.И., 1902).
J. Giaja (Giaja J., 1953; Giaja J., Markovic L., 1953), Анджус P.K. (Andjus R.K. 1955; Анджус P., Хозич H., 1965) и A. Smith (1955) тоже охлаждали мелких животных в замкнутом сосуде в условиях постепенно нарастающей в процессе дыхания гипоксии-гиперкапнии. Гипоксия и гиперкапния увеличивают проницаемость гемато-энцефалического барьера (Кассиль Г.Н., 1963), что тоже может способствовать регуляции гипобиоза. Этот метод и сейчас применяется в эксперименте. С его помощью мышей удается охладить на 10 С при температуре среды 23 С (Игнатьев Д.А. и др., 1987, 1989).
Другой способ заключается в создании нужного разряжения в барокамере и/или дозированной подаче С02 (Тимофеев Н.Н., 1983, 1997). Такой способ позволяет с высокой точностью поддерживать требуемые условия среды.
Гипоксическая газовая среда способствует охлаждению животного, угнетая окисление (Иванов К.П., 1965, 1972), а, следовательно, и термогенез в мышечной ткани. Помимо того, во время охлаждения гипоксия, действуя центрально, приводит к снижению потребления кислорода и, следовательно, меньшему расходу энергетических резервов. Это в свою очередь позволяет мозгу не испытывать гипоксии и ишемии во время восстановления животного.
На последующих этапах охлаждения гипотермия приводит к угнетению дыхательного центра, что в свою очередь приводит к усилению гипоксического влияния.
Углекислота является дополнительным фактором, тормозящим окисление (Репин И.С., 1961; Маршак М.Е., 1969) и термогенез. Поэтому для организмов с наиболее мощной системой терморегуляции, например, кроликов, вместе с гипоксией используют гиперкапнию.
Гипотермия является стрессорным агентом. Она приводит к выбросу катехоламинов в кровь. Так секреция адреналина возрастает на 694 %, а норадреналина - на 228 % (Popovic V.M., Davidovic V., 1972). Катехоламины активируют свободное окисление, разобщая окисление и фосфорилирование. А гипоксия-гиперакпния "восстанавливает" возникшее разобщение окисления и фосфорилирования, тем самым, препятствуя термогенезу. Затем, после охлаждения организма ниже 32 С, наступает холодовая переферическая и центральная блокада термогенеза (Малыгин A.M., 1969; Малыгин A.M., Логинов СИ., 1978).
Альтернативным способом создания искусственного гипобиоза у пойкилотермных животных является охлаждение с предварительным введением нейроплегических смесей (Laborit Н., Huguenard Р., 1951, 1953; Laborit Н. et ah, 1965).
Основным компонентом нейроплегической смеси является аминазин. Он обладает выраженным адренолитическим действием (блокирует центральные адренергические и дофаминергические рецепторы, препятствует захвату катехоламинов, снижает проницаемость мембраны гранул, в которых хранятся депонированные катехоламины, затрудняя их выход из депо) и слабым антигистаминным действием (блокада Н1-рецепторов), угнетает двигательную активность, вызывает миорелаксацию, тем самым, снижая интенсивность терморегуляторных реакций (Белошицкий П.В., 1966). В комбинации с аминазином используются антигистаминные препараты (димедрол, пипольфен) и наркотические анальгетики (в основном, промедол, который усиливает блокирующее действие аминазина на терморегуляторные центры и тормозит функцию симпатоадреналовой системы (Тимофеев Н.Н., 1983).
Н.Н. Тимофеевым (1983, 1997) было предложено еще несколько способов снижения метаболизма у животных, основанных на воздействии на постганглионарные симпатические нервные окончания, содержащие норадреналин. Первый принцип, предложенный автором, заключается в
опустошении депо катехоламинов с помощью алкалоида резерпина в дозе 1,2-1,5 мг/кг крысам или 0,8 мг/кг кроликам внутримышечно. Опустошение депо катехоламинов происходит медленно, и их уровень в органах и тканях достигает минимума через 15-20 часов после введения препарата. Но при большом дефиците катехоламинов животные не имеют возможности самостоятельно выйти из гипобиоза, так как катехоламины необходимы для активации термогенных процессов. Второй принцип основан на блокаде высвобождения нейромедиатора из адренергических нейронов. С этой целью авторы использовали орнид в дозе 30-50 мг/кг внутри брюшинно. Максимальный эффект термоблокады развивался через 1-1,5 часа, уровень метаболизма при этом падал на 30-40 % при сохранении нормотермии. Функционально по поведенческим реакциям этот этап нормотермического гипометаболизма соответствует известному у зимоспящих состоянию "предрасположенности" к впадению в спячку. Третий и четвертый принципы получения гипометаболизма заключаются в блокаде синтеза катехоламинов в адренергических нейронах с помощью метилпаратирозина и образования "ложного" адренергического медиатора путем введения метил-Дофа. Каждый из вышеприведенных препаратов использовался, как самостоятельно, так и в комбинации с другими, а также в сочетании с иммобилизацией и/или гипотермией. Уровень потребления кислорода у животных падал на 20-50 % от нормы, температура тела на 4-8 С.
Изменение температуры тела зависит от дозы нейроплегической смеси и температуры окружающей среды. При температуре окружающей среды 18-20 С снижение температуры тела мало зависит от дозы и не превышает 4-5 С. При понижении температуры среды снижение температуры тела значительно зависит от дозы и животных удается охладить до 20 С и ниже (Тимофеев Н.Н., 1983, 1997). Применение нейроплегических веществ и релаксантов нашло свое место и в клинике (Чистяков В.Н. и др., 1972; Буков В.А., Кривицкий В.Н., 1978).
Снижение метаболизма и поддержание гипотермического состояния можно добиться и обычным наркозом, хотя выживаемость при этом сильно понижена (Connaughton P.J., Lewis F.J., 1962).
2.6. Роль медиаторов в зимней спячке
На сегодняшний день в ряду веществ, вовлеченных в регуляцию процессов зимней спячки можно перечислить катехоламины, серотонин, аденозин и регуляторные пептиды.
Серотонин и катехоламины
Впервые сезонные изменения содержания серотонина в мозге гибернирующих животных было показано в работе Uuspaa V.J. (Uuspaa V.J., 1963). Впоследствии было проведено большое количество работ по изучению возможного участия серотонина в регуляции гибернации (Spafford D., Pengelley Е., 1971; Кудрявцева Н.К, Попова Н.К.,1973; Jansky L. et al., 1973; Popova N.K., Konusova A.V., 1985). Было показано, что серотонин является одним из индукторов зимней спячки. Установлено, что серотонин подавляет термогенез как у зимоспящих, так и у незимоспящих животных (Jacob J. et al., 1972; Попова Н.К. и др., 1973; Корякина Л.А., 1976). Причем, в качестве регулятора гибернации выступает не только серотонин мозга, но и серотонин периферии. При изучении концентрации серотонина и скорости его обмена в структурах мозга и периферических тканях краснощекого суслика в связи с годовым циклом спячки было показано, что содержание серотонина в гиппокампе начинает повышаться уже в осенний период, достигая своего максимального значения вскоре после начала зимней спячки. В процессе спячки его содержание в гиппокампе постепенно уменьшается, оставаясь, тем не менее, выше, чем у активного животного. С момента впадения в спячку уровень серотонина повышается также и в гипоталамусе, промежуточном и среднем мозге, оставаясь неизменным в больших полушариях головного мозга и
мозжечке (Кудрявцева Н.Н., Попова Н.К., 1973; Кудрявцева Н.Н., 1977). В тоже время исследование содержания серотонина в слизистой желудка и крови показало, что при зимней спячке оно резко снижается. При весеннем пробуждении сусликов наблюдается резкое падение уровня серотонина во всех структурах мозга (особенно в гиппокампе) с последующим медленным восстановлением до уровня, характерного для эутермного животного (Кудрявцева Н.Н., Попова Н.К., 1973). Авторы предполагают, что функции серотонина головного мозга и серотонина периферических тканей неоднотипны. Если серотонин периферических тканей оказывает ингибирующее влияние на термогенные реакции и способствует поддержанию глубокой гипотермии, то серотонин головного мозга, видимо, выступает, как ингибитор поведения и, возможно, других физиологических функций (Попова Н.К., 1986). Существует также, точка зрения, что серотонин принимает участие в регуляции подготовки и начального этапа вхождения в зимнюю спячку, но не является основным или единственным фактором ее индукции (Пастухов В.А., 1983).
Участие серотонинергических систем в регуляции процессов оцепенения, по-видимому, может быть сопряжено с изменением активности других моноаминергических систем мозга и периферических тканей. Важная роль в регуляции спячки отводится изменению соотношения между содержанием норадреналина и серотонина в гипоталамусе (Feist D.D., 1970; Попова Н.К. и др., 1978). В исследовании, проведенном на арктических сусликах, найдено, что концентрация норадреналина в гипоталамусе при наступлении спячки снижается на 35%, а в начале и в середине процесса пробуждения увеличивается на 50%; содержание адреналина повышается в конце пробуждения и остается на этом уровне в период после пробуждения; содержание серотонина снижается на 34% в начале пробуждения, в остальные фазы цикла спячки оно остается на относительно постоянном уровне (Feist D.D., Galster W.A., 1974).
В развитии естественного гипобиоза у животных большое значение имеет снижение активности симпато-адреналовой системы. В период предрасположенности к спячке у сусликов задолго до снижения температуры выключаются центральные адренергические механизмы и почти полностью прекращается обмен норадреналина в мозге (Draskozy P.P., Lyman СР., 1967). В результате чего происходит блокада сократительного и несократительного термогенеза. По сравнению с летним активным периодом содержание норадреналина в плазме крови у лесных сурков при вхождении в спячку падает в 7 раз, а при пробуждении возрастает в 4,5 раза. Близкие к этому изменения отмечены при измерении концентрации адреналина и дофамина (Florant G.L., et al., 1982).
Обмен катехоламинов в мозге, сердце и бурой жировой ткани в период зимней спячки у тринадцатиполосных сусликов и европейских ежей (Sauerbier I., 1977) значительно уменьшается по сравнению с летним сезоном. При этом в буром жире обмен катехоламинов оказывается относительно наиболее высоким (Draskozy P.R., Lyman СР., 1967). По предположению авторов норадреналин в этой ткани способствует разложению жира с образованием свободных жирных кислот. Общее содержание катехоламинов (норадреналина, адреналина, дофамина) в плазме крови у сони-полчка осенью достоверно ниже, чем весной и летом (Castex Ch., 1983).
Пробуждение от спячки, по-видимому, связано с активацией симпатоадреналовой системы. Показано, что удаление верхних симпатических узлов способствует более быстрому наступлению спячки и делает ее более продолжительной (Арбузов Ш.И., 1960). Введение летучим мышам /3-адреноблокатора пропранолола увеличивает вдвое время их пробуждения от зимней спячки.
Таким образом, если серотонин играет роль одного из индукторов зимней спячки, то катехоламины, способствуют выходу животного из гибернации.
Нуклеозиды
В 1993 году T.F. Lee с соавторами обнаружили увеличение А1 пуринових рецепторов в мозге у гибернирующих колумбийских сусликов по сравнению с летними животными (Lee T.F. et aL, 1993). Аденозин обладает рядом физиологических эффектов, сопоставимых в своих проявлениях с состоянием отдельных физиологических систем при гибернации. Рядом авторов отмечено действие на сон производного аденозина: Э-аденозил^-гомоцистеина (S-АГ). Было обнаружено, что S-АГ при внутри брюшинном введении мышам вызывает увеличение длительности медленного сна и одновременно значительное увеличение доли парадоксального (Louis-Coindet J. et al., 1984; Gharib A., et al., 1984). Известно, что при действии на атриовентрикулярный и синоатриальный узлы аденозин вызывает брадикардию (Szentmiklosi A J. et al., 1980, West G.A., Belardinelli L., 1985) и снижает кровяное давление у крыс (Barraco R.A. et aL, 1987). Есть данные о том, что аденозин выделяется в мозге при уменьшении снабжения энергоресурсами, устойчивой гипотензии или гипоксии (Berne R.M, et aL, 1974; Winn H.R. et aL, 1980). Также показано, что центральное введение аденозина вызывает дозозависимое падение температуры тела у мышей (Yarbrough G.G. et aL, 1981), падение системного давления и частоты сердечных сокращений у крыс (Barraco R.A., 1986).
Однако, участие аденозина в регуляции зимней спячки пока не доказано, хотя очевидна перспектива изучения аденозина, как одного из регуляторов процесса гипобиоза.
2.7. Роль гормонов в зимней спячке
Подготовка к переживанию неблагоприятных для организма сезонов, включает перестройку и во всех звеньях эндокринной системы. В период подготовки животного к спячке снижается активность гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС), аденогипофиза, щитовидной и
паращитовидной желез (Колпаков М.Г., Колаева С.Г., 1974). В первые циклы спячки все эти звенья эндокринной системы находятся в угнетенном состоянии. Постепенная активация ряда желез ГГНС, аденогипофиза, паращитовидной, приходится на период, когда животное находится еще в глубокой спячке. Активность других проявляется непосредственно перед пробуждением или после него (Корякина Л.А., 1976). Максимальное же напряжение в работе практически всех звеньев эндокринной системы происходит после весеннего пробуждения и продолжается несколько месяцев. Постепенно эта гиперактивность исчезает, и работа эндокринной системы нормализуется (Пастухов Ю.Ф., 1986).
Некоторые системы организма способны обратимо "выключаться" практически на весь период гибернации. Так, например, у гибернантов происходит инволюция половых желез и коркового слоя щитовидной железы и надпочечников (Kayser С, 1961). При этом, яичники и семенники атрофируются до впадения в спячку и остаются в таком состоянии в течение всего периода гибернации, проявляя у некоторых видов признаки повышения активности в последние дни зимней спячки перед пробуждением (Lyman СР., Chatfield P.O., 1955).
Многочисленные исследования функции щитовидной железы в период спячки и пробуждения у разных видов животных показали, что минимальная ее активность в спячке и максимальная ее функция в период пробуждения отмечаются у всех исследуемых животных: сурка, золотистого хомячка (Kayser Ch., Aron М., 1950), летучей мыши (Azzali С, 1955), садовой сони (Lachiver F., 1952; Lachiver F. et al., 1957). Было показано, что порошок из щитовидной железы предотвращает спячку (Popovic V,, 1959). Действие тиреоидных гормонов в основном связано с сенсибилизацией тканей организма, путем повышения их чувствительности к катехоламинам (Гольбер Л.М. и др., 1978).
Известно, что во время спячки уровень циркулирующего в крови кортикостерона крайне снижен (Denyes A., Horwood R.H., I960), а через 6 часов
зо после пробуждения увеличивается до нормы. Kayser Ch. и Schwartz J. (1960) установили зависимость между сезонными колебаниями температуры окружающей среды, весом тела хомяка и выделением животным с мочей 17-оксикортикостероидов. Было показано, что в мае вес зверьков наименьший, в августе достигает максимума, а затем снижается. Аналогично изменяется и выделение 17-оксикортикостероидов. Роль гормонов коры надпочечников в механизме зимней спячки довольно значима. После удаления надпочечников европейские суслики не впадают в спячку. Трансплантация коркового вещества в глазную камеру адреналэктомиро ванного суслика способствует обычному развитию спячки (Popovic V., 1960, 1962).
Нейропептиды
В последние годы появилось много работ, посвященных роли пептидов в регуляции различных систем и процессов в организме (Ашмарин И.П., Обухова М.Ф., 1986, Ашмарин И.П. и др., 1996). Некоторые авторы полагают, что ряд пептидов могут непосредственно участвовать и в регуляции зимней спячки (Margules D.L., 1979; Kramarova L.I. t al., 1983; Muchalinski A.E. et al., 1983). К пептидам, индуцирующим зимнюю спячку и поддерживающим это состояние сейчас относят ТРГ, опиоиды (Margules D.L., 1979; Kramarova L.I. et al., 1983), бомбезин (Muchalinski A.E., 1983; Figlewicz D.P. et al., 1986). К потенциальным регуляторам пробуждения от спячки — кальцитонин (Freed W.J. et al., 1979), меланотропин, АКТГ7.38 (Margules D.L., 1979). Появились данные и о возможном участии в пробуждении неокиоторфина (Игнатьев Д.А. и др., 1990; Сухова Г.С., 1990), выделенного из тканей гибернирующих сусликов. Также на роль потенциальных регуляторов процессов гибернации претендуют и другие пептиды - ог-МСГ, ВИЛ, соматостаин (Aponte G. et al., 1984), холецистокинин (Jansky L., 1990), глюкагон (Inokuchi A. et al., 1984).
На важность значения пептидов в регуляции процессов гибернации указывает и факт изменения содержания некоторых из них в тканях животных
при гибернации. Так Muchalinski было отмечено увеличение концентрации таламического бомбезина, таламического и гипоталамического нейротензина и мозжечкового соматостатина у гибернирующих сусликов по сравнению с активными летними животными (Muchalinski А.Е, et al., 1983).
В настоящее время описаны свойства некоторых пептидов, способных инициировать состояние, близкое процессу гибернации, как у гибернантов, так и у незимоспящих животных. К их числу относятся такие соединения, как, например, неиротензин, бомбезин, опиаты, некоторые нейромедиаторы (Beckman A.L. et al., 1981).
Неиротензин представляет собой 13-аминокислотный пептид, локализованный в ткани мозга. Внутривенная инъекция этого вещества крысам вызывает гипотермию тела и гипергликемию. У мышей неиротензин вызывает падение температуры тела на 3 С в течение 30 мин (Осадчий О.Е., 2004).
Мощным гипотермическим агентом оказался также пептид с молекулярной массой 1,4 кДа - бомбезин, выделенный из кожи лягушек-жерлянок (Bombina sp.) и головного мозга млекопитающих (Пастухов Ю.Ф. и др., 1983). Было показано (Hawkins M.F. et al., 1983), что микроинъекции бомбезина в различные отделы головного мозга крыс вызывали гипотермические эффекты различной степени выраженности. При внутривенном введении крысам в дозе 0,1 мг он более эффективен, чем неиротензин, вызывает гипотермию и значительное снижение потребления кислорода. Возможно, что бомбезиновая гипотермия опосредуется торможением метаболизма. При определении содержания бомбезина в разных отделах мозга суслика Spermophilus lateralis было установлено (Oeltgen P.R. et al., 1985), что его содержание в гипофизе в 6 раз выше, чем у крыс, хотя его концентрация в коре больших полушарий исследованных животных одинакова. Кроме того, показано, что концентрация бомбезина в таламусе меняется при различных состояниях суслика (Muchlinski А.Е. et al., 1983).
Имеются сведения об участии в поддержании состояния зимней спячки таких нейропептидов, как лей- и мет-энкефалины, а также /3-эндорфины. Опиоидным пептидам отводится значительное место в регуляции спячки (Margules D.L., 1979; Kramarova L.I. et ah, 1983). В 1979 году Margules выдвигал теорию, согласно которой характеризовал зимнюю спячку, как "опиоидныи синдром". Рассматривая гибернацию, как адаптацию к голоданию, Margules сравнивал эффекты действия опиоидных пептидов с состоянием отдельных физиологических систем при голодании и приходил к выводу, что они подобны (Margules D.L., 1979). Сопоставляя собранные Margules материалы о состоянии различных физиологических систем при действии опиоидных пептидов с известными в литературе сведениями о характере их функционирования во время спячки, Крамарова Л.И. и соавторы отмечали правомерность этой гипотезы. В ее статье (Крамарова Л.И. и др., 1984) приводятся результаты сопоставления физиологических эффектов действия jS-эндорфина (по Margules) с особенностями физиологических функций во время зимней спячки (Слоним А.Д., 1971). Однако высказываются сомнения по поводу правомерности проводимой Margules полной аналогии между спячкой и голодом. Иллюстрируя свои соображения, авторы приводят в пример оценку состояния эндокринной системы при спячке и при голоде. Во время спячки в отличие от голода не происходит активирования функции гипофизарно-адреналовой системы.
К одному из доказательств участия опиоидной системы в регуляции гибернации можно отнести работу Peter Oeltjen и Sita Nilekani (Oeltjen P.R., Nilekani S., 1988). В опытах по введению селективных агонистов д-, к- и рс2-рецепторов летне-активным тринадцатиполосным сусликам было показано, что 5-селективный аналог энкефалинов DADLE (1,5 мг/кг в день) вызывает спячку у сусликов подобно HIT (выделенному из крови гибернирующих животных "триггеру" спячки). А /^-селективные морфин (1,5 мг/кг в день) и морфицептин (0,82 мг/кг в день), а также к-селективный опиоид динорфин А (0,82 мг/кг в
день), не только не вызывают спячку у сусликов, а препятствуют спячке, вызванной HIT.
2.8. Поиск триггера спячки
Более сорока лет назад в литературе стали появляться сообщения о том, что в экстрактах мозга и периферических тканях животных, находящихся в состоянии спячки, присутствуют вещества, вызывающие гипометаболический и гипотермический эффекты при введении лабораторным животным (Swan Н., Jenkins D., Knox К., 1968; Swan Н., Schatte С, 1977; Swan Н., Becker P.L., Schatte С, 1981).
Первые работы, направленные на поиск новых эндогенных веществ -"тригерров" зимней спячки в тканях гибернирующих животных, были выполнены A.R. Dawe и W.A. Spurrier (Dawe A.R. and Spurrier W.A., 1968, 1969, 1971). В крови гибернирующих сусликов ими был обнаружен такой "триггер" (HIT, молекулярная масса меньше 5 кДа), системное введение которого животным того же вида сопровождалось развитием длительного оцепенения типа зимней спячки.
Однако эти работы были подвергнуты критике со стороны многих специалистов, занимающихся этой проблемой. Оставались неясными или противоречивыми некоторые методические вопросы этой работы, такие, как сохранение активности "триггера" при температуре выше 20 С, выделение его из плазмы или сыворотки крови, зависимость эффекта от вида системной инъекции и т.д. (Lyman СР. et al., 1982). Следует добавить, что экспериментальные попытки воспроизвести данные Dawe A.R. и Spurrier W.A. другими исследователями привели к отрицательным результатам (Galster W.A., 1978; Abbotts В. et al., 1979).
В 1968 г. Swan и соавт. сообщили, что экстракт из головного мозга двоякодышащей рыбы — эфиопского протоптера (Protopterus acthiopicus) -
находящейся в состоянии летнего оцепенения, содержит антиметаболический агент, при введении которого белым крысам наблюдается снижение скорости метаболизма на 35% и температуры тела на 5 С (Swan Н. et al., 1968, 1977). При выяснении природы выделенного из мозга двоякодышащих рыб фактора, вызывающего антиметаболический эффект и снижение температуры тела, оказалось, что им является пептид, подавляющий синтез ДНК, РНК и белка (Reinhard F.G., 1981; Amorese D.A. et al., 1982).
В 1977 году Swan и Schatte выделили антиметаболический экстракт (анаболон) из мозга тринадцатиполосных сусликов Citellus trudecemlineatus. В первые тридцать минут после внутривенного введения экстракта крысам, у них снижалось потребление кислорода до 35 % от контрольного значения. Через 1,5 часа скорость потребления кислорода восстанавливалась. Экстракт обладал и гипотермическим эффектом - снижал температуру тела крыс, более чем на 5,25 С. При этом кривая падения температуры тела по времени отставала от кривой снижения уровня метаболизма (Swan Н. et al., 1977, 1981). Эта закономерность характерна для животных, впадающих в спячку.
Кроме названных свойств оказалось, что экстракт способен вызывать в культуре клеток китайского хомячка снижение синтеза ДНК и РНК, и замедлять смену клеточного цикла (Amorese D.A. et al., 1982). Очистка показала, что молекулярный вес активной компоненты экстракта лежит в пределах 1-10 кДа. Авторы предположили, что в составе анаболона содержится пептид, секретируемый в гипоталамусе и действующий на преоптическую зону. Попытки расшифровать структуру хотя бы одного пептида из экстракта не увенчались успехом из-за отсутствия адекватной тест-модели отбора активных соединений. Хотя цитируемая работа по объективным причинам не была завершена, следует отметить, что ее появление послужило поводом для исследования ряда соединений, предположительно участвующих в регуляции процессов гибернации. Как оказалось, ни одно из исследуемых веществ (бомбезин, холецистокинин и др.), а также фракция из экстрактов мозга
активных животных действия подобного анаболону не имеют. Эти эксперименты показали необходимость продолжать исследования гипометаболического и гипотермического эффекта фракции из мозга зимоспящих животных.
В работе Руит (Ruit К.А. et al., 1987) установлено, что внутривенное введение 13-полосным сусликам плазмы крови или ее альбуминовой фракции, выделенной у черных медведей в состоянии зимнего оцепенения, вызывает изменение, характерное для летней спячки.
Подобный фактор был обнаружен в крови сусликов (Oeltgen P.R. et al., 1978), находившихся в состоянии зимней спячки. Концентрация этого фактора в крови начинала возрастать осенью и прогрессировала после наступления спячки. Введение диализата, полученного из оттаявшей после замораживания сыворотки крови спавших животных, вызывало спячку у эутермных взрослых особей того же вида, а также и у 6-недельных сусликов, которым в этом возрасте спячка вообще не свойственна (Abbotts В. et al., 1979). Диализат вызывал также спячку при введении его гибернантам другого вида -североамериканским лесным суркам (Mormota топах). Подобная спячка, искусственно провоцируемая введением сыворотки крови различных гибернирующих животных, развивалась у сусликов Citellus tridecemlineatus -также и в летнее время (Dawe A.R. et al., 1969). В этих работах было определено, что "фактор зимней спячки" не обладает видоспецифичностью, его молекулярная масса менее 10 кДа. По уточненным данным работы (Swan Н. et al., 1981) молекулярная масса этого агента составляет 1-1,4 кДа и по своей природе это низкомолекулярный пептид, общий для всех зимоспящих грызунов. Имеются данные о том, что вызывающий гибернацию фактор в плазме крови связан с альбуминовой фракцией, относительно термолабилен, чувствителен к протеазам и не атакуется нуклеазами (Oeltgen P.R. et al., 1980).
Было показано, что внутрижелудочковое или внутривенное введение макакам альбуминовой фракции (молекулярная масса свыше 70 кДа),
выделенной из сыворотки крови гибернирующих сурков, вызывает отчетливое уменьшение количества потребляемой пищи (Meeker R.B. et al., 1980). Далее было установлено, что внутрижелудочкавая инъекция этой фракции в дозе 4 мг вызывает снижение ректальной температуры (на 1,5 С) и снижение потребления пищи в течение 24-36 часов наблюдения (Myers R.D., 1981). При увеличении дозы до 8 мг температура мозга снижается в среднем на 2,5 С с восстановлением ее уровня к 10-му часу после инъекции, частота сердцебиений максимально уменьшается на 43-50 %, а гипофагия наблюдается в течение 5-7 дней (Oeltgen P.R., 1982). Артериальное давление снижается на 20-25 %. Все эти изменения воспроизводятся при внутривенном введении "триггера" в дозе 50 мг; при этом гипофагия длится около 3 недель. Введение "триггера" сопровождается также снижением клиренса креатинина и тенденцией к уменьшению образования мочи и креатинина (Spurrier W.A. et al., 1985). Через 10-15 минут после инъекции отмечены выраженные изменения поведения: срыгивание, зевота, сонливость опускание головы и закрывание глаз. Такое состояние длится до 3-5 часов. Инъекция альбуминовой фракции, выделенной из сыворотки крови сурков в летний период, не вызывала подобных эффектов или вызывала незначительные изменения изученных показателей.
Применение блокаторов опиатных рецепторов налтрексона (200 мкг в боковой желудочек мозга) или налоксона (30 мкг/кг внутривенно) устраняет гипофагию, гипотермию и брадикардию, уже через несколько минут обезьяна становится оживленной, периоды сонливости резко сокращаются. Авторы полагают, что альбуминовая фракция из сыворотки крови гибернирующих сурков является носителем опиатоподобного пептида, регулирующего процесс вхождения в спячку. Этот пептид продуцируется в мозге и соединяется с находящимся в крови альбуминовым носителем. Животные, не впадающие в оцепенение, по-видимому, имеют рецепторные участки в мозге, которые способны реагировать с этой активной молекулой (Oeltgen P.R. et al., 1982; Spurrier W.A. et al., 1985; Oeltgen P.R. et al., 1988).
Высказывается гипотеза, что молекула "триггера" синтезируется главным образом у зимоспящих животных, хотя приматы, не впадающие в оцепенение, по-видимому, имеют также рецепторные участки в мозге, которые способны реагировать с активной молекулой триггера (Lyman СР. et al., 1955).
Предполагается, что "триггеры спячки" могут оказывать прямое действие на темпы синтеза белков в ходе подготовки активных животных к состоянию зимней спячки. Например, показано, что эритропоэтические ткани гибернирующих сусликов чувствительны к прямому влиянию "триггера", включая в работу механизм, приводящий к повышенному синтезу молекул гемоглобина, легко связывающих кислород в тканях, несмотря на то, что температура тканей при этом гораздо ниже физиологической. Считают, что "триггер" изменяет структуру и функцию не только кислородпереносящих белков эритроцитов, но и мембраны клеток. Например, в состоянии гибернации в крови сусликов появляются особые формы эритроцитов, которые отличаются повышенной осмотической и деформационной пластичностью. Такие эритроциты более лабильны по сравнению с нормальными и поэтому легче проходят через спазмированные кровеносные сосуды во время гибернации (Гулевский А.К., 1991).
2.9. Эффекты фракций из тканей гибернантов
Внутрибрюшинное введение экстрактов эпителия тонкого кишечника гибернирующих сусликов (Citellus. Parryi Rich., С. undulatus) мышам вызывает снижение потребления кислорода на 50%, понижение температуры тела на 5-14 С, подавление дрожательного термогенеза, снижение сердечного ритма, снижение двигательной активности. Эти изменения физиологических функций длятся 30-40 часов. Экстракты из кишечника летне-активных сусликов не вызывают подобных эффектов (Пастухов Ю.Ф., Чепкасов И.Е., 1983).
Исходя из предположения, что гипометаболические и гипотермические факторы являются невидоспецифическими и эволюционно закрепленными
регуляторами физиологических процессов, как гибернирующих, так и незимоспящих теплокровных животных, Ахременко А.К. с соавторами была предпринята попытка вести поиск антиметаболических факторов у адаптированных к холоду животных (Ахременко А.К. и др., 1991). Исследовать влияние фракции 1-10 кДа из мозга холодоадаптированного животного, якутской лошади, на подавление физиологических функций и биосинтетических процессов в тканях белых мышей. Якутская лошадь -уникальная порода лошадей, выведенная методом народной селекции — обладает рядом биологических особенностей (Алексеев Н.Д., 1984). К зиме она накапливает большое количество жира с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот. В сильные морозы (ниже -50 С) у нее отмечается резкое снижение локомоторной активности с подавлением уровня потребления кислорода.
Авторы показали, что фракция с Мг 1-Ю кДа, выделенная из мозга якутской лошади, подобно фракции из тканей гибернирующих животных вызывает значимый гипометаболический эффект при введении теплокровным животным. А именно, подавляет суммарный синтез белка в клетках печени и сердце крыс, а также вызывает гипотермию у мышей, сопоставимую с гипотермией вызванной фракцией из гибернирующих животных (Сухова Г.С. и др., 1990; Ахременко А.К. и др., 1991; Терещенко О.С. и др., 1994; Игнатьев Д.А.идр.,2004).
Д.А. Игнатьев с соавторами (1987), изучая действие аналогичной по массе фракции из мозга, кишечника, крови и действие мочи гибернирующих животных показал, что апликация этих веществ в дозе 0,2 мг в 10 мкл на кору мозга суслика вызывала снижение температуры мозга с 32 С до 30 С, а также ректальной температуры. Причем, фракции Mr < 1 кДа и > 10 кДа снижали ректальную температуру на 2-3 С, с максимумом на 25-30 мин, а фракция Mr = 1-10 кДа - на 6-7 С, с максимумом на 45-50 мин. Нормальная ректальная температура в первом случае восстанавливалась через 1-1,5 ч после введения,
во втором - через 4-5 ч. Фракции Mr < ІкДа и 1-10 кДа в дозе 1 мг/r при внутрибрюшинном введении приводили к снижению потребления кислорода у белых мышей на 45 %. Максимум наблюдался через час после инъекции. После очистки было показано, что наибольшей активностью обладают компоненты с Mr = 0,9-1,45 кДа (Игнатьев Д.А. и др., 1987).
Инъекция экстракта из мозга спящего суслика в латеральный желудочек мозга крысы приводила к увеличению выраженности низких частот (2,5 - 4,5 Гц) в ЭЭГ (Воробьев В.В. и др., 1987). В институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН из тканей зимоспящих животных были получены экстракты, обладающие гипометаболической активностью (Иваницкий Г.Р. и др., 1982). Было показано, что факторы, содержащиеся в экстрактах, полученных от зимоспящих животных во время спячки, вызывают специфичные для гипобиоза изменения и у теплокровных и у холоднокровных животных (Хомутецкая О.Е. и др., 1986). После введения экстракта гибернирующих животных лягушкам, у тех возникало состояние, которое по энцефалограмме было чрезвычайно близко к естественной форме покоя П-2. Центральное действие экстракта проявлялось в изменениях ЭЭГ и четко обнаруживалось в течение приблизительно 6 часов. Периферическое действие (изменение мышечного тонуса, частоты сердечных сокращений и т.д.) сохранялось на протяжении 24 часов и более. На основании полученных результатов и имеющихся литературных данных авторами было высказано предположение о существовании однотипных рецепторов для восприятия этих факторов во всем ряду позвоночных.
Внутрибрюшинное введение фракций Mr = 1,6-2 и 1,3 кДа из мозга якутского суслика белым мышам в дозе 30 мкг/кг вызывала падение ректальной температуры с 38 до 34,5 С и с 38,8 до 36 С, соответственно. Максимальный эффект наблюдался через 2,5-4,5 часа (Swan Н., Schatte С, 1977; Swan Н., et al., 1981).
Из эпителиального слоя кишечника сусликов (Citeillus undulatus и С. parryi) в состоянии спячки выделен активный фактор, вызывающий антиметаболический эффект после его внутрибрюшинного введения белым мышам (Иваницкий Г.Р. и др., 1982). В дозе 0,5 мг/г этот фактор снижал температуру тела у мышей за 1 ч на 3,5 С, а при дозе 2 мг/г температура тела падала до 33,6 С и ниже. Максимальное снижение температуры тела мышей до 25 С после введения экстракта кишечника гибернирующих сусликов в дозе 2 мг/г наблюдалось через 6-7 ч. Если введение экстракта кишечника суслика в дозе 0,5 мг/г не вызывало изменения уровня потребления ( у мышей, то после введения экстракта в дозе 1 мг/г уровень метаболизма снижался на 61%, а в дозе 2 мг/г - на 76%. При этом после введения мышам экстрактов из ткани кишечника гибернирующего суслика вначале снижалось потребление О2, а затем падала температура тела.
Введение подобного экстракта, полученного из кишечника эутермных сусликов (Citellus undulatus и С. suclicus) сопровождалось менее выраженным эффектом. По данным Ю.Ф. Пастухова и И.Е. Чепкасова (Пастухов Ю.Ф. и др., 1983), при введении кишечного экстракта гибернантов потребление 02 снижалось на 80% в течение 3-4 ч, температура тела падала на 13,7 С, уменьшались сократительный термогенез в мышцах и наблюдалась брадикардия. Подобного рода эффекты были описаны позднее и в других работах (Игнатьев Д.А. и др., 1987).
По данным Д.А. Игнатьева (Игнатьев Д.А. и др., 1989) состояние пролонгированной гипотермии (более 3,5 часов при температуре окружающей среды равной 16 С) можно вызвать инъекцией белым мышам фракции с молекулярной массой 1-10 кДа дозе 0,7 мг/кг, выделенной из тонкой кишки гибернирующего суслика (Citellus undulatus) в сочетании с искусственным 2-часовым гипоксическо-гиперкапническим воздействием. Сама фракция в данной концентрации оказывала гипотермическое влияние в течение 2-2,5 ч
РОССИЙСКАЯ
ГОСУДАРСТВЕННАЯ . БИБЛИОТЕКА
Последующие эксперименты с отдельными фракциями и промежуточными продуктами выделения показали, что для всех исследованных тканей (головной мозг, тонкий кишечник, кровь) максимальной удельной активностью обладают фракции с молекулярной массой 1-10 кДа (Круман И.И. и др., 1986; Игнатьев Д.А. и др.,1987; Воробьев В.В. и др., 1987). В результате серий последовательных разделений фракции массой до 1 кДа, проведенных в ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (РАН), и тестирования биологической активности фракций на кафедре ФЧЖ МГУ им. М.В. Ломоносова была определена фракция sia'3, обладающая наибольшим ингибиторным кардиотропным действием на изолированное сердце лягушки. Метод ЯМР показал, что активный компонент исследуемой фракции - АМФ и пептид неокиоторфин. В последствии АМФ был обнаружен и во фракции 1-10 кДа (Негуляев О.В. и др., 1995). Кроме АМФ в составе фракций были обнаружены и другие пуриновые нуклеотиды, идентифицированные впоследствии, как АТФ, АДФ, АДФ-рибоза, ГМФ и другие (Сухова Г.С. и др., 1998; Ляшков А.Е. и др., 1999).
Показано, что пептидные фракции из тканей гибернирующих и холодоадаптированных животных обладают ингибирующим кардиотропным действием. А именно, фракции с Mr < 1 кДа и 1-10 кДа из мозга и сердца гибернирующих сусликов, фракции Mr = 1-Ю кДа из мозга холодоадаптированной якутской лошади и зимнего бурого медведя в концентрации 2*10"6 до 9-Ю'5 г/л ингибируют работу изолированного сердца лягушки. При действии аналогичных фракций из летних животных ингибиторные эффекты были менее выражены, а фракции из мозга летней якутской лошади и сердца летнего суслика имели активирующее действие (Сухова Г.С. и др., 1989, 1990; Негуляев О.В., 1996). В работе Г.С. Суховой с соавторами (1990), кроме того, было показано, что пептидные фракции с Mr = 1-10 кДа вызывают обратимое угнетение работы изолированных сердец теплокровных незимоспящих животных (кролика, кошки). Также было
обнаружено, что в состав фракций входят и нуклеотиды, в частности АМФ, который обладает мощным ингибирующим кардиотропным эффектом. Авторами делается предположение о совместном ("букетном") действии различных компонентов фракций.
Гипобиоз и зимняя спячка
Гипобиоз (hipobiosis - от греческого hypo - под, низко и bios - жизнь) -это обратимое снижение метаболизма (снижение потребления кислорода и снижение потребности в кислороде) относительно его уровня у животного в активном состоянии. В природе естественный гипобиоз обеспечивает выживание организма в экстремальных условиях. Примером естественного гипобиоза могут служить разные виды спячки. Спячка - состояние пониженной жизнедеятельности, наступающее у животных в периоды, когда пища становится малодоступной и сохранение высокой активности и интенсивности обмена веществ невозможно. По длительности и по внешним условиям, провоцирующим спячку, различают суточную спячку (у летучих мышей, колибри и других), сезонную (зимнюю и летнюю) и нерегулярную - при внезапном наступлении неблагоприятных условий (у белок, енотовидной собаки, стрижей, ласточек и других).
Характерное для всех видов спячки сильное снижение метаболизма наиболее выражено у зимоспящих животных. Во время спячки происходит резкое угнетение деятельности всех систем организма. Например, у длиннохвостого суслика {Citellus undulatus) потребление кислорода снижается до 2 % от исходного уровня, температура тела падает до 4-5 С, частота сердечных сокращений с 200 до 10 ударов/мин., частота дыханий до 1-2 в минуту (Toien О. et al., 2001).
Зимняя спячка или гибернация (от лат. hybernus - зима и hybernar -перезимовать) у разных видов животных протекает по-разному и имеет свои характерные особенности. Она отмечается при наступлении холодов у многих видов, отличающихся по своим морфологическим, физиологическим и экологическим признакам. В настоящее время известны зимоспящие животные по крайней мере среди 5 отрядов млекопитающих (Folk G.E., 1974). Классическими примерами зимоспящих животных являются суслики, сони, ежи, сурки, некоторые виды летучих мышей (Слоним А.Д., 1971, 1979; Morrison P., Galster W., 1975; Чернявский Ф. Б. 1977). В активный период жизнедеятельности они являются гомойотермами, то есть животными с постоянной температурой тела, а при наступлении неблагоприятных условий среды (бескормица, похолодание) впадают в спячку, и температура их тела зависит от температуры окружающей среды.
Длительность зимней спячки может достигать 6-8 месяцев. Время пребывания в спячке и в бодрствующем состоянии индивидуально и зависит от многих причин, в числе которых вес животного, внешняя температура, наличие еды и т.д. Своеобразным рекордсменом продолжительности спячки является колумбийский суслик, впадающий в спячку в августе и остающийся неактивным на протяжении всей осени и зимы; выходит он из норы только в мае следующего года.
Во время спячки животные эпизодически просыпаются. Периоды, в течение которых животные засыпают, спят и пробуждаются, называются баутами (Lyman СР. et al., 1982; Kayser С, 1965). Бауты могут быть различной длительности и продолжаться от нескольких часов до нескольких недель (Соколов В.Е. и др., 1995). В перерывах между баутами животные возвращаются на несколько часов в эутермное состояние, при этом у них усиливается окисление недоокисленных продуктов метаболизма, значительно возрастает глюконеогенез, из организма удаляются экскреты (Galster W.A., Morrison P.R., 1975).
Другой формой сезонной спячки является летняя спячка или эстивация (от лат. aestas - лето). Эстивация — сонное, неактивное состояние, наступающее у некоторых животных при неблагоприятных условиях во время летней засухи, когда становится невозможным добывать пищу и воду. Летняя спячка отличается от зимней только степенью замедления интенсивности физиологических процессов. В летней спячке у млекопитающих оцепенение глубокое (Калабухов Н.И., 1956), но поскольку температура тела животных значительно выше, чем в период зимней спячки, обмен веществ происходит достаточно интенсивно.
Существующее в физиологии определение гибернации, как состояния оцепенения со значительным понижением температуры тела и метаболизма, позволяет использовать его и для пойкилотермных позвоночных (Эмирбеков Э.З., Львова СП., 1991).
Энергетический метаболизм при зимней спячке эктотермных позвоночных и истинных гибернантов имеет много общих закономерностей. В сентябре - августе (в период подготовки к спячке) у амфибий и рептилий, подобно млекопитающим, происходит депонирование энергетических субстратов: углеводов и жиров. Накопление гликогена в печени перед гибернацией присуще различным видам амфибий, рептилий, млекопитающих.
Перед спячкой, как у эндо-, так и эктотермных животных увеличивается содержание макроэргических фосфатов. Холодовое оцепенение амфибий и рептилий, подобно гибернации млекопитающих, ведет к значительному понижению содержания депонированного в печени гликогена, вместе с тем содержание макроэргических фосфатов и неорганического фосфора поддерживается на высоком уровне вследствие снижения их использования. На основании данных, полученных при изучении энергетического обмена во время гибернации в тканях животных, представляющих разные филогенетические группы (амфибии, рептилии, млекопитающие), Эмирбеков Э.З. сделал заключение, что эти изменения имеют, как черты различия, так и сходства, причем последние превалируют. Физиологические изменения и особенности у гибернантов во время спячки Основное отличие гибернантов от негибернантов - способность к согласованному на всех уровнях (субклеточном, клеточном, тканевом, органном) переходу от состояния бодрствования к состоянию спячки. Особенности дыхания во время спячки Значительно изменяется во время спячки дыхание. В этот период дыхательный центр угнетен, понижена его чувствительность к углекислоте, уменьшена легочная вентиляция (Kayser С, 1961). Средняя частота дыхания у спящих сусликов составляет 1-2 дыхательных движения в минуту. Повышение порога чувствительности дыхательного центра к гипоксии настолько значительно, что животные довольно длительное время не реагируют на эвисцерацию и перевязку аорты (Лауэр Н.В., 1959). Пробуждение от спячки характеризуется возрастанием частоты дыхания. Вскоре после пробуждения она составляет уже 160 дыхательных движений в минуту (Landau B.R., Dawe A.R., 1958;KayserC.,MalanA., 1963).
Модели искусственного гипобиоза
В природе обычные эутермные животные не впадают в спячку. Они противостоят охлаждению усилением теплопродукции. Однако есть основания полагать, что зимняя спячка осуществляется с помощью механизмов, функционирующих и у незимоспящих теплокровных (Mrosovsky N., 1971).
В исследованиях французского физиолога Поля Бэра на сонях (Bert Р. 1870) экспериментально показана возможность охлаждения животных при температуре среды 12 С в замкнутом сосуде, содержащем поглотитель С02. В опытах на зимоспящих животных Рафаэль Дюбуа (Dubois R. 1896) обнаружил в их крови высокий уровень С02 (почти в два раза выше нормы). Помещая животных (сурки, кролики) в искусственную газовую среду с большой концентрацией С02 (до 45%) при пониженной температуре, автор наблюдал развитие состояния, напоминающего зимнюю спячку. Таким же образом, А.П. Вальтеру удалось охлаждать кроликов до 20 С с сохранением их жизнеспособности (Вальтер А.П., 1863).
Отечественный исследователь П.И. Бахметьев сообщал, что теплокровных животных не удается охладить до температуры ниже 20С. Далее, в сообщении говорилось, что теплокровных животных следует сначала перевести в состояние животных с "переменной температурой", т.е. пойкилотермных. Этого можно добиться, используя "аутонаркоз" - смесь углекислого газа с кислородом в соотношении 2:1, подобно тому, как в природе происходит с зимоспящими животными в период спячки (Бахметьев П.И., 1901, 1912). У животных-гибернантов в закупоренной норе имеется именно такое соотношение (Baudinette R.V., 1974; Винокуров Н.В., Ахременко А.К., 1982). Эту идею Бахметьеву удалось осуществить на зимоспящей летучей мыши (Бахметьев П.И., 1902).
J. Giaja (Giaja J., 1953; Giaja J., Markovic L., 1953), Анджус P.K. (Andjus R.K. 1955; Анджус P., Хозич H., 1965) и A. Smith (1955) тоже охлаждали мелких животных в замкнутом сосуде в условиях постепенно нарастающей в процессе дыхания гипоксии-гиперкапнии. Гипоксия и гиперкапния увеличивают проницаемость гемато-энцефалического барьера (Кассиль Г.Н., 1963), что тоже может способствовать регуляции гипобиоза. Этот метод и сейчас применяется в эксперименте. С его помощью мышей удается охладить на 10 С при температуре среды 23 С (Игнатьев Д.А. и др., 1987, 1989).
Другой способ заключается в создании нужного разряжения в барокамере и/или дозированной подаче С02 (Тимофеев Н.Н., 1983, 1997). Такой способ позволяет с высокой точностью поддерживать требуемые условия среды.
Гипоксическая газовая среда способствует охлаждению животного, угнетая окисление (Иванов К.П., 1965, 1972), а, следовательно, и термогенез в мышечной ткани. Помимо того, во время охлаждения гипоксия, действуя центрально, приводит к снижению потребления кислорода и, следовательно, меньшему расходу энергетических резервов. Это в свою очередь позволяет мозгу не испытывать гипоксии и ишемии во время восстановления животного.
На последующих этапах охлаждения гипотермия приводит к угнетению дыхательного центра, что в свою очередь приводит к усилению гипоксического влияния. Углекислота является дополнительным фактором, тормозящим окисление (Репин И.С., 1961; Маршак М.Е., 1969) и термогенез. Поэтому для организмов с наиболее мощной системой терморегуляции, например, кроликов, вместе с гипоксией используют гиперкапнию. Гипотермия является стрессорным агентом. Она приводит к выбросу катехоламинов в кровь. Так секреция адреналина возрастает на 694 %, а норадреналина - на 228 % (Popovic V.M., Davidovic V., 1972). Катехоламины активируют свободное окисление, разобщая окисление и фосфорилирование. А гипоксия-гиперакпния "восстанавливает" возникшее разобщение окисления и фосфорилирования, тем самым, препятствуя термогенезу. Затем, после охлаждения организма ниже 32 С, наступает холодовая переферическая и центральная блокада термогенеза (Малыгин A.M., 1969; Малыгин A.M., Логинов СИ., 1978).
Альтернативным способом создания искусственного гипобиоза у пойкилотермных животных является охлаждение с предварительным введением нейроплегических смесей (Laborit Н., Huguenard Р., 1951, 1953; Laborit Н. et ah, 1965).
Основным компонентом нейроплегической смеси является аминазин. Он обладает выраженным адренолитическим действием (блокирует центральные адренергические и дофаминергические рецепторы, препятствует захвату катехоламинов, снижает проницаемость мембраны гранул, в которых хранятся депонированные катехоламины, затрудняя их выход из депо) и слабым антигистаминным действием (блокада Н1-рецепторов), угнетает двигательную активность, вызывает миорелаксацию, тем самым, снижая интенсивность терморегуляторных реакций (Белошицкий П.В., 1966). В комбинации с аминазином используются антигистаминные препараты (димедрол, пипольфен) и наркотические анальгетики (в основном, промедол, который усиливает блокирующее действие аминазина на терморегуляторные центры и тормозит функцию симпатоадреналовой системы (Тимофеев Н.Н., 1983).
Н.Н. Тимофеевым (1983, 1997) было предложено еще несколько способов снижения метаболизма у животных, основанных на воздействии на постганглионарные симпатические нервные окончания, содержащие норадреналин. Первый принцип, предложенный автором, заключается в опустошении депо катехоламинов с помощью алкалоида резерпина в дозе 1,2-1,5 мг/кг крысам или 0,8 мг/кг кроликам внутримышечно. Опустошение депо катехоламинов происходит медленно, и их уровень в органах и тканях достигает минимума через 15-20 часов после введения препарата. Но при большом дефиците катехоламинов животные не имеют возможности самостоятельно выйти из гипобиоза, так как катехоламины необходимы для активации термогенных процессов. Второй принцип основан на блокаде высвобождения нейромедиатора из адренергических нейронов. С этой целью авторы использовали орнид в дозе 30-50 мг/кг внутри брюшинно. Максимальный эффект термоблокады развивался через 1-1,5 часа, уровень метаболизма при этом падал на 30-40 % при сохранении нормотермии. Функционально по поведенческим реакциям этот этап нормотермического гипометаболизма соответствует известному у зимоспящих состоянию "предрасположенности" к впадению в спячку. Третий и четвертый принципы получения гипометаболизма заключаются в блокаде синтеза катехоламинов в адренергических нейронах с помощью метилпаратирозина и образования "ложного" адренергического медиатора путем введения метил-Дофа. Каждый из вышеприведенных препаратов использовался, как самостоятельно, так и в комбинации с другими, а также в сочетании с иммобилизацией и/или гипотермией. Уровень потребления кислорода у животных падал на 20-50 % от нормы, температура тела на 4-8 С.
Температура и ЧСС у крыс в модели гипобиоза, протекающего на фоне действия НКТ
В следующей серии экспериментов исследовали влияние НКТ на температуру и ЧСС крыс при их погружении в гипобиотическое состояние. С помощью подкожных электродов регистрировали ЧСС, а температуру тела посредством подкожного термодатчика. Состояние гипобиоза у крыс добивались охлаждением на фоне нарастающей гипоксии-гиперкапнии. Для этого после введения пептида крыс помещали в герметично закрытый сосуд, который переносили в холодильную камеру при температуре воздуха -10 С, где животных содержали в течение двух часов. ВремяИзменение температуры тела крыс при охлаждении в условиях нарастающей гипоксии-гиперкапнии на фоне введения НКТ (1,5 мг/кг) или физраствора (контроль). -р(и) 0,05;п=9, И
Как видно из рисунка 11, со временем в условиях гипотермии при нарастающей гипоксии-гиперкапнии температура крыс равномерно снижалась с 38 С до 15 С. У группы животных, которым предварительно внутрибрюшинно вводили НКТ в дозе 1,5 мг/кг, в районе 40-60 минут охлаждения наблюдалась достоверно более низкая температура тела (25 С) по сравнению с контролем (28 С). ЧСС, уд/мин Изменение частоты сокращения сердца у крыс в условиях нарастающей гипоксии-гиперкапнии при введении НКТ (1,5 мг/кг) и физраствора. -Р(и) 0,05;п=9, 11 Частота сокращения сердца у контрольной группы равномерно снижалась от 440 до 46 уд/мин (рис. 12). При этом у крыс, которым вводили НКТ, было замечено достоверно более сильное падение сердечного ритма (196 уд/мин) по сравнению с контролем (264 уд/мин) к тридцатой минуте охлаждения. После 60-ой минуты, не было значимых различий в изменении сердечного ритма у опытных и контрольных животных. Эксперименты этой серии проводились при комнатной температуре (22 С). У мышей регистрировали ЭКГ. Интраназальное введение НКТ в дозе 0,015 мг/кг не изменяло сердечный ритм мышей, который составлял 450±10 уд/мин. Интраназальное введение НКТ в дозе 0,15 мг/кг также не повлияло на сердечный ритм мышей (рис. 13). Внутрибрюшинное введение НКТ в дозах 0,015 и 0,15 мг/кг не изменяло сердечный ритм мышей, который также составлял 450±10 уд/мин. Введение НКТ в еще большей дозе - 1,5 мг/кг опять оказалось не эффективным (рис. 13).
Перечисленные варианты введения и концентрации НКТ не привели к значимым изменениям сердечного ритма у мышей (рис. 13). ЧСС, уд/мин Интраназальное Интраназальное Внутрибрюшинное Внутрибрюшинное Внутрибрюшинное введение НКТ в введение НКТ в введение НКТ в введение НКТ в введение НКТ в дозе 0,015 мг/кг дозе 0,15 мг/кг дозе 0,015 мг/кг дозе 0,15 мг/кг дозе 1,5 мг/кг Н Исходно 0 После введения НКТ Рисунок 13. Частота сердечных сокращений у мышей до и через 5 минут после интраназального и внутрибрюшинного введения НКТ в различных дозах (п= 10, 10). 5.1.4. ЧСС у мышей в модели гипобиоза, протекающего на фоне действия НКТ В данной серии экспериментов исследовали влияние НКТ на ЧСС при погружении мышей в гипобиоз. После введения пептида мышей помещали в закрытый сосуд (0,8 л) и охлаждали (8 С) в условиях нарастающей гипоксии-гиперкапнии, возникавшей в результате дыхания животного. Указанные условия окружающей среды приводили к обратимому гипобиозу, выраженному в снижении частоты сердечных сокращений и угнетению двигательной активности. Результаты измерений приведены на рисунках 14-16. Интраназальное введение НКТ мышам перед охлаждением в дозе 1,5 мг/кг не привело к отличию ЧСС от контрольных (рис. 14). ЧСС, І Холод (4 С) уд/мин У Рисунок 14. Частота сердечных сокращений мышей во время охлаждения при интраназальном введении НКТ (1,5 мг/кг) мышам (п=10, 12). При внутрибрюшинном введении НКТ в дозе 0,015 мг/кг кривые снижения и восстановления сердечного ритма не отличались от контроля (рис. 15). Частота сердечных сокращений мышей во время охлаждения при внутрибрюшинном введении НКТ (0,15 мг/кг) мышам перед охлаждением. -p(U) 0,05;n=6, 11. Из рисунка 16 видно, что в контрольной группе во время охлаждения сердечный ритм мышей сначала повышался до 550-600 уд/мин в течение 15-20 минут. Затем, сердечный ритм постепенно снижался до 150 уд/мин в течение полутора часов. После этого гипотермию отменяли: животных вынимали из холодильной камеры и из сосудов и помещали в нормальные условия (комнатная температура, нормальный газовый состав) при этом сердечный ритм восстанавливался до исходного уровня (400-450 уд/мин) (рис. 16). В следующем опыте мышам вводили НКТ в концентрации на порядок большей (1,5 мг/кг). При этой дозе описанные эффекты более выражены (рис. 17). ЧСС, І холод (4 С) уд/мин Зависимость частоты сердечных сокращений от времени охлаждения при внутрибрюшинном введении НКТ (1,5 мг/кг) мышам перед охлаждением. -Р(и) 0,05;п=И, 13. После прекращения гипотермии мыши, которым вводили НКТ, гораздо медленнее восстанавливали сердечный ритм. В то время когда контрольные животные уже восстановили исходный ритм, у опытных мышей сердечный ритм был все еще довольно низким - около 200 уд/мин (рис. 17). В следующей серии экспериментов НКТ вводили на 100-й минуте, после достижения мышами температуры максимального охлаждения в условиях гипоксии-гиперкапнии. Животных помещали в комнатные условия для восстановления и в этот момент им вводили НКТ в дозе 1,5 мг/кг или физраствор.
Действие НКТ на препараты сердца in vitro
Для исследований in vitro изучали действие НКТ на работу изолированного сердца крысы, перфузируемого по стандартной методике ретроградной перфузии Лангендорфа. У изолированного сердца измеряли давление посредством катетера, введенного в левый желудочек. Неокиоторфин (10"5 М) не оказал значимого влияния на динамику давления и частоту сердечных сокращений.
В течение 30 минут до введения НКТ в перфузат и в течение 30 минут перфузии с НКТ (10" М) показатели работы сердца не изменялись и были сопоставимы с данными контрольных сердец: Диастолическое давление 18±5 ммрт.ст., систолическое давление 110±Ю мм рт.ст. (рис. 26), ЧСС 186±10 уд/мин (рис. 27). Давление,
Частота сердечных сокращений контрольных сердец и сердец, перфузируемых НКТ (п=5, 8). 5.3.2. Эффекты НКТ на изолированное сердце крысы после кардиоконсервирования Исследовалось действие НКТ на восстановление работоспособности сердца крысы после кардиоконсервирования. После получасовой перфузии сердце быстро (в течение 15 сек) снимали с установки и помещали в раствор без глюкозы и с высоким содержанием К+ (115мМ), в результате сердце останавливалось.
Затем в том же растворе сердце помещали в холодильную камеру (+4 С) на 2 часа, после чего подсоединяли к установке и возобновляли перфузию. При этом сердце находилось в состоянии контрактуры и по мере реперфузии контрактура ослабевала и двигательная активность сердца восстанавливалась, но далеко не полностью (рис. 28 а). мм рт. ст. Исходно Начало 80 Рисунок 28.
Пример восстановления формы кривой давления в левом желудочке во время реперфузии после двухчасового гипотермического кардиоконсервирования в контроле и после предварительного введения НКТ (2-1(Г6М), На кривой давления видно (рис. 28 а), что в контроле диастолическое давление плохо восстанавливается. Значительное возрастание конечного диастолического давления после консервирования связано с контрактурой сердца, повреждением эндотелия и появлением зон некроза.
Предварительная перфузия неокиоторфином приводит к лучшему восстановлению сердца во время реперфузии (рис. 28 б). Во время реперфузии после 2-х часового консервирования частота сокращений опытных сердец, которые предварительно перфузировались неокиоторфином, слегка понижена (139±4 уд/мин) относительно контроля (170±4 уд/мин) (рис. 29). ЧСС, уд/мин 200 контроль после перфузии НКТ
Частота сердечных сокращений контрольных сердец и сердец, перфузируемых НКТ через 30 минут после начала реперфузии (п=6, 7). Предварительная получасовая перфузия неокиоторфином в концентрации 2-10"6М способствует более быстрому восстановлению функций изолированного сердца во время реперфузии (рис. 28, 30). 4563 мм рт.ст. 120 Амплитуда Систолическое Конечное давление диастолическое давление И контроль Ш после перфузии НКТ Рисунок 30.
Давление в левом желудочке контрольных сердец и сердец, предварительно перфузируемых НКТ, через 30 минут после начала реперфузии. -p(U) 0,01; -p(U) 0,005; п=6, 7. I мм рт.ст Я 80 І 70 I 60 ; so І 40 S зо я м 20 g 10 Щ о с J " и - .__,. / — ич. : - - Время реперфузии о 30 НКТ контроль 50 мин Рисунок 31. Динамика восстановления амплитуды сокращения препарата изолированного сердца после получасовой предварительной перфузии НКТ в концентрации 2-Ю"6 М и двухчасовой гипотермической кардиоплегии, нулевое время соответствует моменту начала реперфузии
Похожие диссертации на Эффекты неокиоторфина как потенциального регулятора процессов гипобиоза
