Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Структура и функции тромбоцитов 14
1.2. Механизмы сигнальной трансдукции тромбоцитов 19
1.2.1. Мембранные рецепторы тромбоцитов 19
1.2.2. ГТФ-связывающж белки и эффекторные системы 25
1.2.3. Механизмы регуляции внутриклеточной концентрации кальция 27
1.2.4. Внутриклеточные механизмы изменения функционального состояния тромбоцитов 32
1.3. Нарушения функции тромбоцитов 37
1.4. Методы оценки функциональной активности тромбоцитов 41
1.5. Гранулометрический анализ, - анализаторы размеров частиц 47
Глава 2. Материалы и методы 55
Глава 3. Результаты исследования методологические аспекты
3.1. Основные принципы применения техники малоуглового светорассеяния для цитологических исследований 60
3.2. Описание разработанного лазерного анализатора микрочастиц «ЛАСКА» 65
3.3. Разработка нового метода оценки функционального состояния тромбоцитов 71
Глава 4. Физиологические аспекты
4.1. Оценка влияния пуриновых нуклеотидов на кинетические параметры активации и агрегации тромбоцитов 88
4.2. Изучение влияния блокаторов кальциевых каналов на кинетику активации и агрегации тромбоцитов 98
4.3. Исследование влияния БАВ, изменяющих внутриклеточную концентрацию циклических нуклеотидов, на функциональную активность тромбоцитов 102
4.4. Изучение влияния биологически активных веществ на функциональную активность тромбоцитов в условиях обращенного ЗНа+/Са2+-обмена 114
4.5. Изучение влияния агониста к-опиатяых рецепторов U50488 на кинетику активации и агрегации тромбоцитов 120
Глава 5. Клинические аспекты
5.1. Исследование развития рефрактерности тромбоцитов 124
5.2. Влияние ишемии/реперфузии мозга на тромбоциты крыс 128
5.3. Исследование функциональной активности тромбоцитов у больных ишемической болезнью сердца 130
5.4. Влияние липопротеидов (ЛПНП) на функцию тромбоцитов 133
5.5. Функциональная активность тромбоцитов крыс после лучевого воздействия 135
5.6. Оценка агрегации тромбоцитов у пациентов с искусственным сердечным клапаном 138
5.7. Оценка агрегации тромбоцитов у беременных пациенток 143
Обсуждение результатов 154
Выводы 177
Список литературы 179
- Мембранные рецепторы тромбоцитов
- Основные принципы применения техники малоуглового светорассеяния для цитологических исследований
- Оценка влияния пуриновых нуклеотидов на кинетические параметры активации и агрегации тромбоцитов
- Исследование функциональной активности тромбоцитов у больных ишемической болезнью сердца
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Тромбоциты представляют собой возбудимую популяцию форменных элементов крови, ответственную за процессы коагуляции, репарации сосудистой стенки, депонирование и транспорт БАВ, осуществление иммунных реакций организма (Siess W. 1989). Полифункциональность этих клеток обусловлена множественностью различных типов рецепторов на мембране и разнообразию сценариев трансдукции внутриклеточного сигнала. Выявлено более 20 участков связывания БАВ различной химической природы (пуринов, катехоламинов, производных триптофана, простагландинов, пептидов и проч.) (Brass L.F. 1993, Da Prada М. 1988, Kerry R. 1985, Ralevic V. 1998, Siess W. 1989).
Функционирование тромбоцитов строится на сопряжении процессов в плазматической мембране, являющихся непосредственным ответом на раздражение, и внутриклеточных механизмов, обеспечивающих специфическую реакцию клеток. Эта связь осуществляется высокоразвитой системой внутриклеточной сигнализации, которая запускает или модулирует соответствующие реакции путем передачи сигнала от поверхностной мембраны к исполнительным механизмам (Албертс Б. 1994).
Достаточно большой спектр активных веществ, с соответствующим рецепторно-сопряженным внутрисигнальным трансдукционным механизмом, предполагает достаточно строгую и в то же время гибкую временную организацию процесса трансформации клетки, предназначенную обеспечить не только основную репарационную функцию тромбоцитов, но и возможность локализации процесса тромбообразования.
Тромбоциты являются уникальной клеткой, для которой показано наличие трех различных типов пуриновых Р2-рецепторов к одному агонисту -АДФ: Р2Х1-, Р2У1- и P2Y12 (др. названия Р2Т, P2Yac, P2YADp„ SP1999) -рецепторы (Woulfe D. 2001). Р2Х1 -рецепторы являются неспецифическими
6 катионными каналами, и активация этих рецепторов АДФ вызывает быстрый поток ионов кальция из среды. Лигандирование P2Y1-рецепторов, сопряженных с Gq-белками, приводит к активации фосфолипазы С, с последующей мобилизацией ионов кальция из внутриклеточных депо. При активации Р2У12-рецепторов, через Gi2-6emoi, угнетается адещшатциклаза. Методически довольно сложно установить специфичность связывания трех пуриновых рецепторов к одному агонисту непосредственно на одном объекте. Для установления фармшсологического профиля эти рецепторы были клонированы в другие клеточные линии (Takasaki J. 2001, Rettinger J. 2003). В этих работах установлено, что величина ЕС50 этих рецепторов ниже 100 нМ. Возможность активировать тромбоциты в этой концентрационной зоне находится в противоречии с общепринятыми концентрационными зонами (1-10 мкМ) тестирования этих клеток традиционным клиническим методом Борна. Это может быть связано с неадекватностью метода Борна, что предполагает разработку метода, в котором тестирование тромбоцитов проходит в более адекватных физиологических условиях. По крайне мере, по концентрации ионов кальция в тестируемой среде, т.к. низкая концентрация ионов кальция (около 30 mkM) в методе Борна не соответствует физиологической в крови (2-3 мМ). Метод Борна, основанный на регистрации агрегации клеток по пропусканию света (Born G.V.R.1963), до сих пор является основным клиническим методом тестирования тромбоцитов. Достоинствами метода являются простота и невысокие требования к аппаратурному обеспечению. Но при этом, метод является полуколичественным: трактовка получаемых результатов сводится к относительной оценке конечной амплитуды сигнала и, практически, не характеризует изменение чувствительности тромбоцитов к агонистам.
Кроме методической проблемы, теоретически более важной является проблема соотносительности начального лиганд-рецепторного звена взаимодействия и последующего сценария развития каскада внутриклеточных реакций, приводящих (в данном случае) к сборке интегриновых рецепторов
GPII/GPffl (аПЬ/рЗ). Изменение функциональной чувствительности тромбоцитов к индукторам агрегации должно зависеть, как от начального статуса внутриклеточной сигнальной системы, так и от развития реакций «обратного действия» (цАМФ-, цГМФ(ЫО)-системы).
Значительный прогресс, достигнутый в понимании внутриклеточных механизмов за последние десятилетия, позволяет целенаправленно оценивать временную организацию внутриклеточных процессов и, что очень важно, использовать тромбоциты в качестве фармакологической модели, позволяющей выявлять механизмы действия биологически-активных веществ, на ранней стадии разработки лекарственных препаратов.
Закономерна постановка вопроса, об изменении функциональной чувствительности тромбоцитов при различных патологиях. Нарушения тромбоцитарно-сосудистого гемостаза возникают при многих заболеваниях, таких распространённых, как ишемическая болезнь сердца, ишемия мозга, и т. д. В ряде случаев, изменение функциональной активности тромбоцитов к гормональному микроокружению, является определяющим звеном этой патологии гемостаза. Тромбоциты, являясь высоколабильными структурами, могут активироваться даже при небольших воздействиях, при этом повышается их чувствительность к различным стимулам. Очевидно, что такое гиперчувствительное состояние не может быть долговременным. Сохранение гиперчувствительности тромбоцитов, их последующая дегрануляция с высвобождением БАВ и вторичная активация клеток микроокружения создают угрозу возникновения не только локального, но и распространённого тромбоза. В этих клетках существуют механизмы, которые «выводят» их из гиперчувствительного статуса, с изменением порога чувствительности, отличным от нормального статуса этих клеток.
Большинство методик, характеризующих функциональную активность тромбоцитов, основаны на тестировании ответа тромбоцитов при воздействии рецептор-зависимых агонистов. В этом случае существенной характеристикой функциональной активности тромбоцитов является их чувствительность к
действию агониста. В медицине и биологии используют различные термины,
характеризующие данную способность: толерантность отражает привыкание
^ащахщю) биологической системы к длительному раздражению, и
Выбор и обоснование количественных параметров, хараісгеризующих агрегационные свойства тромбоцитов, разработка метода оценки функциональной активности тромбоцитов.
Оценка эффекгивности действия пуриновых нуклеотидов на Р2-рецепторы тромбоцитов.
Исследование механизма подавления блокаторами кальциевых каналов агрегации тромбоцитов.
Изучение влияния БАВ, изменяющих концентрацию циклических нуклеотидов, на кинетические параметры активации и агрегации тромбоцитов.
Изучение влияния БАВ и условий среды на функциональную активность тромбоцитов в условиях обращенного 3Na /Са -обмена.
Исследование механизма действия агониста к-огшатных рецепторов U50488 на тромбоциты.
Изучение условий перехода клеток в рефрактерное состояние.
Исследование влияния ишемии/реперфузии мозга на агрегационную активность тромбоцитов крыс.
Ю.Исследование агрегационной активности тромбоцитов у больных ишемической болезнью сердца, сопровождающейся гиперхолестеринемией.
П.Исследование влияния липопротеидов низкой плотности (ЛПЬШ) на тромбоциты крыс in vitro.
12. Исследование динамики изменений функциональной активности
тромбоцитов после общего однократного гамма-облучения в дозе ЗГр.
13.Исследование агрегационной активности іромбоцитов у пациентов с искусственным сердечным клапаном (ИКС).
14. Исследование агрегационной активности тромбоцитов у беременных
пациенток: исследование влияния окситоцина и простагландина F2ct
(энзапроста) на тромбоциты; исследование характера
гиперчувствительности тромбоцитов у беременных с гестозом.
Научная новизна работы.
Разработаны аппаратурные и методические основы применения техники малоуглового светорассеяния для исследования тромбоцитов. Разработана новая концепция лазерного анализатора микрочастиц для цитологических исследований.
Впервые изучен диапазон полумаксимальных эффективных концентраций пуринов на стадиях шстивации и агрегации тромбоцитов. Определена чувствительность трех типов пуриновых Р2-рецепторов к АДФ. Установлено, что АТФ является парциальным агонистом P2Y і-рецепторов тромбоцитов.
Показано, что катехоламины неконкурентно, а селективные адреномиметики конкурентно модулируют активацию тромбоцитов, индуцированную АДФ.
Установлено, что факторы, повышающие внутриклеточную концентрацию ионов Na+ (преинкубация клеток с уабаином или моненсиыом) увеличивают скорость обращенного Ыа7Са2+-обмена.
Установлено, что активированные тромбоциты в отсутствии дополнительного стимула переходят в рефрактерное состояние.
Разработан новый метод оценки агрегационной активности тромбоцитов, получены значения, количественно характеризующие чувствительность тромбоцитов к АДФ. Этим методом показано, что в норме активация тромбоцитов тестируется в области концентраций АДФ 5-50 нМ, а агрегация -при концентрации 60-180 нМ. Область этих концентраций АДФ является физиологической, что выгодно отличает выбранную методику от ранее используемых для оценки тромбоцитов, где диапазон действия АДФ - 5 и более микромоль. Стандартизация условий тестирования тромбоцитов позволила характеризовать исходное функциональное состояние тромбоцитов по чувствительности к действию агоннстов, оцениваемой величиной ЕС50. Была проведена оценка максимально возможной скорости агрегации (Umax), косвенно характеризующей интегриновое звено агрегации.
Показана вариабельность агрегационной чувствительности тромбоцитов к АДФ при патологических процессах на модели ишемия/реперфузия мозга крыс и у больных с ишемической болезнью сердца, сопровождающейся гиперхолестеринемией, установлено, что тромбоциты характеризуются толерантным состоянием, а у пациентов с искусственным сердечным клапаном и беременных женщин с угрозой прерывания беременности наблюдается гиперчувствительность тромбоцитов.
Впервые продемонстрирован фазовый характер восстановления агрегационной активности тромбоцитов крыс после общего однократного гамма-облучения в дозе 3 Гр в течение б месяцев. Получены новые данные об активации тромбоцитов крыс липопротеидами низкой плотности (ЛПНП) in vitro, изучен характер такого воздействия ЛПНП на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Проведена сравнительная оценка влияния энзапроста (простагландина F2a) и окситоцина на агрегационную активность тромбоцитов in vitro.
Научно-практическая значимость.
Совместно с НПФ «ЛЮМЭКС» разработан и начат серийный выпуск лазерного анализатора микрочастиц серии «ЛАСКА» предназначенного для цитологических исследований, в частности, для определения функциональной активности тромбоцитов.
Полученные результаты расширяют представления о механизмах изменения внутриклеточного Са2+ в тромбоцитах при их рецептор-зависимой аісгивации, а также в результате изменения ионного транспорта. Это позволяет выработать стратегию изучения действия БАВ на внутриклеточные сигнальные системы тромбоцитов.
Разработан метод исследования ЗМа+/Са2+-обмена в тромбоцитах, позволяющий оценивать пригодность клеток для изучения рецепторных механизмов.
Представленная модель развития рефрактерного состояния тромбоцитов дает возможность объективно оценивать полученные результаты и может использоваться при изучении механизмов патологических состояний.
Полученные в результате исследования новые данные расширяют представление об изменении функциональной активности тромбоцитов при патологических процессах: ишемической болезни сердца, ишемии мозга, лучевой болезни.
Результаты проведенных исследований существенно дополняют знания о патогенетическом значении изменений функциональной активности тромбоцитов в механизмах толерантности тромбоцитов при изучаемых патологических процессах.
'Обосновано новое направление в гемостазиологии, связанное с изучением механизмов изменения функциональной активности тромбоцитов толерантности. Результаты исследований механизмов толерантности могут быть использованы при разработке методов клинической оценки нарушений системы гемостаза, прогноза и профилактики, связанных с ними осложнений.
Результаты работы обосновывают целесообразность применения нового метода оценки агрегационной активности тромбоцитов в клинических и лабораторных исследованиях.
Полученные данные о толерантности тромбоцитов и механизмах ее возникновения и развития могут быть рекомендованы для внедрения в учебный процесс в курс патофизиологии при рассмотрении вопросов патологии сердечно-сосудистой системы, гемостаза, микроциркуляторных нарушений, нарушений клеточной рецепции, а также могут быть использованы в лекционных курсах в ВУЗах медико-биологического профиля.
Апробация работы.
Результаты диссертационной работы были представлены на 1(ХГ) Международном совещании по эволюционной физиологии (С.-Петербург, 1996). International Workshop «Laser in Medicine 97», Российской научно-
практической конференции "Патологическая боль" (Новосибирск, 1999), VI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1999); Международной конференции "Фармация в XXI веке: инновации и традиции" (С-Петербург, 1999); II Международной конференции по микроциркуляции и гемореологии (Ярославль-Москва, 1999), Втором Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2000), Научной конференции, посвященной 95-летию со дня рождения академика РАМН Ф.Г. Углова (Санкт Петербург, 1999), Второй международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2001), 8th Annual International Ain Shams Medical Students Congress. (Cairo, 2000), 5th Baltic Congress of Laboratoty Medicine (Vilnius, 2000), Международной конференции «Медико-биологические последствия чрезвычайных ситуации» (Санкт-Петербург, 2001), Щ International Scientific Conference «Economy, Logistic, and Ecology in Armed Forces» (Brno. 2003), Международной Конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003), Международной конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Сочи, 2003), 3 Российском конгрессе по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва 2004), Научно-практической конференции «Методы исследования регионального кровообращения и микроциркуляции в клинике» (С.Петербург, 2004), 8th International Symposium on Protection against Chemical and Biological Warfare Agents. Gothenburg, Sweden (2004), VII конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Новосибирск, 2004).
Мембранные рецепторы тромбоцитов
Функционирование тромбоцитов строится на сопряжении процессов в плазматической мембране, являющихся непосредственным ответом на раздражение, и внутриклеточных механизмов, обеспечивающих специфическую реакцию клеток. Эта связь осуществляется высокоразвитой системой внутриклеточной сигнализации, которая запускает или модулирует соответствующие реакции путем передачи сигнала от поверхностной мембраны к исполнительным механизмам (Албертс Б. 1994).
Подавляющее большинство БАВ действуют на клетку, не проникая внутрь, а связываясь на поверхности плазматической мембраны с рецепторами, сопряженными с системами внутриклеточной сигнализация (Авдонин П.В. 1994, Албертс Б. 1994, Костюк П.Г. 1986, 24, 25). Сравнение аминокислотной последовательности этих рецепторов показывает, что они могут быть сгруппированы в суперсемейство структурно родственных, но функционально различающихся белков (Авдонин П.В. 1994, Албертс Б. 1994, Геннис Р. 1997, Крутецкая З.И. 1992, Kenakin Т. 1996). Каждый из них представляет отдельную полипептидную цепь, состоящую из 400-600 аминокислотных остатков, в которой имеется 7 гидрофобных доменов. Данные участки образуют а-спирали, 7 раз пропшвающие плазматическую мембрану и разделенные крупными гидрофильными сегментами. N-конец молекулы рецептора расположен во внутриклеточном пространстве и имеет участки, по которым происходит N-гликозилирование. Предполагается, что углеводные остатки участвуют в прикреплении N-конца рецептора к мембране. На С-концевом фрагменте рецептора, обращенном внутрь клетки, имеется участки, которые могут подвергаться фосфорилированию протеинкиназами. Этот процесс играет решающую роль в десенсибилизации рецепторов. Индуцируемая лигандом десенсибилизация может рассматриваться в двух вариантах (Геннис Р. 1997).
Гомологичная десенсибилизация происходит тогда, когда ослабляется ответ на специфический агонист, но сохраняется ответ на агонисты, действующие через другие рецепторы. Она была описана для /?-адренергических рецепторов и включает фосфорилироваыие рецептора с помощью рецепторспецифичной киназьт. В результате происходит интернализация фосфорилированного рецептора путем эндоцитоза.
Гетерологическая десенсибилизация наблюдается в случае, когда применение одного агониста ослабляет ответ клетки на многочисленные агонисты, действующие через различные рецепторы. В основе гетерологической десенсибилизации лежит классическая регуляция по принципу обратной связи.
АТФ-рецепторы образуют семейство рецепторов Р2 типа. Это семейство, -в свою очередь, разделяется на два подсемейства "Р2Х" и "P2Y" рецепторов. Р2Х рецепторы представляют собой катионньте каналы, a P2Y рецепторы являются мембранными рецепторами, сопряжённые с G-белками (Ralevic, V.1998).. Показано, что тромбоциты экпрессируют три пурино-рецептора: Р2Х1, P2Y1 и P2Y12 (Wang L. 2003).
Р2Х1-рецептор (peifenmop-Kcmcm): Все Р2Х рецепторы являются катион-селективными каналами и почти полностью проницаемы для Na и К и значительно проницаемы для Са. На молекулярном уровне идентифицированы семь Р2Х-рецепторов (P2Xi-7) (Bumstock G. 1997). Эти рецепторы составляют семейство ионных каналов, которые характеризуются наличием двух трансмембранных доменов, внутриклеточной N- и С-терминалями и большой внеклеточной петлей (Newbolt А. 1998). Р2Х-рецепторы образуют как гомо- так и гетеромультимеры (Torres G. 1999) при ассоциации по крайней мере трех Р2Х-рецепторных субъединиц (Nicke А. 1998). В отличие от канонической пентамерной архитектуры членов суперсемейства никотиновых рецепторов, Р2Х1-рецептор образуется ассоциацией трех Р2Х-рецепторных субъединиц (Nicke A. 2003). Внеклеточные петли является сайтом связывания АТР. Положительно заряженные аминокислоты многих АТР-связывающих белков важны в координировании связывании АТР. Во внеклеточной петле Р2Х рецептора имеются семь консервативных остатков лизина, три консервативных остатка аргинина и одна позиция, где имеется либо аргинин, либо лизин. Таким образом, возможно, что консервативные положительно заряженные остатки могут вносить вклад при связывании отрицательно заряженных фосфатных групп АТР Р2Х-рецепторов. Так как АТР является отрицательно заряженной молекулой, положительно заряженная поверхность белка может притягивать отрицательно заряженные группы фосфата в направлении к сайту связывания рецептора. Небольшие изменения в силе могут быть учтены электростатическими эффектами, опосредованными изменениями в распределении поверхностного заряда на рецепторе или небольшими изменениями в конформации Р2Х1-рецептора (Burnstock G. 1997).
Активация Р2Хгрецептора приводит к быстрому (в течение 10 мс) потоку катионов (Na+, Са24) через плазматическую мембрану внутрь клетки (Mahaut-Smith М.Р.1992, MacKenzie А.В. 1996, Sage S.0.1997, Mahaut-Smith M.P. 2000). Р2Хі-рецептор тромбоцитов активируется под действием АДФ, АТФ, а,/?-метилАТФ, /?,у-метилАТФ (Ralevic V.1998). Катионы способны модулировать активность рецептора. Отмечено, что Mg2+ и Са2+ способны вызывать аллостерические изменения участков связывания, понижая тем самым их аффинность к АТФ (Нопоге Н. 1989, Li С, Peoples R.W. 1997). К селективным антагонистам Р2Хгрецепторов относятся PPADS, NF 023 и NF 279 (Ralevic V. 1998).
Так же как другие типы рецепторов-каналов, Р2Х-рецепторы могут находиться в трех состояниях: закрытое, открытое и десентизированное. При исследовании Р2Х-рецепторов обнаружили, что скорость десентизации каждого типа рецептора располагается по следующей схеме Р2Х1 = Р2ХЗ Р2ХЗ Р2Х2Ь Р2Х4 Р2Х2п Р2Х7. Причем структура С-терминальной 6-ти аминокислотной последовательности и ее электростатическая сила влияют на скорость десенситизации рецепторов (Т. Koshimizu 1999). Клонирование Р2Х1-рецептора (Rettinger J. 2003) и его исследования показали, что он десенситизируется агонистом (в данной работе АТФ) в концентрационной области 30-100нМ. Компьютерное моделирование этого рецептора показало, что в результате десенситизации аффинность рецептора оценивается около 700 нМ, в то время как истинная аффинность в 200 раз ниже. Интересна последующая работа Rettinger J. и Schmalzing G. (Rettinger J. 2004). Они клонировали химерный рецептор, субъеденица которого состоит из двух пептидных цепочек, каждая из которых представлена гидрофобным доменом из двух типов рецепторов Р2Х1 и Р2Х2. Причем домен, отвечающий за десенитизацию, взят из Р2Х2-рецептора (медленно десенитизирующийся рецептор). Для этого химерного рецептора определены для АТФ значение ЕС50=3.3 нМ, что в 200 и 7000 раз ниже значений определенных для рецепторов Р2Х1 и Р2Х2 соответственно.
Основные принципы применения техники малоуглового светорассеяния для цитологических исследований
Для цитологических исследований использование метод светорассеяния не является новым, десятки работ в самых различных областях исследования биологических структур продемонстрировали широкие возможности этого метода. Ярким примером является применение техники детектирования светорассеяния в проточных цитометрах. Но, несмотря на то, что через несколько лет исполнится столетие с момента публшсации Ми базовой теоретической работы по методу светорассеянию (теория Ми), и опубликована не одна сотня работ по развитию теории светорассеяния, до сих пор ощущается разрыв между достаточно разработанной теорией и методическим применением на практике. Не претендуя на всестороннее рассмотрение метода, мы попытаемся выделить несколько принципов (определений) важных для применения метода в цитологичесішх исследованиях. 1) Однократность рассеяния. Для корректной оценки результатов необходимо, чтобы проходящий через измерительную кювету свет, только один раз рассеивался на частице (клетке) и вторично не рассеивался на другой частице (многократное рассевание). Это достигается ограничением создаваемой концентрации частиц. Критерием однократности рассеяния является сохранение линейной зависимости между интенсивностью светорассеяния и концентрацией частиц (Ван де Хюлст Г., 1961). На рис.3 Л. показана зависимость интенсивности светорассеяния в разных углах от концентрации тромбоцитов. Видно, что это условие соблюдается при концентрациях клеток не выше 107кл/мл. Следует отметить, что значение концентрации, с которой возникает нелинейная пропорциональность тем ниже, чем меньше угол регистрации. Ограничение создаваемой концентрации клеток для соблюдения однократности рассевания зависит от их размера, - чем крупнее клетки, тем меньше этот порог концентрации. 2) Индикатриса рассеяния. Индикатриса, как зависимость интенсивности рассеянного света от угла, является одной из важнейших характеристик теории рассеяния. Теория однократного светорассеяния (теория Ми) описывает, характер индикатрисы для частиц (или ансамбля частиц) сферизованного вида Для некоторых частных случаев существуют приближенные уравнения (уравнения Релея-Ганса для частиц близких по размеру к длине волны света; уравнение дифракции Фраунгофера для частиц, превосходящих по размеру длину волны света). При используемой длине волны лазера (0.67 мкм) ішдикатриса светорассеяния частицами размером до 10 мкм удовлетворительно описываются приближением Релея-Ганса. Достаточно полно они представлены в монографиях: Шифрина К.С.(1951), Ван де Хюлста Г.(1961), Борена К. (1986). На рис.3.2 показаны зависимости логарифма интенсивности (In І) от угла рассеяния ф), рассчитанные по уравнению Релея-Ганса, для частиц диаметром d = 3 мкм, и частиц диаметром d = 6 мкм. Видно, что наблюдаются характерные для каждого диаметра дифракционные минимумы, напр. для частиц диаметром d = 3 мкм, дифракционньгй минимум находится около 14 градусов. В реальности дифракционную картину достаточно сложно получить и это, прежде всего, связано с тем, что клеточная суспензия не представлена частицами одного диаметра, а имеет близкий Гаусовскому типу характер распределения частиц по размерам. На рис.3.2. показаны зависимости логарифма интенсивности (In І) от угла рассеяния (р), рассчитанные по уравнению Релея-Ганса, для частиц диаметром d = 3 мкм (как приближенную модель тромбоцита), и частиц диаметром d = 6 мкм (приближение для агрегата образованного двумя частицами), с заданными Гаусовским характером распределения частиц по размерам. Абсолютные значения интенсивности света для 6 мкм частиц в 2 раза ниже, что обусловлено уменьшением концентрации частиц при образовании из мономеров димеров. Эти расчетные зависимости представлены для частиц с заданными функциями распределения частиц по размерам (показаны на рис.З), чт приводит к сглаживанию дифракционной картины. Приведенные расчетные характеристики позволяют предсказать динамику агрегационного ответа, в ближних углах (до 5 градусов) при агрегации интенсивность будет увеличиваться, тогда как в дальних углах (около 10 градусов) интенсивность сигнала будет снижаться, соответственно дезагрегационный процесс будет давать обратную картину. Приведенный пример показьшает всю важность понимания характера индикатрис при трансформации клеток, т.к. при одностороннем характере протекания процесса (агрегации, изменения объема клеток и пр.) в разных углах может наблюдаться разносторонний характер динамики изменения сигнала. 3) Геометрия оптической системы. Предьщущий пример демонстрирует важность геометрии оптической системы. Очевидно, что если регистрация интенсивности рассеяния будет проводиться широко апертурным фотодатчиком, захватывающим несколько градусов, то достаточно сложно будет интерпретировать полученные данные. Идеальной является оптическая схема, в которой, - а) источник света представлен колимированным лазером, с предельно узким параллельным пучком, перпендикулярно направленным к кювете; б) кювета сделана из оптического материала, с совпадающим коэффициентом преломления с дисперсионной средой, и имеет очень небольшой оптический путь; в) линейка фотодиодов (или матрица) представлена большим количеством фотоэлементов, с малым значением апертуры. Достаточно, близко этой схеме соответствуют современные лазерные анализаторы размеров частиц. 4) Перемешивающее устройство. Для получения адекватного распределение средней интенсивности излучения, рассеянного ансамблем микрочастиц, необходимо, чтобы в каждый момент времени сканирования дисперсная система была представительной и при обновлении сканируемого объема дисперсный состав не изменялся. В большинстве лазерных анализаторах частиц это достигается следующим образом: проба перемешивается в специальной камере пробоподготовки, чаще всего ультразвуком, и далее, сразу поступает в измерительную проточную ячейку. При этом соблюдается условие изокинетичности: все частицы должны перемещаться в одном фронте, не оседая и не проскальзывая. Данное устройство хорошо отработано и используется в лазерных анализаторах. Существенным недостатком данной конструкции является невозможность работать в кинетическом режиме. Очевидно, что требуется разработка специального перемешивающего устройство, позволяющего проводить достаточно быстрые кинетические исследования.
Оценка влияния пуриновых нуклеотидов на кинетические параметры активации и агрегации тромбоцитов
Внесение АДФ в кювету, содержащую суспензию тромбоцитов, сопровождается очень быстрым повышением интенсивности светорассеяния АІ(12) (рис.3.17). Этот скачок происходит в результате повышения уровня внутриклеточного кальция. Известно, что связывание АДФ с Р2Х1-рецепторами вызывает открытие кальциевых каналов на поверхности тромбоцитов, а взаимодействие с P2Y1-рецепторами сопровождается стимуляцией фосфоинозитидного обмена и высвобождением Са2+ из внутриклеточных депо. В итоге, это приводит к увеличению концентрации [Са2+], и сферизации тромбоцитов.
Для того чтобы оценить действие пуриновых нуклеотидов на каждый тип Р2-рецепторов и выяснить вклад этих участков связывания в развитие активации клеток, эксперименты проводили в среде с 1мМ СаС12 и в безкалыдиевой среде.
На рис.4 Л а приведена запись эксперимента, в котором активацию тромбоцитов крысы индуцировали последовательным добавлением (титрованием) АДФ. В присутствии кальция, сферизация наблюдается при внесении 5 нМ АДФ. С дальнейшим увеличением концентрации АДФ интенсивность светорассеяния - д1(12) вначале нарастает (при этом отмечается уменьшение амплитуды шума), достигает максимума, а затем инвертируется. Прирост амплитуды сигнала составил 55,8 ± 4,7 %. Обращение сигнала в угле 12 градусов совпадает с нарастанием интенсивности светорассеяния в угле 2 градуса, что свидетельствует о развитии агрегации. На рис.4.16 приведен график зависимости интенсивности светорассеяния тромбоцитов от полумаксимальной эффективной концентрации АДФ в обратных координатах.
Были проведены эксперименты, в которых активацию тромбоцитов регистрировали в ответ на однократное внесение агониста в возрастающих концентрациях. Значение ECso, определенное в этих опытах, не существенно отличалось от значения ЕС5о АДФ, полученного при титровании.
Известно, что АТФ, связываясь с Р2Х1 -рецепторами, вызывает поток кальция внутрь тромбоцитов. Действительно, внесение этого пуринового нуклеотида в возрастающих концентрациях в калыгийсодержаптую среду с клетками также приводило к увеличению интенсивности светорассеяния. В отличие от АДФ, кинетика активации тромбоцитов под действием АТФ имела сигмоидальный характер (рис.4.2), более выраженный на тромбоцитах крысы. АТФ, в суммарной концентрации, не превышающей 150 нМ, вызывал незначительную активацию тромбоцитов - ДІ(12) увеличилась на 7,8 ± 2,4 %. Дальнейшее повышение концентрации агониста сопровождалось относительно быстрым ростом интенсивности светорассеяния. Максимальный прирост амплитуды сигнала составил 25,4 ± 4,3%. Кроме того, в противоположность АДФ, после достижения предельного значения д1(12) последующего обращения сигнала (агрегации) не наблюдалось.
Наблюдаемое различие в кинетике активации тромбоцитов в ответ на внесение АДФ и АТФ может быть обусловлено особенностями лиганд-рецепторного взаимодействия. Для выяснения данного вопроса, с помощью преобразования Скэтчарда, был проведен анализ параметров рецепторного связывания АДФ и АТФ. На рис.4.3 представлены экспериментальные данные, описывающие связывание этих веществ на поверхности тромбоцитов. Видно, что кривые связывания пуриновых нуклеотидов неодинаковы. Изотерма насыщения АДФ имеет линейный характер (рис.4.3а), а кривая связывания АТФ характеризуется изломом (рис.4.3б) и представляет собой вогнутую параболу. Такой вид изотермы насыщения предполагает, что действие АТФ опосредуется высоко- и низкоаффинным участками связывания. Значения ECSQ АДФ и АТФ, полученные в опытах на тромбоцитах крысы и кролика, представлены в табл. 4.1. В условиях малоуглового светорассеяния также исследовано действие селективного агониста Р2Хгрецепторов L-Ду-метилАТФ на функциональную активность тромбоцитов крысы. Полученные данные свидетельствуют о том, что это соединение, также как и АТФ, способно активировать тромбоциты, не вызывая агрегации. Максимальный прирост интенсивности светорассеяния составил 10,2 ± 3,6 %. Значение ECso приведено в табл.2. Следует заметить, что активация тромбоцитов, развивающаяся в среде с 1 мМ СаСЬ, является результатом поступления Са2+ в цитоплазму не только снаружи, но и из внутриклеточного депо. Процесс сферизации, в данных условиях, обусловлен связыванием пуриновых нуклеотидов как с Р2Хі - , так и с P2Yi - рецепторами. Непосредственно оценить действие пуринов на P2Y] -рецепторы и фосфоинозитидный обмен можно в условиях, исключающих наружный кальциевый ток. Поэтому эксперименты проводили в среде, содержащей 5 мМ ЭДТА. Сравнение полученных значений ЕС5о позволяет оценить вклад каждого типа рецепторов в развитие активации клеток. Также как и в среде, содержащей 1 мМ СаСЬ, в безкалъциевой среде внесение 5 нМ АДФ приводило к нарастанию интенсивности светорассеяния. Последующее ступенчатое повышение концентрации АДФ сопровождалось дальнейшим увеличением этого показателя. Однако кальциевый ответ тромбоцитов изменился — амплитуда прироста сигнала в угле 12 градусов уменьшилась, и ее максимальное значение составило 34,3 ±6,1 %. Величина ЕС50, полученная в этих условиях, представлено в табл.2.
Исследование функциональной активности тромбоцитов у больных ишемической болезнью сердца
Изменение функциональной активности тромбоцитов играет важную роль в патогенезе ишемических и постишемических расстройств микроциркулядии. Известно, что у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) функциональная активность тромбоцитов повышена (Гавриш А.С. 1993), особенно при наличии гиперхолестеринемии (Михайлова И.А. и соавт. 1993). Аналогичные данные были получены при исследовании крови больных с ишемическими инсультами (Шутов А.А. и соавт. 1991). Изолированная гипехолестеринемия также сопровождается увеличением агрегационной активности тромбоцитов (Braijersun A. et al., 1998).
Наблюдаются значительные изменения морфофункционального состояния тромбоцитов и их поверхностных свойств при ИБС. По данным Шитиковой А.С. и соавторов, (1997 г) при ИБС увеличивается количество активированных форм тромбоцитов в 2,8 раза и в 1,6 раза увеличивается число тромбоцитов, вовлеченных в агрегаты. Было показано, что наблюдается активация фибриногенновых рецепторов (гликопротеиновый ПЬ/Ша комплекс), приводящее к увеличению адгезионных свойств тромбоцитов и последующему их депонированию (Neumann F.J. et al., 1998). С другой стороны, если в ранних работах было отмечена корреляция между агрегационной активностью тромбоцитов и ИБС (Elwood PC et al, 1991) то в более поздних работах такой корреляции не отмечается (Meade T.W. et al.,1997).
Совместно с кафедрой факультетской терапии (зав. кафедрой, профессор Е.В. Шляхто) была обследована группа больных мужского пола (13 человек), страдающих ИБС (стенокардией напряжения I и II функционального класса) и перенесших 1 или более инфарктов миокарда в возрасте до 45 лет (срок от последнего инфаркта миокарда не менее 1 года). Контрольную группу составили 7 здоровых людей. Как для контрольной группы, так и для больных были сделаны анализы общего холестерина (ОХ), триглицеридов (ТГ) содержания липопротеидов высокой (ХСЛПВП), низкой (ХСІШШЇ) и промежуточной плотности (ХСЛПОНП).
У контрольной іруппьі исітьгтуемьтх были получены следующие значения: концентрация тромбоцитов N= 240 000 ± 25 000 кл/л, ЕС50 =160 + 36 нМ, UMAX = 47.6 ± 12.8, ОХ= 162 ± 37, ТГ= 206 ± 112, ХСЛПВП = 46.4 ± 7.0, ХСЛПНП= 74.7 ± 31.6 и ХСЛПОНП- 41.3 ± 22.5.
В группе больных средние значения следующие: N= 212 000 ± 57 000 кл/л, ЕС50 = 413 ± 294 нМ (р 0.05), UMAX = 55.4 ± 16.0, ОХ= 227 ± 37, ТГ= 506 ± 362, ХСЛПВП = 28.0 + 14.1, ХСЛПНП= 109+ 41 и ХСЛПОНП= 101 ± 72.
На рис.5.3.а представлены данные по зависимости нормированной начальной скорости агрегации от концентрации АДФ для здорового испытуемого (контроль) и для больного ишемической болезнью сердца (ИБС). По величине UMAX ОПЫТ и контроль дают близкие значения. По всей видимости, количество фибриногеновых рецепторов на поверхности тромбоцитов у больных близко к норме. Иная картина наблюдается по отношению к чувствительности к АДФ (ЕС5о). Для представленного больног (рис.5.3.б) эта величина повышена более чем в 6 раз, т. е. имеется выраженная толерантность.
Если по концентрации тромбоцитов и по величине UMAX средние значения и величина разброса у больных ИБС близки к контрольной группе, то достоверно получено увеличение величины ЕС5о (снижение чувствительности к АДФ). Как и в экспериментах по ишемии/реперфузии мозга крыс, можно отметить, что в каждом образце достаточно хорошо сохраняется зависимость представленная уравнением (1), но наблюдается достаточно высокий разброс в значениях концентрации АДФ, необходимой для достижения половины максимального эффекта агрегации (ЕС5о). Анализ этого показателя следующий: у 3 пациентов - значения ЕС5о близки к значениям контрольной группы (гиперхолестеринемии не наблюдается), у 4-х - значения ЕС5о лежат в предела 600-1000 нМ. Для этой группы характерно наличие гиперхолестеринемии.
Таким образом, результаты полученных данных свидетельствуют о снижении чувствительности тромбоцитов к АДФ у пациентов с ИБС, сопровождающейся гипехолестеринемией, что свидетельствует о переходе тромбоцитов в толерантное состояние вследствие их постоянной активации. По нашему мнению это является компенсаторным механизмом, возншсающим в ответ на постоянную стимуляцию тромбоцитов.
Рядом авторов, в частности Бочковым с сотр. (1994, 1995), показано гормоноподобное действие ЛПНП на тромбоциты. Было установлено, что ЛПНП вызывают повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция, активируя фосфоинозитольный цикл и открывая кальциевые каналы. Причем, как «классические» апо В,Е-рецепторы, так и интегриновые рецепторы (гликопротеид ПЬ/Ша), не участвуют в реализации эффектов ЛПНП на метаболизм цитоплазматического кальция. В процитированных работах, полумаксимальное насыщение мест связывания и полумаксимальная активация систем вторичных посредников в тромбоцитах близки и достигаются при концентрации ЛПНП порядка 10мкг/мл (насыщающая концентрация около 50-60 мкг/мл). (Бочков В.Н. 1994,1995, Wang J.S. 2000).
